全 文 ：农药学学报 2015，17(3) :257 － 266
Chinese Journal of Pesticide Science http:/ /www ． nyxxb． com． cn
收稿日期:2014-12-04;录用日期:2015-03-06．
作者简介:马坤，男，硕士研究生，E-mail:mkdfwy@ 163． com;* 赵春田，男，通信作者(Author for correspondence) ，博士，讲师，主要从事应
用微生物学研究，E-mail:zct2008@ yahoo． com
基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y2111182);浙江工业大学自然科学基金项目(1001105016408) ;浙江省生物工程重中之重学科开放
基金项目(20130103)．
·研究论文· DOI:10. 3969 / j． issn． 1008-7303. 2015. 03. 02
植物油对刺糖多孢菌生长及其合成
多杀菌素能力的影响
马 坤， 裘娟萍， 赵春田*
(浙江工业大学 生物与环境工程学院，杭州 310014)
摘 要:为研究不同种类植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响，探索提高多杀菌
素产量的方法，在发酵培养基中分别添加葵花油、花生油、大豆油、芝麻油、橄榄油和菜籽油，研究了
其对菌体生长、脂肪酶活性和多杀菌素产量的影响，并利用 ＲT-PCＲ对脂肪酶基因及多杀菌素合成
相关基因的转录水平进行分析。结果表明:6 种供试植物油对菌体生长和多杀菌素产量的影响程
度不同，依次为菜籽油 ＞橄榄油 ＞花生油 ＞芝麻油 ＞葵花油 ＞大豆油，其中菜籽油有利于诱导脂肪
酶的表达、延缓菌体的衰亡和延长产素期，脂肪酶活力、菌体生物量和多杀菌素产量分别提高
310. 09%、8. 97%和 33. 94%;脂肪酶基因和多杀菌素合成基因的转录强度也有明显提高。因此，
菜籽油是其最佳的辅助性脂类碳源。
关键词:刺糖多孢菌;多杀菌素;植物油;脂肪酶;荧光定量 PCＲ;转录
中图分类号:S482. 28 文献标志码:A 文章编号:1008-7303(2015)03-0257-10
Effect of vegetable oils on the growth and spinosad biosynthetic
potency of Saccharopolyspora spinosa
Ma Kun， Qiu Juanping， Zhao Chuntian*
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)
Abstract:In order to investigate the influence of vegetable oils on the growth and spinosad
biosynthetic potency of Saccharopolyspora spinosa and explore new methods to improve the yield of
spinosad，six kinds of vegetable oils，including sunflower oil，peanut oil，soybean oil，sesame oil，
olive oil and rapeseed oil were screened． To study their influence on the growth，the lipase activity and
the spinosad synthetic potency of S． spinosa，different vegetable oils were added to the fermentation
medium as partial carbon sources，respectively． In addition，the temporal transcriptional profiles of the
lipase gene and some selected genes in the spinosad biosynthetic pathway were examined by ＲT-PCＲ．
The results indicated that the effects of different vegetable oils on the growth of S． spinosa and the
production of spinosad varied significantly，which were that rapeseed oil ＞ olive oil ＞ peanut oil ＞
sesame oil ＞ sunflower oil ＞ soybean oil． The rapeseed oil was conducive to the induction of lipase
expression，the delay of the decline phase of S． spinosa and the extension of the spinosad synthetic
258 农 药 学 学 报 Vol． 17
period． And the lipase activity，the biomass and the yield of spinosad were improved by 310. 09%，
8. 97% and 33. 94%，respectively． The transcriptional intensity of lipase gene and spinosad synthetic
genes were also promoted． Thus the rapeseed oil was the optimal candidate of auxiliary carbon sources
among the selected vegetable oils．
Keywords:Saccharopolyspora spinosa;spinosad;vegetable oils;lipase;ＲT-PCＲ;transcription
多杀菌素(spinosad)系刺糖多孢菌 Saccharopo-
lyspora spinosa发酵产生的新型大环内酯类农用抗
生素，具有触杀及胃毒作用［1–2］，能以光解方式快速
降解［3］，且兼具生物农药的安全性和化学农药的速
效性［4］。目前，多杀菌素衍生物已达数百种［5–6］，国
外已用于防治农作物病虫害［7–8］、蚊蝇［9–10］及仓储
病虫害等［11–12］;而我国对多杀菌素的研究仍处于实
验室阶段，尚未工业化。
多杀菌素的生物合成源于聚酮链的延伸，起始
单元丙酰基团在聚酮合酶的作用下按照 A-A-P-A-
A-A-A-A-A-A(A:乙酰基，P:丙酰基)的顺序逐步
缩合，整个过程由位于 10 个组装模件上的酶系催化
完成，经硫酯酶环化，并依次在 21 元环的 C9 位、
C17位连接鼠李糖和福乐糖胺基团
［2，13］。由此可知，
在多杀菌素快速合成期，需要大量的酰基前体，它们
主要来源于碳源代谢的中间产物。因此，供试碳源
的分解特性对多杀菌素的合成至关重要。葡萄糖是
抗生素产生菌较好的碳源和能源，但其分解阻遏作用
会抑制多种抗生素的合成，甚至使产素过程逆转［14］。
植物油是一种疏水性物质，在水中的溶解度很小，可
以减弱阻遏效应，且其降解产物为短链脂肪酸，可作
为抗生素合成的前体［15］。此外，植物油有利于抗生
素与菌体的分离，降低次级代谢产物对细胞的毒害作
用［16］。因此，植物油是一种有效的非干扰性碳源，常
用作大环内酯类抗生素合成的辅助性碳源。目前已
有利用植物油促进放线菌次级代谢的报道，例如头孢
菌素和红霉素等［16–17］，但有关植物油对刺糖多孢菌
生长和多杀菌素产量的影响未见报道。笔者研究了
植物油种类对多杀菌素发酵过程中 pH值、脂肪酶活
力、残糖和油脂利用等参数的影响，以及其代谢调节
对脂肪酶基因(lip)和多杀菌素合成相关基因(gtt、
gdh、epi、kre、SpnA、SpnF、SpnG、SpnP)转录水平的影
响，以期筛选出最佳的辅助性脂类碳源，为进一步提
高多杀菌素的产量提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 仪器与试剂
SpectraMax M5 酶标仪(美国 Molecular Devices
公司);LC-20AD 岛津高效液相色谱仪(日本岛津公
司) ;ND500 型超微量紫外可见分光光度计(Bio
Take公司) ;CFX96 connect 型荧光定量 PCＲ 仪器
(美国 BIO-ＲAD 公司)。
葵花油和大豆油(中粮集团有限公司) ;菜籽油
(山东鲁花集团有限公司) ;橄榄油(上海嘉里食品
工业有限公司) ;芝麻油(含山县韶关鹰皇油脂有限
公司) ;花生油(山东省临沂市花生种植合作社) ;对
硝基苯酚棕榈酸酯(Sigma公司) ;2. 5%多杀菌素悬
浮剂(spinosad 25 SC，商品名称为菜喜，美国陶氏益
农公司) ;ＲNAiso Plus 试剂、PrimeScript ＲT Master
Mix 逆转录酶及 SYBＲ Premix Ex TapⅡ(TaKaＲa
公司) ;其他试剂均为分析纯或色谱纯。
1. 2 供试菌株及其培养
1. 2. 1 菌株来源及培养基 刺糖多孢菌 S． spinosa
由浙江工业大学微生物研究所保藏。供试培养基包
括固体、种子和发酵培养基 3 种:
1)斜面及固体培养基(g /L) :葡萄糖 9. 0，酵母
膏 3. 0，玉米浆 10. 0，MgSO4·7H2O 0. 2，琼脂 20. 0，
pH 7. 5。
2)一级和二级种子培养基(g /L) :葡萄糖
10. 0，蛋白胨 4. 0，酵母粉 4. 0，MgSO4·7H2O 0. 5，
KH2PO4 2. 0，K2HPO4·3H2O 4. 0，pH 8. 0。
3)发酵培养基(g /L) :葡萄糖 55. 0，玉米粉
8. 0，蛋白胨 7. 5，酵母膏 10. 0，MgSO4·7H2O 0. 5，
棉籽饼粉 30. 0，植物油 25. 0(对照组除外) ，pH
8. 0。
上述 3 种培养基分别用于刺糖多孢菌的斜面菌
种培养、种子液培养和发酵液培养，灭菌条件均为
115 ℃、30 min。
1. 2. 2 菌株培养
种子培养:将刺糖多孢菌斜面菌种接入装液
量为50 mL /250 mL 的一级种子培养基中，于
200 r /min、30 ℃条件下培养 48 h，即为一级种子液;
取一级种子液以体积分数 10%的接种量转入装液
量为 100 mL /500 mL 的二级种子培养基中，相同条
件下培养 24 h，即为二级种子液。
发酵培养:将二级种子液以体积分数 10%的接
No． 3 马 坤等:植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响 259
种量转入装液量为 30 mL /250 mL 的发酵培养基
中，于 200 r /min、30 ℃条件下培养 9 d。期间每隔
24 h 取样测定其 pH 值、还原糖、生物量、脂肪酶活
力、植物油含量(对照组除外)、多杀菌素效价等理
化参数。
1. 3 试验设计及测定项目
试验设葵花油、花生油、大豆油、芝麻油、橄榄油
和菜籽油 6 个处理，以不添加植物油为对照。每个
处理重复 3 次，各组取样后立即测定相应的理化参
数:pH 值测定采用 PB-10 pH 计;还原糖测定采用
3，5-二硝基水杨酸法(DNS 法)［18］;生物量测定采
用干重法［19］;脂肪酶活力的测定采用对硝基苯酚
法［20–21］，在 pH 8. 0、37 ℃条件下，以每分钟释放
1 μmol 对硝基苯酚(p-NP)所需的酶量定义为 1 个
酶活单位;残油的测定采用铜皂法［22］;多杀菌素效
价测定采用 HPLC 方法［19］。
表 1 内参基因及待测基因的引物序列
Table 1 The primer sequences of reference genes and target genes
引物名称
Primers
引物序列(5→3)
Primer Sequence(5→3)
产物长度
Product length /bp
GenBank登录号
Accession number
菌株来源
Source
SigA-F
SigA-Ｒ
GGTGTTCCAGTCCACCGAAT
GACCTCACGCAGGAAACGTA
168 AM420293 S． erythraea NＲＲL2338
lip-F
lip-Ｒ
CGATCAAGAACGTCTCCGGT
AAGTCGAGGCTCTGGTCGAT
119 JF795581 S． spinosa xsp01103
SpnA-F
SpnA-Ｒ
CGAAGCCGGGAACCTGATAG
CAGAAGGAAGCCGGGTCAG
75 AY007564 S． spinosa NＲＲL18395
SpnF-F
SpnF-Ｒ
GCGATCGTGTCGATGGGATG
CAGATTCCAGCCACGGTCTT
127 AY007564 S． spinosa NＲＲL18395
SpnP-F
SpnP-Ｒ
CGACGAAGTACGGGAGATGG
TCACTGAACACGACTCCAGC
92 AY007564 S． spinosa NＲＲL18395
SpnG-F
SpnG-Ｒ
GGTCGAAGTACTGGGGAAGC
TCAACCTGTTCCTGCGTACC
114 AY007564 S． spinosa NＲＲL18395
gtt-F
gtt-Ｒ
TTGTCCATCGTGGAGAAGCC
CACCACGTCGTTGTCGTAGA
81 AF355467 S． spinosa NＲＲL18395
gdh-F
gdh-Ｒ
GAGCCGAATTCCCCGTACTC
ACCTTCTCCGGGAACTGGTA
137 AF355468 S． spinosa NＲＲL18395
epi-F
epi-Ｒ
GGCTCGCATGACCCATATCA
ATGCACCCGTGATGTCAAGT
103 AF355466 S． spinosa NＲＲL18395
kre-F
kre-Ｒ
GCGGCAAGAACTTCCTGAAA
TGATCGTCCACAACGGACAG
73 AF355468 S． spinosa NＲＲL18395
1. 4 刺糖多孢菌 ＲNA 的制备及 ＲT-PCＲ 分析
选取大豆油、菜籽油试验组和对照组发酵培养
3 ～ 7 d 的样品用于 ＲNA 的制备及 ＲT-PCＲ 分析。
提取的 ＲNA 样品经反转录后获得 cDNA，用于脂肪
酶基因 lip、糖基侧链合成基因(gtt、gdh、epi、kre)、聚
酮链合成及交联基因(SpnA、SpnF)、鼠李糖转移酶
基因(SpnG)和福乐糖胺转移酶基因(SpnP)在相应
检测区间内转录强度的分析。
1. 4. 1 刺糖多孢菌 ＲNA 的制备 取 1 mL 上述发
酵液样品于 Ep管中，于 1 000 × g、4 ℃条件下离心
10 min，收集菌体，加入 l mL ＲNAiso Plus，振荡混
匀，静置 5 min;于 12 000 × g、4 ℃ 条件下离心
5 min，取上清液，加入 0. 2 mL 氯仿，漩涡振荡 15 s，
静置5 min;于 12 000 × g、4 ℃条件下离心 15 min，
取 0. 3 mL 上清液，加入等量的异丙醇，混匀后静置
10 min;于 12 000 × g、4 ℃条件下离心 10 min，弃上
清液，沉淀用 1 mL 75%乙醇洗涤后，于 7 500 × g、
4 ℃条件下离心 5 min，弃上清液;室温干燥沉淀，加
入 30 μL ＲNase-Free dH2O 溶解沉淀，待 ＲT-PCＲ
分析。
1. 4. 2 反转录及荧光定量 PCＲ 分析 准确量取
500 ng 的 ＲNA 样品用于 cDNA 单链的反转录，按
反转录试剂盒说明书(PrimeScriptTMＲT Master Mix，
TaKaＲa Code:ＲＲ036A)合成 cDNA。反转录体系
为:5 × Prime Script ＲT Master Mix 2 μL，ＲNase Free
dH2O 5 μL，ＲNA 样品 500 ng，ＲNase Free dH2O
3-500 /c。其中，c(ng /μL)为 ＲNA 样品的质量浓度。
根据内参基因和待测基因的 DNA 序列，利用
NCBI的 Pick Primers设计引物(表 1)。按照荧光定
量 PCＲ 使用说明书(SYBＲ Premix Ex TapTMⅡ，
TaKaＲa Code:ＲＲ820A)完成相应模板、引物和试剂
的添加。荧光定量 PCＲ 反应体系为:SYBＲ Premix
260 农 药 学 学 报 Vol． 17
Ex TapⅡ 5 μL，PCＲ Forward Primer 0. 2 μL，PCＲ
Ｒeverse Primer 0. 2 μL，cDNA 样品 1 μL，ＲNase
Free dH2O 3. 6 μL。PCＲ 反应程序为:95 ℃ 30 s;
95 ℃变性 5 s;60 ℃、30 s 退火和延伸，循环 40 次。
结果用 2 － △△ Ct法分析，内参基因选用刺糖多孢菌主
要 Sigma因子 SigA。
1. 5 数据处理
利用 Excel和 Statview 统计分析软件对试验数
据均值和差异显著性进行分析，其中，* 表示差异显
著，P ＜ 0. 05;＊＊表示差异极显著，P ＜ 0. 01;数据处
理后用 Oringin 8. 0 绘图。
* 表示差异显著(P ＜ 0． 05) ;＊＊表示差异极显著(P ＜ 0． 01)。* and ＊＊ reprsent significant difference at 0． 05 and 0． 01 level，respectively．
图 1 植物油种类对菌体生物量(A)及多杀菌素相对效价(B)的影响
Fig． 1 Influence of vegetable oils on the biomass of S． spinosa (A)and the relative titer of spinosad(B)
1. 5. 1 多杀菌素相对效价的计算 根据公式(1)
和(2)计算发酵样品中多杀菌素的效价和相对
效价。
Y =(A － 27 042． 73)12 369． 20 × B (1)
(1)式中:Y为发酵液样品的效价，mg /L;A 为
样品峰面积，mV·min;B 为样品稀释倍数，
27 042. 73和 12 369. 20 分别代表多杀菌素标准曲线
y轴截距和 x 轴斜率［19］(此标准曲线由本实验室以
2. 5% 的多杀菌素悬浮剂为标样制作而成)。
YＲ /% =
Yt
YEC
× 100 (2)
(2)式中:Yt为 t时刻各取样点发酵液样品的效
价，mg /L;YEC为对照组发酵终点时的效价，mg /L;
YＲ为样品中多杀菌素的相对效价，%。
1. 5. 2 单位菌体酶活含量的计算 根据公式(3)
计算单位菌体酶活含量 EP(U /mg) ，用于表征植物
油对脂肪酶诱导效果及合成能力的影响。
EP =
Et
Bt
(3)
(3)式中:Et为 t 时刻样品中脂肪酶酶活，
U /mL;Bt为 t时刻菌体生物量，mg /mL。
1. 5. 3 单位菌体多杀菌素相对含量的计算 根据
公式(4)和(5)计算单位菌体多杀菌素相对含量 YPＲ
(%) ，用于表征植物油对刺糖多孢菌多杀菌素合成
能力的影响。
YP =
YE
Bmax
(4)
(4)式中:YE为发酵终点时各组样品的效价，
mg /L;Bmax为菌体生物量峰值，g /L;YP为各组发酵
终点时的效价 YE与菌体生物量峰值 Bmax的比值，
mg /g。
YPＲ /% =
YPO
YPC
× 100 (5)
(5)式中:YPO为含油试验组发酵终点时的效价
与相应菌体生物量峰值的比值，mg /g。YPC为对照
组发酵终点时的效价与菌体生物量峰值的比值，
mg /g。YPＲ为单位菌体多杀菌素相对含量，%。
2 结果及分析
2. 1 植物油种类对菌体生长及多杀菌素合成的影响
2. 1. 1 对菌体生物量及产素能力的影响 由图 1A
可见:各处理在 1 ～ 5 d 内生长趋势相似，均在第 5
天时菌体量达到最高值。其中，大豆油、葵花油、芝
麻油和花生油试验组的生长延迟现象较明显，生物
No． 3 马 坤等:植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响 261
量相对较低，菌体自溶较早，且大豆油在发酵后期对
菌体生长的抑制作用十分显著，菌体量最低，细胞在
次级代谢初期已开始裂解。而菜籽油和橄榄油能够
促进菌体的生长，在多杀菌素快速合成期仍保持较
高的菌体活力。
从图 1B 可知:不同种类植物油对多杀菌素产
量的影响不同，依次为菜籽油 ＞橄榄油 ＞花生油 ＞
芝麻油 ＞葵花油 ＞大豆油。其中，菜籽油和橄榄油
试验组多杀菌素的合成速率均高于其他组，并在菌
体衰亡的初期仍持续合成，直至衰亡后期多杀菌素
产量才趋于平稳。
2. 1. 2 对单位菌体多杀菌素相对含量的影响 因
为多杀菌素是胞内产物，比较生长曲线和多杀菌素
合成曲线(图 1)可知:刺糖多孢菌的生物量与多杀
菌素产量具有一定的正相关性。由图 2 可知，菜籽
油试验组中菌体合成多杀菌素的能力最强，大豆油
组最差，说明菜籽油不仅有利于菌体的初级代谢，也
可以调节次级代谢，促进多杀菌素的高效合成。
* 表示差异显著(P ＜ 0． 05) ;＊＊表示差异极显著(P ＜ 0． 01)。* and ＊＊ reprsent significant difference at 0． 05 and 0． 01 level，respectively．
图 3 植物油种类对多杀菌素发酵过程中 pH 值(A)和还原糖(B)变化的影响
Fig． 3 Influence of vegetable oils on pH(A)and reducing sugar(B)during spinosad fermentation
2. 2 植物油种类对多杀菌素发酵过程中 pH 值和
还原糖变化的影响
pH值是菌体代谢活动的表征，对抗生素的合成
起关键的调控作用［23］。由图 3 A 可见:在发酵 1 ～
2 d 内，刺糖多孢菌快速分解氮源，pH 值迅速上升;
在 2 ～ 5 d 由于碳源的快速消耗，pH值呈下降趋势;
发酵 5 d以后，不同植物油引起的 pH值差异性逐渐
显现，其中大豆油组的 pH 值显著升高，而橄榄油和
菜籽油组的 pH值仍维持在多杀菌素合成较适的范
围内。从图 3B 可知:在发酵 1 ～ 5 d内，菌体快速生
* 表示差异显著(P ＜ 0． 05) ;＊＊表示差异极显著(P ＜ 0． 01)。
* and ＊＊ reprsent significant difference at 0． 05 and
0． 01 level，respectively．
图 2 植物油种类对单位菌体多杀菌素相对含量的影响
Fig． 2 Influence of vegetable oils on the relative spinosad
concentration per unit biomass
长繁殖，各组对糖的利用趋势相似;随后多杀菌素快
速合成，还原糖的利用出现明显差异:菜籽油和橄榄
油能够促进刺糖多孢菌对糖的利用，保持较高的消
耗速率，其残糖浓度介于对照组和其他试验组间，大
豆油组的残糖浓度最高。
2. 3 植物油种类对菌体脂肪酶活力及油脂利用能
力的影响
2. 3. 1 对菌体脂肪酶活力的影响 刺糖多孢菌对
植物油的利用能力除受碳源影响外，还受脂肪酶活
力的影响。由图 4A 可见:在整个发酵过程中，各处
理组脂肪酶活性均呈先升后降的变化趋势，但各组
262 农 药 学 学 报 Vol． 17
* 表示差异显著(P ＜ 0． 05);＊＊表示差异极显著(P ＜ 0． 01)。* and ＊＊ reprsent significant difference at 0． 05 and 0． 01 level，respectively．
图 4 植物油种类对多杀菌素发酵过程中脂肪酶活性的影响
Fig． 4 Influence of vegetable oils on lipase activity during spinosad fermentation
酶活性最大值及持续时间有明显差别。其中，菜籽
油组的脂肪酶活力最高，持续时间最长，而大豆油组
最低。多杀菌素自第 5 天时开始快速合成，因此计
算此时单位菌体脂肪酶含量(图 4B)。由图 4B 可
知，菜籽油不仅通过增加菌体量来提高酶活性，而且
作为刺糖多孢菌脂肪酶的较适诱导物，进一步提高
了单位菌体的产酶量或酶活性。
2. 3. 2 刺糖多孢菌对不同种类植物油的消耗曲线
结果如图 5 所示。在菌体生长的 1 ～ 2 d 内，各处
理组中植物油几乎不被利用，进入对数生长期才逐
渐被分解利用，至发酵中后期，因各组脂肪酶活力的
差异增大，油脂的消耗曲线呈不同趋势。发酵终点
时(以菜籽油处理组残油为参照)，大豆油试验组残
留量最高，而菜籽油的最低，因此菜籽油是较为理想
的脂类碳源。
2. 4 植物油种类对脂肪酶基因及多杀菌素合成相
关基因转录水平的影响
2. 4. 1 对脂肪酶合成基因转录水平的影响 由菌
体生长曲线(图 1A)、多杀菌素合成曲线(图 1B)及
脂肪酶活性变化曲线(图 4 A)可知:大豆油和菜籽
油在多杀菌素发酵过程中的作用效果不同，因此选
择这两组和对照组，利用 ＲT-PCＲ 检测脂肪酶基因
(lip)在发酵 3 ～ 6 d 内的转录强度(图 6)。从图中
可知:菜籽油试验组中刺糖多孢菌脂肪酶基因的转
录强度最高，发酵至第 5 天时，其转录强度约是大豆
油的 2 倍，对应的酶活性相差 10. 27 U /mL，说明其
对脂肪酶的诱导效果强于大豆油。从整个转录过程
* 表示差异显著(P ＜ 0． 05) ;＊＊表示差异极显著(P ＜ 0． 01)。
* and ＊＊ reprsent significant difference at 0． 05 and
0． 01 level，respectively．
图 5 多杀菌素发酵过程中菌体对不同种类植物油
的消耗曲线
Fig． 5 Curve of lipid consumption process of
S． spinosa during spinosad fermentation
可知，各组脂肪酶基因转录强度的变化与相应脂肪
酶活性和油脂消耗的变化趋势是相符的。
2. 4. 2 对多杀菌素糖基侧链合成基因转录水平的
影响 鼠李糖既是刺糖多孢菌细胞壁脂多糖的组成
部分，又与福乐糖胺一样，是多杀菌素的生物活性基
团，由 4 个多杀菌素糖基侧链合成基因(gtt、gdh、
epi、kre)负责编码，其中 gtt 和 gdh 基因编码脱氧六
No． 3 马 坤等:植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响 263
gtt、gdh、epi、kre 分别为 TDP-葡萄糖合酶基因、4，6-葡萄糖脱水酶合成基因、3，5-差向异构酶基因和 4-酮还原酶合成基因。
gtt，gdh，epi，kre represent glucose nucleotidyl transferase gene，glucose dehydratase gene，3，5-epimerase gene and 4-ketoreductase gene，
respectively．
* 表示差异显著(P ＜ 0． 05) ;＊＊表示差异极显著(P ＜ 0． 01)。* and ＊＊ reprsent significant difference at 0． 05 and 0． 01 level，respectively．
图 7 植物油种类对多杀菌素糖基侧链合成基因转录水平的影响
Fig． 7 Influence of vegetable oils on the transcriptional intensity of saccharide chains synthetic genes during spinosad fermentation
* 表示差异显著(P ＜ 0． 05) ;＊＊表示差异极显著(P ＜ 0． 01)。
* and ＊＊ reprsent significant difference at 0． 05
and 0． 01 level，respectively．
图 6 植物油种类对多杀菌素发酵过程中脂肪酶
基因转录水平的影响
Fig． 6 Influence of vegetable oils on the transcriptional
intensity of lipase synthetic gene during spinosad fermentation
碳糖生物合成的共同前体 TDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄
糖，而 epi 和 kre 则在此前体的基础上合成鼠李
糖［24–25］。由于不同种类植物油对刺糖多孢菌生长
(图 1A)和多杀菌素产量(图 1B)的影响不同，因此
选择发酵 3 ～ 7 d 的样品，检测了这 4 个基因(gtt、
gdh、epi、kre)在初级和次级代谢阶段转录水平的变
化(图 7)。
由图 7 可知:从刺糖多孢菌迅速生长期(3 ～
5 d)到多杀菌素快速合成期(5 ～ 7 d)，菜籽油试验
组中糖基侧链合成基因的转录活性显著高于大豆油
试验组，而由图 1 可知菜籽油对菌体生物量和多杀
菌素产量的促进效果优于大豆油。这说明 4 个糖基
合成基因均参与了初级代谢和次级代谢［26–27］，在菌
体迅速生长期，各组均需 gtt、gdh 合成的 TDP-4-酮-
6-脱氧-D-葡萄糖及 epi、kre 合成的鼠李糖，用以保
证细胞的基础代谢和细胞壁的构建;当进入发酵中
后期，这 4 个基因在菜籽油试验组的转录强度显著
提高，多杀菌素的合成速率明显高于对照组和大豆
油试验组。说明菜籽油可以通过提高多杀菌素糖基
264 农 药 学 学 报 Vol． 17
侧链合成基因的转录表达，进而促进刺糖多孢菌的
生长和多杀菌素产量。
2. 4. 3 对多杀菌素合成基因转录水平的影响 为
深入了解菜籽油对多杀菌素合成基因转录水平的影
响，选择聚酮链合成和交联基因(SpnA，SpnF)、鼠李
糖和福乐糖胺糖基转移酶基因(SpnG，SpnP)，分析
其在发酵 4 ～ 7 d内的转录强度。由图 8 可知:在多
杀菌素合成初期，4 个合成基因在菜籽油试验组中
的转录强度均高于对照组和大豆油试验组，随着多
杀菌素合成速率加快，菜籽油试验组的转录活性同
步提高，而此时大豆油试验组的理化环境已不适宜
菌体的生长和多杀菌素产生，菌体量下降，pH 值迅
速上升，多杀菌素合成基因的转录受阻，最终导致多
杀菌素产量较低。
SpnA、SpnF、SpnG、SpnP分别为多杀菌素聚酮合酶基因、聚酮交联基因、鼠李糖转移酶基因和福乐糖胺转移酶基因。
SpnA，SpnF，SpnG，SpnP represent polyketide synthase gene，polyketide modification gene，rhamnosyl transferase gene and forosamine
transferase gene，respectively．
* 表示差异显著(P ＜ 0． 05) ;＊＊表示差异极显著(P ＜ 0． 01)。* and ＊＊ reprsent significant difference at 0． 05 and 0． 01 level，respectively．
图 8 植物油种类对发酵过程中多杀菌素合成基因转录水平的影响
Fig． 8 Influence of vegetable oils on the transcriptional intensity of spinosad synthetic genes during fermentation
3 讨论
多杀菌素是一种极具前景的新型农用抗生素，
我国尚未掌握其工业化生产技术，主要是因为多杀
菌素发酵过程中易出现碳代谢物阻遏效应。本研究
尝试以植物油作为刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成
的部分碳源，通过对脂肪酶基因转录水平、脂肪酶活
性及油脂量的测定发现，菜籽油对脂肪酶基因的转
录表达具有显著促进作用，酶活最高、持续时间最
长，在多杀菌素快速合成期仍保持较高的活性，对油
脂的分解利用能力最强，是较为理想的诱导物和复
合碳源。
植物油在脂肪酶的作用下水解为甘油和脂肪
酸，后者经 β-氧化分解产生大量酰基-CoA，既可有
效地缓解速效碳源引起的阻遏效应，又是多杀菌素
合成前体(乙酰-CoA、丙酰-CoA 和甲基丙二酰-
CoA)的主要来源。沈兆兵等在对含有相似聚酮链
生物合成途径的红霉素研究中发现，植物油能促进
TCA 循环及中间代谢物琥珀酰-CoA 的积累［28］，并
在甲基丙二酰-CoA 异构酶的作用下转化为红霉素
No． 3 马 坤等:植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响 265
的合成前体甲基丙二酰-CoA［29］。由此推测，植物
油分解产生的酰基-CoA 类代谢物，可为多杀菌素的
合成提供前体，促进其快速合成。
但由于植物油的种类不同，其所含的饱和脂肪
酸、不饱和脂肪酸的种类和比例各不相同［30］，由于
菌种的遗传背景不同，其对油脂的分解利用具有一
定的选择性，因此不同植物油对同一菌株或同一种
植物油对不同菌株的脂肪酶诱导作用存在差异，其
油脂利用能力也不相同。杨莲芳等对红霉素的发酵
研究表明，菜籽油对红霉素合成的促进作用优于大
豆油［31］，本研究得出了与此一致的结论。与大豆油
相比，菜籽油中不饱和脂肪酸的种类和含量均较高，
组分更复杂，其中可能含有促生长因子、抗生素合成
调控因子、抗氧化因子等，其作用机制尚不清楚，有
待进一步研究。
通过对多杀菌素合成相关基因的转录分析发
现，糖基侧链合成基因和多杀菌素合成基因在菜籽
油试验组中的转录水平相对较高，这与该组中生物
量和多杀菌素产量偏高相吻合，说明菜籽油良好的
分解特性可以促进菌体的生长和多杀菌素的合成。
综合发酵过程中 pH 值、还原糖、生物量、脂肪
酶活力及油脂等检测参数可知，菜籽油能够促进菌
体对糖和油脂的利用，生物量最高，发酵中后期仍能
维持较适的 pH值范围，延缓菌体的衰亡，单位菌体
多杀菌素含量也最高。说明菜籽油不仅通过增加菌
体量，还能以增强单位菌体产素能力的方式来提高
多杀菌素的产量。因此，菜籽油是供试植物油中多
杀菌素合成的最佳脂类碳源。
此外，研究发现，在含油培养基中多杀菌素的合
成能力与脂肪酶活力呈正相关，这与杨连芳和卞晨
光等分别对红霉素发酵的研究结论相同，即脂肪酶
活力越高，菌体对油脂的利用能力越强，抗生素的产
量越高［31–32］。因此，对可利用油脂作为菌体生长及
抗生素合成的刺糖多孢菌而言，除选择合适的脂类
碳源外，还可利用基因工程技术在脂肪酶合成基因
的上游插入强启动子或增加脂肪酶基因的拷贝数，
以提高菌体对油脂的利用能力，从而进一步提高多
杀菌素的产量。
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(责任编辑:曲来娥
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(杨新玲 供稿)