全 文 ：农 药
AGROCHEMICALS
第51卷第7期
2012年7月
Vol. 51, No. 7
Jul. 2012
刺糖多孢菌生长特性及移种标准
王子宝，沈淑媛，裘娟萍
(浙江工业大学 生物与环境工程学院， 杭州 310014)
摘要：[目的]掌握刺糖多孢菌生长代谢特性，为提高多杀菌素产量及发酵稳定性提供依据。 [方法]对刺糖多孢菌
斜面及种子生长规律、培养工艺及移种标准进行研究。 [结果]确定斜面移种标准为平板单菌落移种第1代斜面，
菌龄7 d；液体种子最佳培养工艺为添加30粒玻璃珠，温度30 ℃，初始pH值8.5；液体种子移种标准为生物量大于
1.4 g/L、氨基氮75~80 mg/L、还原糖低于7 g/L、pH值低于7.5、种龄30~36 h。 [结论]采用标准种子移种，多杀菌素
产量提高58.5%，不同批次间产量差异小于5%。
关键词：刺糖多孢菌；多杀菌素；生长特性；移种标准
中图分类号：TQ450 文献标志码：A 文章编号：1006-0413(2012)07-0494-05
Growth Characteristic and Inoculation Standard for Saccharopolyspora spinosa
WANG Zi-bao, SHEN Shu-yuan, QIU Juan-ping
(College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)
Abstract: [Aims] The aim is to investigate the growth metabolism characteristic of Saccharopolyspora spinosa and to
provide the basic materials for increasing spinosad production and fermentation stability. [Methods] The growth rule,
cultivation process and inoculation standard of Saccharopolyspora spinosa were studied. [Results] The result showed that
the cultivation of single colony on the plate for 7 days was the best inoculation standard of the slant strains. The optimized
culture conditions of liquid seed were established as a combination of the glass bead of 30 grains in 500 mL shake fl ask,
cultural temperature at 30 °C and initial pH of 8.5. The inoculation standard of liquid seed consisted of biomass (greater
than 1.4 g/L), amino nitrogen (75-80 mg/L), of reduced sugar (less than 7 g/L), pH (less than 7.5) and inoculum age (30-
36 h). [Conclusions] Employing the new inoculation standard, the spinosad production is increased by 58.5% and the
difference of spinosad production among different batches is less than 5%.
Key words: Saccharopolyspora spinosa; spinosad; seed properties; inoculation standard
多杀菌素(spinosad)也称刺糖菌素，系糖多孢菌属
(Saccharopolyspora )的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora
spinosa )产生的次生代谢产物。 对多种害虫具有良好的
杀灭作用，是一种曾获美国“总统绿色化学品挑战奖”的
高效生物杀虫剂，已于1997年由美国陶氏益农公司实现
产业化[1-3]。
目前，国外关于刺糖多孢菌的研究主要集中于深入的
理论研究：如多杀菌素的杀虫机理[4]、遗传调控[5]、新型衍
生物的开发[6-7]等；国内的相关研究主要集中于提高产量，
实现产业化：如高产菌株的选育、发酵工艺的优化、基因定
向改造等[3,8-9]。 然而，在多杀菌素发酵控制过程中，需要掌
握刺糖多孢菌生长规律，需要有控制种子移种的标准，除
考虑菌丝形态外，更应结合相关生化指标，从而有助于建
立科学稳定的发酵工艺移种标准[10]。
本文研究刺糖多孢菌在种子阶段的生长特性、菌丝形
态及相关生化指标，确定菌种培养工艺，建立一套能控制
种子生理状态的移种标准，为提高多杀菌素产量及发酵稳
定性提供良好的理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌种和培养基
1.1.1 菌种
刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)，浙江工业大
学微生物研究所保藏。
1.1.2 培养基
斜面固体培养基(g/L)：葡萄糖9，酵母膏3，玉米浆
10，MgSO4·7H2O 0.2，琼脂20，pH值7.5(消前)，115 ℃灭
菌30 min。
种子培养基 (g/L)：葡萄糖10，蛋白胨4，酵母膏4，
MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 2，K2HPO4·3H2O 4，pH值8.0(消
前)，115 ℃灭菌30 min。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，麦芽糖10，蛋白胨12，
酵母膏12，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO4 1，K2HPO4 ·3H2O 2，
pH值8.5(消前)，115 ℃灭菌30 min。
收稿日期：2012-03-26，修返日期：2012-04-13
基金项目：浙江省农业科技重大专项重点项目(2009C12062)
作者简介：王子宝(1987—)，男，硕士研究生，研究方向：应用微生物。 E-mail：wzbcool@126.com。
通讯作者：裘娟萍(1958—)，女，教授。 Tel：0571-88320057，E-mail：qiujping@yahoo.com.cn。
·科研与开发·
495第7期
1.2 主要仪器
MP200 pH计(瑞士Mettler Toledo公司)，X1R高速冷冻
离心机(美国Thermo公司)，高效液相色谱(日本岛津公司)，
BS124分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，YS100光
学显微镜(日本Nikon公司)，紫外可见光分光光度计(上海
棱光公司)。
1.3 增氧瓶
普通摇瓶底部侧面经特殊加工，3处向里内陷1~1.5 cm，
起到增加氧气和剪切力的作用。
1.4 实验方法
1.4.1 培养条件
斜面培养条件：挑取1环刺糖多孢菌在斜面上划线接
种，30 ℃恒温培养5 d。
一级种子培养条件：将刺糖多孢菌斜面菌悬液接
入1级种子培养基，装液量50 mL/250mL三角瓶，摇床
转速200 r/min，30 ℃培养48 h。
二级种子培养条件：接种量10%，装液量100 mL/500mL
三角瓶，摇床转速200 r/min，30 ℃培养36 h。
发酵培养条件：接种量10%，装液量30 mL/250mL三角
瓶，摇床转速200 r/min，30 ℃振荡培养7 d。
1.4.2 pH值的测定
采用MP200 pH计测定，用5 mol/L NaOH调节pH值。
1.4.3 生物量测定
准确量取10 mL振荡均匀的培养液，8000 r/min离心
10 min，弃上清液，用去离子水洗涤后沉淀于100 ℃烘干
至恒重，称量得生物量。
1.4.4 还原糖测定
还原糖的测定采用DNS法[11]。
1.4.5 氨基氮测定
氨基氮的测定采用靛酚蓝-分光光度法[12]。
1.4.6 总磷测定
总磷的测定采用钒钼黄比色法[13]。
1.4.7 多杀菌素效价测定
1) 发酵液预处理[14]
准确量取1 mL振荡均匀的发酵液，与甲醇按1∶4混合，
40 kHz超声频率下处理0.5 h，室温静止浸提1.5 h，吸取
1 mL上层液，10,000 r/min离心10 min，上清液经微孔有机
滤膜(0.45 μm)过滤，待用HPLC测定。
2) HPLC检测方法[14]
色谱分离柱：Inertsil®ODS-SP(5 μm，4.6 mm×250 mm)；
柱温：30 ℃；流动相：甲醇∶乙腈∶0.05%乙酸铵溶液(质量
分数)=45∶50∶5(体积比)；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；
检测波长：250 nm。
2 结果与讨论
2.1 刺糖多孢菌斜面生长特性及移种标准的研究
2.1.1 斜面菌龄对菌体生长及产素能力的影响
孢子具有较强的抗逆性，能保持菌种的典型特征，故
一般菌种均以孢子状态保存。 然而孢子的成熟度不仅会影
响其遗传稳定性和抗逆性，还会影响孢子的萌发速率和生
长状况。 将培养不同时间的斜面孢子接入种子培养基，培养
48 h后，接种发酵培养基，余下种子液按1.4.3测定生物量。 观
察不同菌龄的刺糖多孢菌斜面孢子层的丰满度、孢子颜色、
菌苔湿润度、对转种后菌体生物量、发酵效价的影响，分析
孢子成熟度对菌种生长及产素能力的影响，结果见表1。
表1 斜面菌龄对菌体生长及产素能力的影响
菌龄/d 斜面孢子特性 种子液 发酵液中
孢子层丰度 孢子颜色 菌苔湿度 生物量/(g·L-1) 相对效价/%
5 +++ 白色 ### 0.78±0.08 100
7 ++++ 粉红色 ### 1.27±0.10 121.5±1.3
9 ++++ 粉红色 ## 1.10±0.07 109.3±0.9
11 +++ 粉红色 ## 0.87±0.06 92.4±1.1
13 ++ 微粉红色 # 0.82±0.07 70.3±0.5
注：++++表示孢子量丰厚，+++表示孢子量一般，++表示孢子量较少；###表
示菌苔湿度良好，##表示菌苔较干燥，#表示菌苔干瘪。
表1结果表明：菌龄为5 d的斜面，孢子虽已形成，但相
对较嫩，生长及产素能力不高；菌龄为7 d的斜面，孢子层
丰满且呈粉红色，菌苔湿润度较好，种子液中生物量最大，
说明此时孢子成熟度正好；菌龄超过7 d的斜面，孢子已趋
于衰老，其萌发和生长速率逐渐减慢。 因此，后续研究选
择斜面培养时间为7 d左右。
2.1.2 斜面传代次数对菌体生长及产素能力的影响
菌种在传代过程中，DNA复制会引起基因突变而导致
菌种发生衰退。 将刺糖多孢菌分离纯化的单菌落，挑至斜
面，30 ℃培养7 d，即第1代斜面；转接培养得第2代斜面，共
传4代。 将不同传代次数的斜面孢子接入种子培养基，培
养48 h后，接种发酵培养基，余下种子液按1.4.3测定生物
量。 观察不同传代次数的刺糖多孢菌斜面的孢子及菌落
特征，研究不同传代次数的孢子对转种后菌体生物量、发
酵效价的影响，结果见表2。
表2 斜面传代次数对菌体生长及产素能力的影响
传代 斜面孢子特性 种子液 发酵液中
次数 孢子量 孢子颜色 菌苔厚度 生物量/(g·L-1) 相对效价/%
第1代 ++++ 粉红色 ### 1.32±0.11 100
第2代 ++++ 微粉红色 ### 1.13±0.13 89.2±1.3
第3代 +++ 白色 ## 0.90±0.13 63.3±2.0
第4代 + 白色 # 0.61±0.13 42.1±2.5
注：++++表示孢子量多，+++表示孢子量一般，+表示孢子量较少；###表示
菌苔湿度良好，##表示菌苔较干燥，#表示菌苔干瘪。
表2结果表明：随着传代次数的增加，斜面上孢子量降
王子宝，等：刺糖多孢菌生长特性及移种标准
496 第51卷农 药 AGROCHEMICALS
低，在菌苔表面出现针眼状无孢子空斑，传至3代后，孢
子量严重下降，孢子颜色趋于苍白色，空斑现象严重，种
子液中生物量下降54%。 发酵结果显示刺糖多孢菌传代
次数与合成多杀菌素的能力呈负相关，随着传代次数的
增加，孢子数量及质量下降，从而导致合成多杀菌素能力
下降，由此说明刺糖多孢菌需要不断进行分离纯化工作。
因此，后续研究均选择分离纯化至单菌落的第1代斜面作
为出发菌种。
2.1.3 刺糖多孢菌斜面移种标准
综合斜面菌龄、斜面传代次数对刺糖多孢菌生长及产
素能力的影响，确定刺糖多孢菌斜面移种标准：经平板分
离纯化后的单菌落移种第1代斜面，30 ℃恒温培养7 d左右，
菌苔孢子量丰满，呈粉红色，湿度良好。
2.2 刺糖多孢菌二级种子培养条件对菌体生长及产素
能力的影响
2.2.1 溶氧和剪切力对菌体生长及产素能力的影响
刺糖多孢菌是好氧菌，氧气是必不可少的生长条件，
振荡与搅拌可以增加种子液中的溶解氧；刺糖多孢菌又为
丝状菌，振荡与搅拌可以增加液体的剪切力，适当的剪切
力可导致种子液菌丝球变小，增加生长萌发点。 在种子培
养基中分别添加30、50、70粒玻璃珠和采用增氧瓶，以增加
剪切力和溶氧。 30 h后镜检菌丝形态，并接种发酵培养基，
发酵7 d后测定多杀菌素的效价，余下的种子液测定生物
量、还原糖、氨基氮、pH值等代谢参数，结果见图1。
图2 温度对刺糖多孢菌生长及代谢的影响
图2表明：30 ℃培养时，生物量和多杀菌素效价均达
到最高；当温度大于33 ℃时，随着温度升高，虽然糖耗与
pH值变化不大，但氨基氮和菌体量不断下降。 镜检显示当
培养温度达36 ℃，菌丝体断裂现象显著，菌丝变细，菌丝
团数量骤减，这表明温度高于36 ℃，菌体内酶活性受到
影响，细胞代谢功能下降，从而导致菌体生长受抑制。
综合菌体生长代谢参数和发酵效价，液体种子的最适
培养温度为30 ℃。
2.2.3 初始pH值对菌体生长及产素能力的影响
pH值影响菌体内各种酶活性的同时也影响菌体对基
质的吸收和利用，从而改变菌体代谢速度，影响菌体生长。
将刺糖多孢菌接种于不同初始pH值条件下培养，30 h后镜
检菌丝形态，并接种发酵培养基，发酵7 d后测定多杀菌素
的效价，余下种子液测定生物量、还原糖、氨基氮、pH值等
代谢参数，结果见图3。
图1 溶氧和剪切力对刺糖多孢菌生长及代谢的影响
图1表明：种子培养过程中添加30粒玻璃珠，对菌体生
物量的影响不显著，但还原糖消耗增加，多杀菌素效价略
有增加。 镜检显示玻璃珠或增氧瓶对菌丝体具有分散作
用，但未产生强烈的断裂作用，菌丝粗细相当，这表明菌丝
对剪切力具有较强的耐受力。 因此，添加少量玻璃珠可以
增加剪切力而有助于菌丝分散，菌丝球变小，生长点增多，
更有利于营养吸收与代谢，这样的种子进入发酵阶段，产
量更高。 添加70粒玻璃珠或增氧瓶时，由于剪切力过大，导
致菌体生长受限，生物量明显降低，说明溶氧过高或剪切
力过大，对菌体形态虽无明显破坏，但对菌体的代谢影响
显著。 综合菌体生长代谢参数及发酵效价，种子瓶中添加
30粒玻璃珠为佳。
2.2.2 温度对菌体生长及产素能力的影响
温度能显著影响菌体内各种酶的活性，进而影响菌体
的生长速率及细胞得率。 将刺糖多孢菌种子液于不同温
度下振荡培养，30 h后镜检菌丝形态，并接种发酵培养基，
发酵7 d后测定多杀菌素的效价，余下种子液测定生物量、
还原糖、氨基氮、pH值等代谢参数，结果见图2。
图3 初始pH值对刺糖多孢菌生长及代谢的影响
图3表明：种子培养基的初始pH值对菌体生长以及发
酵产素均有较大影响，在中性微碱范围内，随着pH值升高，
生物量和相对效价均随之升高，当初始pH值为8.5时，生物
量和效价均达到最大值，pH值大于9.0时，菌体生长受到影
响。 镜检结果表明：不同pH值下菌丝形态无显著差异，这
说明pH值的改变，影响菌体生长但对菌丝形态影响不大。
综合菌体生长代谢参数及发酵效价，种子培养基最佳
初始pH值
温度/℃
第7期 497
初始pH值为8.5。
2.3 刺糖多孢菌液体种子生长特性
2.3.1 一级种子生长代谢特性
采用标准斜面菌种移种，定时测定刺糖多孢菌在种子
培养基中振荡培养的生物量、氨基氮、还原糖等生长代谢
参数，并镜检观察菌丝形态。 结果表明：培养10 h后氨基氮
迅速上升，说明菌体中蛋白酶等氮源利用系统启动，代谢开
始旺盛；培养36 h后，生物量直线上升，还原糖快速下降，氨
基氮上升速率趋于平缓，说明菌体进入对数生长期，镜检
显示：菌丝长而粗壮、分叉多、交织呈网状；培养54 h后，还
原糖、氨基氮均迅速下降，但生物量趋于平衡，说明菌体生
长进入稳定期，因此一级种子培养时间以44~48 h为佳。
2.3.2 二级种子生长代谢特性
为控制接入发酵液时种子的各项质量指标，以2.1.3
确定的标准斜面菌种接入一级种子培养基，按2.3.1获得
的一级标准种子接入二级种子培养基培养，定时取样，镜
检并测定二级种子生长代谢参数，结果见图4。
pH值改变幅度在0.5左右；氨基氮先快速上升后下降；还
原糖、总磷一直呈下降趋势；菌体在20~40 h之间均处于
对数生长期。
2.4.1 生物量
由图1~3可见：二级种子液中生物量与发酵液中多
杀菌素的效价呈正相关。 综合图1~4，二级种子移种标
准之一：生物量大于1.4 g/L。
2.4.2 氨基氮
由图4可见：氨基氮先于生物量迅速增加，种子培养基
中的氨基氮来源于蛋白胨和酵母膏，当氨基氮达到最高
值时，它是体内分解代谢最旺盛时期，菌体生长速率也达
到最大值，综合图1~4，二级种子移种标准之二：氨基氮在
75~80 mg/L左右。
2.4.3 还原糖
菌体干重的50%是碳，碳源的消耗是菌体生长代谢最
直接的表征，综合图1~4，二级种子移种标准之三：还原糖
小于7 g/L。
2.4.4 pH值
由图4可见：刺糖多孢菌种子培养过程中，pH值先上升
后下降，二级种子移种标准之四：pH值一次回落后低于7.5。
2.4.5 种龄
种龄是发酵工业中种子生长状况的重要指标，由图4
可见刺糖多孢菌二级种子在20~40 h处于对数生长期，生
长代谢旺盛，结合图1~4及表3，二级种子移种标准之五：种
龄为30~36 h左右。
表3 刺糖多孢菌二级种子种龄对产素的影响
种子生长代谢参数 发酵液中种龄/h
生物量/(g·L-1) 氨基氮/(g·L-1) 还原糖/(g·L-1) pH值 相对效价/%
24 0.89 76.2 7.51 7.54 100
28 1.23 78.5 7.32 7.79 110.5±1.2
32 1.49 79.3 7.05 7.48 126.2±0.8
36 1.77 75.4 6.88 7.42 117.2±1.4
40 1.82 72.3 6.35 7.31 109.7±0.7
2.5 标准菌种对产素稳定性的影响
采用2.1.3确定标准斜面菌种，2.3.1确定的一级种子
移种标准，2.4确定的二级种子移种标准，保持发酵培养工
艺一致，进行5批摇瓶发酵验证实验。 对应的5批二级种子
生理状态及生化参数指标均符合2.4确定整套移种标准，采
用新移种标准，5批发酵液中多杀菌素相对效价分别为100%、
(103.2±1.3)%、(101.7±0.4)%、(99.8±1.1)%、(104.2±1.3)%，较
初始产量提高58.5%，且不同批次间产量差异小于5%，稳定
性良好，因此该标准能为产业化奠定良好的基础。
3 展望
在发酵工业中，优质的种子是获得理想发酵水平的前
图4 刺糖多孢菌二级种子生长代谢曲线图
图4表明：1)在菌体生长初期，生物量与氨基氮的增长
呈正相关，菌体先对有效氮源进行快速分解，随之菌体进
入迅速生长期。 20 h后，氨基氮上升速率减慢，而糖耗速率
逐渐加快，伴随着菌体进入对数生长中期。 32 h后，氨基氮
开始下降，还原糖继续下降，菌体进入对数生长后期。 48 h
后，氨基糖、还原糖、磷、pH值均快速下降，菌体生长进入
生长稳定期，最终碳源成为菌体生长的限制因素。
2)在0~32 h，氨基氮生成速率快速增长，还原糖消耗速
率相对较慢，致使pH值快速上升，说明菌体在快速分解有
机氮源导致氨基氮迅速上升的同时，也为菌体提供了大量
的非还原性碳源；32 h后，可分解的有机氮源已耗尽，氨
基氮呈下降趋势，糖耗速率增加，有机酸生成速率加快，
使pH值一直呈下降趋势。
3)生物量与磷耗呈正相关，菌体生长过程中，磷浓
度一直呈下降趋势，当菌体进入稳定期，种子液中的磷源
仍然相当充裕，因此，种子培养基中磷源并非菌体生长的
限制因素。
2.4 刺糖多孢菌二级种子移种标准
由2.3.2可知：在刺糖多孢菌二级种子生长过程中，
王子宝，等：刺糖多孢菌生长特性及移种标准
498 第51卷农 药 AGROCHEMICALS
提。 通过对刺糖多孢菌斜面及液体种子培养条件、生长特
性的研究，优化了菌种培养工艺，并建立了液体种子移种
标准。 采用标准种子移种，在标准发酵工艺下不同批次间
的产量稳定性良好。 由于本研究仅优化了种子培养条件，
若对发酵培养基进一步优化，建立标准菌种及标准生产工
艺，发酵产量及稳定性将进一步提高。
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