全 文 ：中国科学: 生命科学 2012年 第 42卷 第 2期: 148 ~ 157
SCIENTIA SINICA Vitae www.scichina.com life.scichina.com
英文版见: Luo Y S, Kou X X, Ding X Z, et al. Promotion of spinosad biosynthesis by chromosomal integration of the Vitreoscilla hemoglobin gene in
Saccharopolyspora spinosa. Sci China Life Sci, 2012, 55, in press
《中国科学》杂志社
SCIENCE CHINA PRESS
论 文
透明颤菌血红蛋白基因在刺糖多孢菌中整合表达
促进多杀菌素的生物合成
罗玉双†, 寇笑笑†, 丁学知, 胡胜标, 唐滢, 李文萍, 黄璠, 杨琦, 陈汉娜,
夏立秋*
湖南师范大学生命科学学院, 微生物分子生物学国家重点实验室培育基地, 长沙 410081
† 同等贡献
* 联系人, Email: xialq@hunnu.edu.cn
收稿日期: 2011-11-18; 接受日期: 2012-01-06
国家重点基础研究发展计划(批准号: 2012CB722301, 2011CB111605)、国家高技术研究发展计划(批准号: 2011AA10A203)和国家自然科学
基金(批准号: 31070006)资助项目
摘要 为解决刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)高密度深层培养过程中的供氧不
足问题 , 促进多杀菌素的生物合成 , 采用重叠 PCR 技术将透明颤菌 (Vitreoscilla
stercoraria)血红蛋白基因(vgb)可读框(ORF)置于红霉素抗性基因启动子(PermE)之下, 并将
其克隆到整合型载体 pSET152上, 构建成 vgb表达载体 pSET152EVHB; 通过接合转移方
式将其导入刺糖多孢菌 SP06081中, 利用载体上ΦC31整合性位点通过位点特异性重组将
vgb定点整合到SP06081菌株染色体上, 获得一株遗传性能稳定的重组菌株S078-1101; 重
组工程菌的 PCR与 Southern blotting检测显示 vgb已整合到染色体上, 一氧化碳结合差光
谱分析表明在 S078-1101 工程菌中表达了有活性的透明颤菌血红蛋白(VHb); 摇瓶发酵结
果显示, 在正常溶氧与中度限氧状态下, vgb 的表达均可显著促进多杀菌素的生物合成
(P<0.01). 这说明 vgb 在刺糖多孢菌中的整合表达改善了菌体对溶氧的吸收性能, 是一种
有效的定向遗传改良手段.
关键词
刺糖多孢菌
多杀菌素
透明颤菌血红蛋白
整合型载体
同源重组
透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin
gene, vgb)来源于专性好氧的丝状革兰氏阴性菌透明
颤菌(Vitreoscilla stercoraria)的基因组, 在贫氧条件
下能被大量诱导合成一种可溶性血红蛋白—透明颤
菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb), 以满足菌
体对溶氧的需求. VHb 最初被认为是具有末端氧化酶
性质的“细胞色素 o”(cytochrome o, Cyo)[1]. 光谱学分
析表明, VHb 在氧结合动力学性质上与氧合肌红、血
红蛋白相似, 在不同的溶氧条件下可在氧化态、还原
态和氧合态 3 种状态之间相互转化[2]; 超微结构研究
显示, VHb 主要分布于细胞质中并聚集在细胞膜附
近[3]; 早期的作用机理研究表明, VHb 通过与细胞色
素 bo 末端氧化酶相互作用来提高电子传递链的周转
率, 在氧限制条件下能捕捉分子氧, 并协助其转移到
生命力旺盛的呼吸膜上, 使细胞适应贫氧的生活环
境[4]; 近年 VHb 相关的代谢调控与蛋白质组研究显
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示, 它还具有过氧化物酶活性[5], 其表达能调节菌体
的生理功能, 消除发酵过程中有机酸等副产物对菌
体的影响[6,7], 并对能量代谢、中心中间体代谢等有调
控作用[8,9]. VHb 已被广泛应用于易受氧限制的微生
物高密度发酵生产过程 [10,11], 其最新的应用研究包
括: 促进二羟基丙酮(dihydroxyacetone, DHA)等生化
药物原料与前体物质的生产[12~15]; 改善生物修复功
能 , 如: 加强红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)
的生物脱硫作用 [16]; 提高 D-氨基酸氧化酶(D-amino
acid oxidase)等重要酶的合成 [17,18]; 促进抗生素及
生物杀虫剂生物合成 [19,20]; 增强聚 γ 谷氨酸
(poly-γ-glutamic acid, γ-PGA)等生物高分子材料的合
成[21,22].
刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧
发酵产生次级代谢产物—多杀菌素(spinosyns), 它
是一类大环内酯物质, 在功能上具有杀虫的重要作
用, 最初被命名为 A83543 因子[23]. Spinosyn 家族化
合物中主要的活性组份为 Spinosyn A 和 Spinosyn
D(合称 Spinosad). 研究表明, 多杀菌素与鳞翅目、缨
翅目等靶标害虫有 2 个作用位点—γ-氨基丁酸受体
(gamma-amino butyric acid receptors, GABARs)和烟
碱乙酰胆碱受体 (Nicotinic acetylcholine receptors,
nAchRs), 具有摄食毒性和快速触杀双重作用[24], 对
非靶标生物的毒性很低, 对人和其他哺乳动物非常
安全[25], 迄今为止没有发现与其他杀虫剂有交叉抗
性[26]. 多杀菌素因兼具化学农药的快速性与生物农
药的安全性已被广泛用于农业害虫与动物寄生虫病
防治, 成为当前国际上极具发展前景的生物杀虫剂.
然而, 野生型刺糖多孢菌的多杀菌素生物合成
量很低, 为提高其产量的菌种遗传改良成为当前的
研究热点, 已有利用传统的理化诱变结合高通量筛
选[27], 原生质体再生[28], 原生质体属间融合[29], 多杀
菌素生物合成相关基因加倍等方法进行其菌种改良
的相关报道[30]. 刺糖多孢菌发酵过程中菌体呈丝状
增长, 且多杀菌素的生物合成需要脂肪酸作为前体,
发酵生产中常添加一定量的豆油, 导致菌体发酵液
十分黏稠, 供氧不足成为限制多杀菌素生物合成的
主要因素之一. 本研究应用基因重组技术, 将透明颤
菌血红蛋白基因(vgb)整合至刺糖多孢菌染色体上 ,
以期通过 VHb 的表达改善刺糖多孢菌在高密度深层
培养过程中的供氧不足, 促进多杀菌素的生物合成.
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒与引物
本研究所用菌株、质粒与引物见表 1.
1.2 培养基与培养条件
大肠杆菌(E. coli DH5α)采用 Luria-Bertani(LB)或
TY 液体培养基[31]. 接种单克隆或 1%菌种保藏液于
10 mL 含相应抗生素的 LB 培养基中, 37℃, 200 r/min
摇瓶培养过夜 ; 刺糖多孢菌种子活化培养基采用
CSM(Tryptic Soy Broth 30 g/L, 酵母提取物 3 g/L, 葡
萄糖 5 g/L, 麦芽糖 4 g/L). 将 0.5 mL 80℃甘油贮存
菌液加入装有 20 mL CSM 的 250 mL 摇瓶中, 每个摇
瓶放 5 个玻璃珠(5 mm), 30℃, 300 r/min振荡培养 48
h; 大肠杆菌与刺糖多孢菌属间接合转移采用 R6 与
BHI(Brain Heart Infusion)固体培养基[32]; 刺糖多孢菌
发酵培养基与培养条件参见文献[28].
1.3 工具酶、试剂、抗生素及使用浓度
LA Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA
连接酶、DNA 凝胶回收试剂盒等购自大连宝生物工
程有限公司; PCR 引物由生工生物工程(上海)有限公
司合成; 胰蛋白胨与酵母提取物购自 Oxiod 公司;
TSB 和 BHI 购自 Difco 公司; 地高辛标记与检测试剂
盒购自 Roche 公司; 其他试剂购自中国国药集团, 药
品为分析纯或色谱纯. 安普拉霉素(Apramycin, Apr)
50 mg/L, 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp) 50 mg/L, 氯
霉素(Chloramphenicol, Cm) 25 mg/L, 四环素(Tetrac-
ycline, Tet) 25 mg/L, 卡那霉素(Kanamycin, Kan) 50
mg/L, 萘啶酮酸(nalidixic acid, NA) 25 mg/L 等抗生
素购自 Sigma 公司.
1.4 基因技术基本操作
大肠杆菌感受态制备、质粒提取、酶切、连接、
转化、PCR、电泳、Southern blotting 等技术操作见《分
子克隆实验指南》[31]. 红色糖多孢菌(S. erythraea)与
刺糖多孢菌基因组 DNA 的提取参见文献《链霉菌遗
传操作》[33]. 所有 PCR产物连接到 pMD18-T载体, 酶
切鉴定后送上海生工测序确证.
1.5 整合型载体 pSET152EVHB 的构建
以红色糖多孢菌基因组为模板, 根据 GenBank
罗玉双等: 透明颤菌血红蛋白基因在刺糖多孢菌中整合表达促进多杀菌素的生物合成
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表 1 菌株、质粒和引物
相关描述 来源与引用
菌株
E. coli DH5α endA1 hsdR17 supE44 thi-1 gyrA relA1 ∆(lacZYA-argF) U169 deoR [Φ80 dlac∆(lacZ)
M15]
Invitrogen 公司
E. coli ET12567(pUZ8002) supE44 hsdS20 (r−Bm−B) ara-14 proA2 lacY galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1 dam− dcm−
hsdM−, CmR KanR
John Innes Centre
Prof. Bibb M.J 惠赠
[33]
Saccharopolyspora erythraea 红色糖多孢菌, 基因组上含有红霉素抗性基因启动子(PermE) NRRL2338
S. spinosa SP06081 本室筛选的刺糖多孢菌 SP06081 CCTCCNO: M208034
S. spinosa S078-1101 在 SP06081 菌株染色体 attB 位点整合了透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的重组
工程菌
本研究
质粒
pMD18-T 载体 AmpR, 克隆载体 TaKaRa 公司
pRK404-VHb 带有透明颤菌血红蛋白全基因的 pRK404 质粒, TetR 中国农业大学文滢教
授惠赠[10]
pSET152 ΦC31-衍生的整合型载体, pUC18 复制子, ApraR 华中农业大学陶美凤
教授惠赠[34]
pSET152EVHB 置于 PermE启动子下的 vgb 基因通过 EcoRⅠ和 XbaⅠ双酶切后插入 pSET152 质粒 本研究
引物
P1 GAATTCGGTACCAGCCCGACCCGAGCAC 本研究
P2 GATGTTAATGGTTTGCTGGTCCAGCACCGCTGGATCCTACCA
P1/P2 用于扩增启动子 PermE(P1 斜体部分为酶切位点, P2 下画线部分为引入的突
变位点)
本研究
P3 TGGTAGGATCCAGCGGTGCTGGACCAGCAAACCATTAACATC 本研究
P4 TCTAGAATGCCAAGGCACACCTGAAG
P3/P4 用于扩增 vgb 基因(P3 下画线部分为引入的突变位点, P4 斜体部分为酶切
位点)
本研究
Apr-F GTCCAATACGAATGGCGAAAAGC 本研究
Apr-R ATAACATTCTTCGCATCCCGCC
Apr-F/Apr-R 用于扩增安普拉抗性基因 aac3(Ⅳ)
本研究
上公布的序列(gi:152688), 设计一对引物 P1/P2, 其
中在 P1 的 5′端引入 EcoRⅠ酶切位点, P2 引入突变位
点CAGCAC, 扩增红霉素抗性基因启动子PermE, PCR
反应总体系 50 μL(纯水 16.8 μL, 2×GC buffer 25 uL,
10 mmol/L dNTP 2 μL, 引物 P1 和 P2 各 2 μL, DNA
模板 2 μL, LA Taq 酶 0.2 μL), 循环参数为: 94℃预变
性 2 min 后开始以下循环: 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃
30 s, 进行 28 个循环, 最后 72℃延伸 5 min; 以
pRK404- VHb 质粒为模板, 根据 GenBank 上公布的
序列(gi:155317), 设计 1 对引物 P3/P4, 其中在 P4 的
5′端引入 Xba I 酶切位点, P3 引入突变位点 GTGCTG,
扩增 vgb 基因的可读框(ORF), PCR 反应总体系 50
μL(纯水 35.5 μL, 10× buffer 5 L, 2.5 mmol/L dNTP 3
μL, 引物 P3 和 P4 各 2 μL, DNA 模板 2 μL, Cas Taq
酶 0.5 μL), 循环参数为: 94℃预变性 2 min 后开始以
下循环: 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 进行 28
个循环; 最后 72℃延伸 5 min. 以上述 2 种 PCR 回收
产物为模板, P1/P4为引物, 采用重叠 PCR(splicing by
overlap extension PCR, SOE- PCR)方法, 将 vgb 的
ORF 置于 PermE 之下, TA 克隆测序确证后, EcoRⅠ/
XbaⅠ双酶切, 连接至经同样双酶切的 pSET152 载体,
获得整合型载体 pSET-152EVHB.
1.6 重组菌株 S. spinosa S078-1101 的构建
首先将目的质粒 pSET152EVHB热激转化 E. coli
ET12567 (pUZ8002), 经 Apr, Cm 与 Kan 三抗筛选阳
性转化子 , 提取质粒酶切鉴定获得转化子 E. coli
ET12567(pUZ8002, pSET152EVHB)并进行菌种保藏.
大肠杆菌-刺糖多孢菌属间接合转移参考文献[32,34],
略做修改如下: 将受体菌 SP06081在CSM内活化 48 h
后, 玻璃匀浆器研磨碎断菌丝体, 按 10%接种量转接
TSB 液体培养基, 30℃, 300 r/min 振荡培养 16 h; 再
以 25%接种量二次转接菌丝体于 TSB 培养基, 继续
培养 6 h后, 收集菌丝体并重悬于 2 mL TSB中. 同时,
用 TSB 将过夜培养的供体菌 E. coli ET12567
(pUZ8002, pSET152EVHB)洗涤 2 次以去除抗生素,
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再重悬于 5 mL TSB 中. 供体-受体(E. coli-S. spinosa)
按 1:3 比例(250 μL:750 μL)混合加入无菌的离心管,
然后将 1 mL混合物涂布R6平板, 超净工作台内静置
30 min 使其充分吸收. 接合平板 30℃倒置培养 16 h
后, 覆盖Apr和NA, 使终浓度分别为 50和 25 μg/mL.
30℃继续培养 10~14 天后, 挑取单克隆转接至含 Apr
和 NA 的 BHI 平板, 培养 3~4 天, 待 BHI 平板上的菌
落长充分之后, 挑取部分菌体转接于装有 15 mL TSB
液体培养基的 250 mL 摇瓶中 , 同时加入 Apr(50
μg/mL)和 NA(25 μg/mL), 30℃培养 3~4 天, 菌液 PCR
扩增检测 Apr 和 vgb 基因阳性的为接合子, 命名为 S.
spinosa S078-1101, 菌种80℃甘油保藏以备后续检
测分析.
1.7 分析方法
1.7.1 重组的刺糖多孢菌中 VHb 的生物学活性
测定
参照文献[35], 略做修改, 采用一氧化碳(CO)差
光谱法分析 VHb 的生物学活性. 收集发酵培养 5 天
的菌丝体, 预冷的缓冲液(10 mmol Tris-HCl pH 7.0,
60 mmol NH4Cl, 10 mmol CH3COOMg, 1 mmol DTT,
1 mmol PMSF)洗涤菌丝体 2 遍, 4℃离心, 重悬菌丝
体于 10 mL 缓冲液中. 冰水混合物上超声波破碎菌
体, 功率 100 W, 超声 5 s, 间隔 15 s, 循环 30 次. 重
复 3次. 4℃ 3000 r/min离心去除沉淀, 上清中加入连
二亚硫酸钠 0.4 g, 使达到饱和浓度, 室温还原 20~30
min, 然后等分为 2 份, 一份直接加入比色皿放入参
比池, 另一份通入一氧化碳 3 min, 避光静置 10~15
min后加入比色皿放入检测池, 400~500 nm光谱扫描.
1.7.2 VHb 表达对刺糖多孢菌生长的影响
刺糖多孢菌在种子活化培养基 CSM 内的生长测
定采用光密度(A600)法; 在发酵培养基内的生物量测
定采用菌体核酸值间接法测定[36]. 每组实验设置 3个
生物学重复.
1.7.3 不同溶氧条件下原始菌株与重组菌株多杀
菌素生产的 HPLC 分析
不同培养基装量与转速条件下, 采用美国 NBS
INNOVO 4900 型保湿摇床(相对湿度 80%, 温度 30℃)
摇瓶发酵生产多杀菌素. 采用 AKTA Purifier10 高效
液相色谱仪测定多杀菌素产量, 按 1:1 (v/v)比例向
发酵液中加入甲醇, 30℃ 浸提 8~10 h, 10000 r/min
离心 15 min, 上清即为多杀菌素粗提物. 将其用 0.22
μm 微孔滤膜过滤后上 HPLC 分析 , 色谱柱为
AQ12S05-1546WT(150×4.6 mmI.D. S-5μm, 12 nm),
流动相: 甲醇/乙腈/2%醋酸铵(v/v/v)=45/45/10, 流速
1.5 mL/min, 紫外检测波长 250 nm, 进样体积: 10 μL.
HP/C-900 色谱工作站分析计算多杀菌素含量, 采用
单点外标法进行计算. 每组实验设置 3 个生物学重复.
数据以均数±标准差( x ±SD)表示, 采用 SPSS 15.0 统
计软件进行方差分析.
1.8 重组菌株 S. spinosa S078-1101 遗传稳定性
检测
将S078-1101 菌株80℃保藏液用不加抗生素的
CSM 液体培养基活化 48 h, 梯度稀释后涂布于无抗
生素的 R6 平板, 30℃ 培养 5~7 天; 挑取 100 个单菌
落转接含 Apr(50 mg/L)R6 平板, 30℃培养 3~4 天, 计
数抗性克隆数; 并从中随机挑取 20 个单菌落, 于无
抗的 CSM 活化 48 h 后做菌液 PCR 扩增检测 vgb 基
因, 同时转接无抗发酵培养基摇瓶发酵 9 天, HPLC
检测多杀菌素含量. 以此方法 5 次传代培养, 以第 1
代工程菌的多杀菌素含量为 100% 做为对照计算每一
代的相对生产效价, 考察重组菌株的遗传稳定性.
2 结果与分析
2.1 整合型载体 pSET152EVHB 的构建
如图 1A 所示, 以红色糖多孢菌基因组为模板,
用 P1/P2 PCR 扩增得到 311 bp 的 PermE; 以 pRK404-
VHb 质粒为模板, 引物 P3/P4 PCR 扩增得到 603 bp 的
vgb ORF; 以 PermE和 vgb 的 PCR 回收产物为模板, 用
P1/P4 SOE-PCR获得了0.9 kb带红霉素抗性基因启动
子的 vgb 片段. 此外, 由于在 P2, P3 引入了突变位点
(表 1, 下画线碱基部分), 经测序确证成功的将 vgb的
起始密码子 ATG突变成 GTG, 第二密码子 TTA突变
成 CTG. 构建的整合型载体 pSET152EVHB(图 1C)
含有: 链霉菌噬菌体 ΦC31 编码的位点特异性重组系
统 int/attP, 能定点整合到刺糖多孢菌基因组 attB 位
点; 安普拉抗性基因 aac3(Ⅳ); 接合转移起始位点
oriT; 置于 PermE 之下的透明颤菌血红蛋白基因 vgb.
罗玉双等: 透明颤菌血红蛋白基因在刺糖多孢菌中整合表达促进多杀菌素的生物合成
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图 1 pSET152EVHB 的构建
A, 重叠 PCR 分析(1: DNA 分子量标准; 2: 引物 P1/P2 PCR 扩增产物; 3: 引物 P3/P4 PCR 扩增产物; 4: 引物 P1/P4 PCR 扩增产物); B,
pSET152EVHB 载体酶切分析(1: DNA 分子量标准; 2: EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切载体); C, pSET152EVHB 载体图谱
pSET152EVHB 经 EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切得到 5.5 kb
和 0.9 kb 的 2 条带(图 1B), 与预期 DNA 片段大小相
符, 说明整合型载体构建成功.
2.2 重组菌株 S. spinosa S078-1101 的 PCR 与
Southern blotting 检测
S. spinosa S078-1101 的 PCR验证结果见图 2: 以
重组菌株基因组为模板, 用 Apr-F/Apr-R引物 PCR 扩
增出 1 条 750 bp 安普拉抗性基因片段; 引物 P1/P4
PCR 扩增出长度为 0.9 kb 带红霉素抗性基因启动子
的 vgb 片段. 回收目的片段测序, 结果表明, 安普拉
抗性基因与 vgb基因一起整合至 SP06081菌株的染色
体上. 以地高辛标记的 vgb 为探针, 进一步的基因组
DNA Southern blotting结果显示, S078-1101菌株基因
组样品有一条 3.2 kb大小的杂交信号(图 3A和B), 与
理论酶切的大小相符(图 3C), 而对照菌株 SP06081 基
因组样品无杂交信号, 表明 S. spinosa S078-1101 构
建成功.
2.3 VHb 在重组刺糖多孢菌内生物学活性检测
采用 S. spinosa S078-1101 发酵 5 天的细胞破碎
粗提液进行 CO 差光谱分析, 结果显示, 其菌体细胞
与 CO 结合后在 420 nm 处产生了明显的吸收峰, 而
对照菌株 SP06081菌体细胞与CO结合后没有这种差
光谱特性(图 4). 这表明 , 重组菌株细胞中表达了
VHb, 且能够吸收 CO 形成 CO 结合性的血红蛋白,
具有生物学活性.
图 2 接合子 S. spinosa S078-1101 的 PCR 验证
M: 200 bp DNA 分子量标准; 1~3: Apr-F/Apr-R 扩增安普拉抗性基因;
4~6: P1/P4 扩增 vgb 基因; 1, 4: 以 SP06081 基因组为模板做阴性对
照; 2, 5: 以 pSET152EVHB 质粒为模板做阳性对照; 3, 6: 以 S078-
1101 菌株基因组为模板
2.4 VHb 表达对刺糖多孢菌生长与多杀菌素生物
合成的影响
在种子培养基 CSM 内 , 重组的刺糖多孢菌
S078-1101 与原始菌株 SP06081 相比, 生长相对缓慢.
SP06081 菌株在 24 h 进入指数增长期, 84 h 进入稳定
期; 而 S078-1101 菌株 48 h 进入指数增长期, 108 h 后
才进入稳定期. 在稳定期之前, 其生长速度显著低于
对照菌株, 但稳定期之后, 这种生长差异趋于缓和,
到 120 h 后, 细胞密度只略低于对照菌株(图 5A); 两
菌株在发酵培养基中均在第 9 天达到最大生物量, 发
酵 5~11天内, S078-1101菌株生物量均低于原始菌株,
但差异不显著(P > 0.05)(图 5B); 这说明, vgb 插入刺
糖多孢菌染色体组在一定程度上限制了刺糖多孢菌
的生长.
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图 3 接合子 S. spinosa S078-1101 的 Southern blotting
分析
A, Southern blotting 转膜前 DNA 凝胶电泳图(M: DL15000 DNA
marker; 1, 2分别为经Pst I酶切的刺糖多孢菌SP06081和S078- 1101
基因组片段, 基因组 DNA 点样量 10 μg; 3: 以 pSET152EVHB 质粒
为阳性对照, 质粒 DNA 点样量 0.5 ng); B, 转膜后基因组 DNA 与地
高辛标记的 vgb 探针的杂交结果; C, pSET152EVHB 整合 SP0-
6081 菌株基因组 attB 位点的物理图谱
两菌株多杀菌素的生物合成呈现相似的变化规
律(图 5C), 5~9 天内, 随着发酵时间的延长, 其多杀
图 4 VHb 的 CO 差光谱分析
A, S. spinosa SP06081; B, S. spinosa S078-1101
菌素的生物合成快速增加, 在第 9 天达到最大值. 随
后, 多杀菌素的生物合成开始下降. 从第 7 天开始重
组菌株S078-1101的多杀菌素生物合成显著高于原始
菌株, 且随着时间的延长, 这种差异越显著(P<0.01).
这说明, VHb 的表达显著促进了刺糖多孢菌多杀菌素
的生物合成.
2.5 不同溶氧条件下 , 重组菌株多杀菌素产量
分析
以不同的培养基装量与摇床转速模拟不同的溶
解氧状况来考察 vgb 表达对刺糖多孢菌多杀菌素合
成的影响(表 2), 结果表明, 溶氧水平对菌体多杀菌
素合成有显著影响, 随着培养基装量的增加或摇床
转速的降低, 无论是原始菌株SP06081还是重组菌株
图 5 VHb 表达对刺糖多孢菌生长与多杀菌素合成的影响
A, SP0681 与 S078-1101 菌株在 CSM 培养基中生长曲线; B, 两菌株不同发酵时间菌体生物量比较; C, 两菌株不同发酵时间多杀
菌素产量比较
罗玉双等: 透明颤菌血红蛋白基因在刺糖多孢菌中整合表达促进多杀菌素的生物合成
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表 2 不同溶氧状况下 VHb 表达对刺糖多孢菌多杀菌素生物合成的影响( x ±SD)
摇瓶体积/装量/转速 多杀菌素产量(mg/L) 提高幅度
SP06081 S078-1101
正常溶氧 300 mL/20 mL/300 r/min 251.1±4.4a) 466.6±15.2a),b) 86%
中度限氧 300 mL/20 mL/240 r/min 152.4±6.5a),b) 211.0±2.8a),b) 38%
高度限氧 300 mL/50 mL/240 r/min 5.3±1.9b) 12.9±2.5b) 144%
a) 与高度限氧条件下 SP06081 菌株比较, P<0.01; b)与正常溶氧条件下 SP06081 菌株比较, P<0.01.
S078-1101 的多杀菌素生物合成均明显下降; 与正常
溶氧状态下相比, 中度氧限制条件下两菌株多杀菌
素产量均下降 50%以上. 但无论是正常溶氧还是中
度氧限制条件下, 重组菌株的多杀菌素产量均显著
高于原始菌株(P<0.01). 在高度氧限制条件下, 两菌
株多杀菌素产量下降幅度高达 97%以上, 虽然重组
菌株的多杀菌素产量高于 SP06081, 但两菌株之间多
杀菌素生物合成没有显著差异.
2.6 重组菌株的遗传稳定性分析
在无抗性选择压力下, 将重组菌株连续 5次传代
培养, 98%以上的单克隆仍能保持安普拉抗性, 说明
在传代的过程中, 整合的外源基因没有丢失. 进一步
的 vgb 基因 PCR 检测及无抗压力下摇瓶发酵结果显
示多杀菌素生物合成相对效价稳定在 95%以上, 说
明整合在刺糖多孢菌染色体上的 vgb 能稳定遗传, 各
代之间多杀菌素产量无显著差异, 说明重组菌株遗
传稳定性良好.
3 小结与讨论
虽然多杀菌素生物合成基因簇及其合成途径已
被阐明, 但对其生物合成表达的调控因子知之甚少,
难以通过定向遗传改造来提高其次级代谢物产量 .
在前期的研究中, 我们发现本室分离的刺糖多孢菌
SP06081 虽然遗传性能稳定, 但产量较低, 且发酵过
程中对溶氧的要求近乎苛刻; 对该菌株进行传统遗
传改良过程中发现多杀菌素的生产潜能与其耐低氧
能力之间呈现一定的正相关性 , 在刺糖多孢菌
SP06081 与其原生质体再生高产菌株 PR2 的差异蛋
白质组比较研究中亦发现了一组与抗氧化压力相关
的蛋白在高产的 PR 菌株中显著上调[37], 这促使我
们进一步开展改善菌体对溶氧的利用特性研究, 以
促进其多杀菌素的生物合成. 已有研究表明, 异源表
达 VHb 能提高细胞生长、蛋白合成、代谢物生产
及 NO 解毒等 , 基因表达策略包括定点整合染色
体[19~21]、共表达[14,15,22]以及融合表达[17]等. 本研究首
先尝试将 vgb 克隆进大肠杆菌 -链霉菌穿梭质粒
pJN100[38], 构建复制型表达质粒 pJN100-VHb. 但无
论是电转化菌丝体还是 PEG 介导的原生质体转化,
甚至接合转移都没有获得阳性克隆子, 这可能是由
于刺糖多孢菌SP06081限制性修饰太强, 导致外源质
粒无法在其中复制存活. 研究表明, 刺糖多孢菌内存
在 ΦC31 attB 位点, 且小片段外源基因(大约 2 kb)插入
该位点不会影响其多杀菌素的生物合成[32]. 因此本研
究将 vgb 克隆进 ΦC31 衍生载体 pSET152[34], 构建整
合型表达载体 pSET152EVHB, 采用接合转移方法将
vgb 导入刺糖多孢菌 SP06081, 并定点整合至其染色
体上. 尽管接合效率不高(大约为 107), 且在接合转
移过程中有基因片段缺失现象, 仍然获得了 1 株遗传
性状稳定, 能表达具生物学活性 VHb 的重组刺糖多
孢菌 S078-1101.
重组菌 S078-1101 在种子培养基和发酵培养基
中的生物量均略低于原始菌株(图 5A 和 B), 但其多
杀菌素的生物合成均显著高于原始菌株(P<0.01, 图
5C 和表 2), 这与 Brünker 等人[39]在 S. erythraea 中的
研究结果类似; 而与杨洪涛等人[19]的研究结果存在
差异. 后者在林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)
中表达 VHb, 在正常溶氧状态下对生物量和抗生素
生产均没有产生显著的影响, 仅在氧限制条件下有
增强菌体生长和林可霉素生物合成的作用, 这可能
是由于 VHb 在不同的微生物内或不同的培养条件下
表达有不同的调控作用. 另一方面, 在正常溶解氧状
况下, 重组菌株发酵生物量没有增长而多杀菌素产
量显著提高, 镜检菌丝片段化状态亦没有发现差异,
因此, 推测多杀菌素产量的提高可能是由于 VHb 的
表达使菌丝体能更有效的获得和利用培养环境中的
氧气, 从而对多杀菌素生物合成的某些需氧限速步
骤起到了加速作用, 使代谢流更多地流向多杀菌素
的生物合成途径. VHb 在刺糖多孢菌中的精确代谢调
中国科学: 生命科学 2012 年 第 42 卷 第 2 期
155
控机理有待进一步研究.
vgb 基因自身启动子受氧浓度的调控, 在透明颤
菌和大肠杆菌内低溶氧(小于 2%饱和氧浓度)能诱导
其启动表达可溶性 VHb, 使菌体适应贫氧环境, 经济
方便. 但溶氧并非直接作用于 vgb 基因启动子上, 而
是在转录水平受铁氧还蛋白 -NADP 还原酶 (Ferr-
edoxin-NADP reductase, FNR)和氧呼吸控制 A 蛋白
(aerobic respiratory control A, ArcA)双重调节 [40,41],
在大多数的阳性菌和真核生物中, vgb 自身启动子常
不能发挥作用. 国内外学者针对不同的异源宿主采
取不同的启动子策略, 如 Suthar 等人[18]在许旺酵母
(Schwanniomyces occidentalis)中采用 α 淀粉酶启动子
PAMY1, Horng 等人[22]在 E. coli 中采用阿拉伯糖诱导启
动子 PBAD, Feng 等人[20]在苏云金芽胞杆菌(Bacillus
thuringiensis)中采用Pluxs, Xiong等人[16]在红串红球菌
(Rhodococcus erythropolis)中采用 Pdsz 均表达出了有
活性的 VHb. 本研究采用的启动子 PermE 已被成功用
于林可链霉菌等放线菌的代谢工程 [19,42], 通过定点
突变和 SOE-PCR 将 vgb 第 1 和第 2 密码子分别突变
成 GTG 和 CTG, 并将 vgb 置于 PermE 之下, 使 vgb
基因在刺糖多孢菌中成功表达出有活性的血红蛋白
(图 4).
本研究获得的重组菌株具备以下优点 : 第一 ,
vgb 采用组成型启动子, 不需要诱导即可表达. 第二,
vgb 的表达在正常溶氧与中度限氧条件下均显著促进
了多杀菌素的生物合成, 且 vgb 整合进刺糖多孢菌染
色体, 无抗性压力选择下连续 5 次传代培养, 多杀菌
素生产性能仍然稳定. 这说明 vgb 在刺糖多孢菌中的
整合表达能改善菌体对溶氧的吸收性能, 促进多杀
菌素的生物合成, 是一种有效的定向遗传改良手段.
此外, 将 vgb 整合至多杀菌素生产性能优良的其他刺
糖多孢菌染色体组, 及寻找其他刺糖多孢菌组成型
强启动子, 以更大程度的挖掘其多杀菌素生产潜能
也是今后的研究方向.
致谢 感谢 John Innes Centre Prof. Bibb M J、华中农业大学陶美凤教授及中国农业大学文滢教授为本研究工作提供
的工具载体与菌株帮助.
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