全 文 ：第 27卷 第 3期
2006年 7月 　　　　　　　　　　
华南农业大学学报
Journa l o f South China Agricultural University
　　 　　　　　　　　Vo.l 27, No. 3
Ju.l 2006
　收稿日期:2005-11-07
　作者简介:张竞立(1980-), 男 ,硕士研究生;通讯作者:徐汉虹(1961-), 男 ,教授 , 博士 , E-ma il:hhxu@ scau. edu. cn
刺糖多孢菌分批发酵动力学研究
张竞立1 ,钱曙光 2 ,廖美德 1 ,侯学文3 ,徐汉虹 1
(1农药与化学生物学教育部重点实验室 ,华南农业大学 昆虫毒理研究室 ,广东 广州 510642;
2华南农业大学 理学院 , 广东 广州 510642;
3华南农业大学 生命科学学院 ,广东 广州 510642)
摘要:利用摇瓶培养试验研究了刺糖多孢菌 Saccharopolyspora spinosa的分批培养过程中生物量 、培养液 pH、葡萄糖
消长 、多杀菌素含量等因素的变化规律。利用 MATLAB软件对试验数据进行非线性回归 ,拟合出了细胞生长动力
学模型 、基质消耗动力学模型和产物生成动力学模型 , 得到了细胞生长量 、残糖量 、多杀菌素产量在发酵过程中随
时间变化的规律 , 相关系数分别为 0. 989 34、0. 992 66和 0. 986 35. 拟合曲线 95%置信度区间分析的结果表明 ,该
模型能够很好的反映出刺糖多孢菌分批发酵的过程.
关键词:刺糖多孢菌;多杀菌素;发酵动力学模型;拟合
中图分类号:TQ920. 6　　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-411X(2006)03-0051-04
Study on the Form entation K ineticM odels of
Saccharopolyspora spinosa
ZHANG Jing-li1 , Q IAN Shu-guang2 , LIAO M ei-de1 , HOU Xue-wen3 , XU H an-hong1
(1 Key Lab of Pe sticide and Chem ica l B io logy, M inistry of Education, Lab o f Insect Toxico logy,
South China Agr ic. Un iv. , Guangzhou 510642, China;
2 Co llege of Science, South Ch ina Ag ric. Univ. , Guang zhou 510642, Ch ina;
3 Co llege o f Life Sc ience, South China Ag ric. Un iv. , Guangzhou 510642, China)
Abstract:An expe rimentw as conducted, fo rSaccharopolyspora spinosa in the changes of biomass, resid-
ual carbohydrate content, sp inosad conten t, the pH va lue in the cultu ra lmedium by the shak ing flash. The
k inetic mode ls o f batch fe rmenta tion by S. spinosa for biom ass, substrate consumption and spinosad p ro-
duc tion w ere studied. Themode ls we re fitted and provided a usefu l aqua tion for biomass, substrate con-
sumption and spinosad production. And the parame ters of the models w ere obtained by using non-linear
regretssion techniques simu lated byMATLAB so ftw are. The temporal regulations of b iomass, residual car-
bohydrate, spinosad contentw ere go tten in the ba tch fe rmention. The corre lation coefficients o f themode ls
w ere 0. 989 34、0. 992 66、0. 986 35 respec tively. The fitted models could ref lect the ba tch fermen tation
process o fS. spinosa.
Key words:Saccharopolysora spinosa;spinosad;the mode l of fermen tation kine tics;fit
　　刺糖菌素 ,又名多杀菌素 (spinosad),由放线
菌刺糖多孢菌 Saccharopoly spora spinosa发酵生产.
经活性鉴定 ,发现多杀菌素对鳞翅目 、双翅目 、缨
翅目 、鞘翅目及膜翅目害虫具有较好的生物活性 ,
且对蓟马和小菜蛾高效. 因其低毒 、低残留 、对天
敌安全 、对哺乳动物和环境无毒害 、分解快等优点
而获得美国 “总统绿色化学品挑战奖 ” [ 1] . 多杀菌
素是天然生成的代谢物 ,类似良性生物制品 ,是一
种主要由 2种非常活跃的天然存在代谢物所组成
的混合物 ,这 2种物质分别是多杀菌素 A和多杀
菌素 D. 经结构鉴定 ,属于大环内酯类抗生素 [ 2] .
由美国陶氏公司开发的 w =2.5%的悬浮剂 (商品
名:菜喜 )和 w =48%的悬浮剂 (商品名:催杀 ),
已获得我国农药的临时登记 ,分别用于防治甘蓝
的小菜蛾和棉花的棉铃虫 , 而在国内现无生产厂
家 [ 3] . 目前国外关于刺糖多孢菌的研究大多集中
在多杀菌素的杀虫作用机理 、构效关系和编码基
因等方面 ,国内的相关研究起步较晚 ,主要集中在
高产菌株的筛选和培养条件的优化方面 [ 4-6] ,而有
关刺糖多孢菌代谢变化的报道较少. 本文利用摇
瓶培养试验 ,对刺糖多孢菌的生长特性和发酵动
力学进行了研究.
1　材料与方法
1. 1　菌种
放线菌刺糖多孢菌 Saccharopolypora spinosa (菌
株号:NRRL 18395,华南农业大学昆虫毒理研究室保
存菌种 ).
1. 2　培养基
固体培养基:牛肉膏 1.0 g,葡萄糖 10.0 g,胰蛋
白胨 2.0 g,酵母粉 1.0 g,琼脂 15.0 g,水 1 000mL,
pH 7.0. 种子培养基与发酵培养基:酵母粉 1.0 g,葡
萄糖 1.0 g,水 100 mL, pH 7.0.
1. 3　培养方法
将斜面培养基上的孢子置于种子培养基中 ,震
荡过夜使孢子均匀分散. 将分散后孢子悬浮液接入
装有 50mL发酵培养基的 500mL三角瓶中 ,于 28 ℃
摇床振荡(150 r /m in)培养 11 d,每 24 h取样测定生
物量 、培养液 pH、葡萄糖消长 、多杀菌素含量[ 4, 7] .
1. 4　多杀菌素 A和多杀菌素 D的提取
将培养液离心 ,分别收集培养液和菌体 ,并分别
用 50和 40mL的乙酸乙酯萃取上清液 2次 ,减压蒸馏
萃取液 ,蒸干后用丙酮溶解并定容至 5mL,即为多杀
菌素 A和多杀菌素 D的粗提物 ,于 4℃保存备用[ 5-6] .
1. 5　多杀菌素 A和多杀菌素 D的检测
使用高效液相色谱监测多杀菌素 A和多杀菌素
D的产量变化 [ 8] . 高效液相色谱的分析条件为:
20RBAX Ec lipse XDB-C18 4.6×250.0 mm色谱柱 ,
流动相 V甲醇∶V乙腈∶V水 =45∶50∶5(含 ρ=0.05 g /L的
乙酸钠 ), 检测波长 250 nm , 进样量 20 μL, 流速
1.0mL /m in.
1. 6　培养液中可溶性总糖的测定
采用葱酮试剂法测定 [ 9] .
1. 7　生物量的测定
采用干菌丝质量法测定.
1. 8　模型确定
运用 MATLAB软件工具进行非线性拟合[ 10] .
2　结果与分析
2. 1　多杀菌素发酵过程代谢变化
培养过程中生物量 、培养液 pH、葡萄糖消长 ,多
杀菌素含量测定结果统计如图 1所示. 从图 1可以
看出菌体生长的 4个时期:1 ～ 3 d为停滞期 ,孢子逐
渐适应新的生长环境;4 ～ 7 d,菌体大量合成相关的
消化酶 ,将培养液中的养分吸收 ,菌体进入对数生长
期 ,培养液中菌体大量生长 ,生物量和多杀菌素几乎
同步增长 ,多杀菌素增长稍滞后 1 d;7 ～ 10 d是菌体
的平衡期 ,这一时期是菌体次生代谢产物的主要形
成期;第 10 d后 ,培养液中的营养消耗殆尽 ,菌丝开
始自溶 ,生物量明显降低 ,菌体进入衰亡期. 随着生
物量的增长 ,总糖浓度迅速减小 ,在 8 d后浓度稳定
在 4.2mg /mL. 从图 1 b的 pH变化趋势来看 ,前 3 d
的 pH逐渐下降 ,在停滞期末期达最小值 5.25,恰好
是菌体将要大量消耗培养液中的碳源和氮源 ,并可
能产生某些酸性物质使 pH下降 ,之后呈上升趋势 ,
可见 ,在弱酸性环境下 ,有利于激活有关酶系 ,促进
碳源和氮源的利用 ,因此在菌体生长期可将培养液
的 pH控制在弱酸条件中 ,利于菌体的生长.
图 1　刺糖多孢菌的发酵曲线
F ig. 1　The cu rve of ferm entation process of S. spinosa
52 　　 华　南　农　业　大　学　学　报　　　 第 27卷　
2. 2　刺糖多孢菌的发酵动力学模型的构建
由于菌体的存活期等诸多因素的影响 ,发酵过
程通常采取分批的操作方式. 分批发酵动力学模型
的建立 ,对发酵过程工艺条件的研究 、反应过程操作
的优化和控制具有重要意义和实用价值. 分批发酵
动力学模型通常包括菌体生长动力学模型 、产物生
成动力学模型和底物消耗动力学模型. 目前 ,国内外
生化工程学者所构建的模型大多应用数学拟合模
型 ,数学拟合模型建模较为简便 ,易于分析验证和实
现计算自动化[ 11] .
2. 2. 1　细胞生长动力学模型 [ 12]的构建　Log istic模
型是一个典型的 S型曲线 ,能较好地反映分批发酵
过程中菌体生长规律 ,因此本文采用该模型来描述
菌体细胞的生长 ,即
μ=dx /dt=μm ax(1 -x /xmax), (1)
式中 ,变量 x表示菌体生长量 , μ表示菌体的生长速
率. 初始条件 t=0时 , x =x0. μm ax可根据试验数据用
最小二乘法拟合而得 , xmax由试验测得 ,两者均为常
数. 方程(1)的积分式为
x(t)=x0 exp(μm ax t) /
{1 - (x0 /xmax)[ 1 - exp(μm ax t)] }, (2)
根据试验数据 xmax =0.153 0和方程 (2),结合试验
数据进行非线性回归后得到分批发酵过程中菌体生
长的动力学模型
x(t)=9.979 8×10-5 exp(8.592 5×10- 3 t) /
{1 -6.521 9×10- 4 [ 1 - exp(8.592 5×10-3 t)] },
(3)
模型方程的相关系数为 0.989 34,在图 2中 ,中间的
实线代表拟合的菌体生长曲线 ,两条虚线代表置信
度为 95%时全局性置信区间. 可以看出实线所表示
的预测曲线的拟合效果良好 ,所选择的模型完全反
应了刺糖多孢菌的生长情况.
图 2　菌体生产模型拟合曲线
F ig. 2　The fitting curve o f the grow th of S. spinosa
2. 2. 2　多杀菌素生成动力学模型　从图 1刺糖多
孢菌的发酵曲线中可以观察到多杀菌素的合成与菌
体的生长具有同步性 ,并且在菌体生长结束后 ,能继
续合成多杀菌素 ,显然多杀菌素的发酵属于部分生
长偶联型. 因此可以选用经典的产物生成动力学模
型 , 即 Leudeking-p ire t模型
dp /dt=αdx /dt+βx, (4)
方程(4)中变量 p表示多杀菌素的产量 , αdx /dt表
示与菌体生长率相关的产物形成率 , βx表示非伴随
菌体生长的产物形成率 , α、β均为常数 ,可根据试验
数据拟合求得. 将方程(1)代入 (4),积分得到
p(t)=p0 +α[ x(t) - x0 ] +
(β xm ax /μm ax) ln{1 - (x0 /xm ax)[ 1 - exp(μmax t)] },
(5)
当 x =xm ax时 ,可以得到 β值 , β =0.329 1;其中 μmax、
xmax、x0值均已知 , p0 =0;以 p(t)对 x(t) - x0作图 ,直
线斜率即为 α值 , α=2.659 3. 结合试验数据进行非
线性回归后得到分批发酵过程中产物多杀菌素合成
的动力学模型
p(t)=2.659 3[ x(t) -9.979 8×10- 5 ] +
5.86 ln{1 -6.521 9×10- 4 [ 1 - exp(8.592 5×10- 3 t)] },
(6)
模型方程(6)的相关系数为 0.986 35,由图 3可以看出
实线所表示的预测曲线的拟合效果良好 ,较好的反应了
多杀菌素的合成情况 ,方程(6)中的 β值较大 ,恰好证明
了多杀菌素的发酵属于部分生长偶联型的初始假设.
图 3　多杀菌素合成模型拟合曲线
F ig. 3　The fitting curve o f spino sad fo rm ation
2. 2. 3　基质消耗动力学模型的构建　通过分析多
杀菌素的生物合成路线 ,可以看出多杀菌素的糖苷
配体部分属于聚酮结构 ,是由丙酸按 A-A-P-A-A-A-
A-A-A-A(A:乙酰;P:丙酰 )的顺序添加 10个酰基
缩合而成的 ,而丙酸是通过糖代谢得到的. 多杀菌素
A和多杀菌素 D的糖基为 NDP-二甲基-福乐糖胺和
6-胶氧-L-鼠李糖 ,也是由葡萄糖在相关酶的作用下
53　第 3期 　　　　　张竞立等:刺糖多孢菌分批发酵动力学研究 　　　
得到[ 13] . 因此在以葡萄糖作为碳源的多杀菌素发酵
中 ,建立起总糖的消耗动力学模型是非常必要的. 常
用的基质消耗动力学模型为
- ds /dt=k1(dx /dt)+k2(dp /dt)+k3x, (7)
式中:变量 s表示总糖含量;k1表示碳源用于菌体生
长的得率常数;k2表示碳源用于产物积累的得率常
数;k3表示微生物碳源的维持常数 ,由于菌体呼吸所
需的基质量较小 ,因此可归至菌体生长消耗中. 故方
程 (7)可以简化后积分为
s(t)=s0 - k1 x(t) -k2p(t), (8)
将菌体生长动力学模型方程 (3)和产物合成动力学
模型方程(6)代入方程 (8),经非线性回归后得到分
批发酵过程中基质消耗动力学模型:
s(t)=0.013 1 -0.057 54x(t) -
9.579 6×10-5p(t), (9)
模型方程的相关系数为 0.992 66,从图 4可以看出
实线所表示的预测曲线的拟合效果良好 ,很好的反
映了培养液中总糖消耗的变化趋势.
图 4　基质消耗模型拟合曲线
F ig. 4　The fitting curve o f substrate consum ption
3　结论
通过对刺糖多孢菌培养中菌体生物量的变化 ,
培养液 pH的变化 、碳源消耗情况 、多杀菌素产量变
化的测定 ,得到了菌体生长中 4个周期的具体时间 ,
并且得出弱酸条件有利于菌体生长的结论 , 从多杀
菌素产量的变化曲线可以看出 ,多杀菌素的合成属
于部分生长偶联型.
利用 MA TLA B软件 , 根据 Log istic模型和
Leudeking-piret模型对菌丝量 、残糖量 、多杀菌素产
量进行了非线性回归 ,得到了细胞生长动力学模型 、
多杀菌素生成动力学模型 、基质消耗动力学模型 ,相
关系数分别为 0.989 34、 0.986 35、0.992 66. 结合
95%置信度区间分析 , 3个动力学方程基本反映了刺
糖多孢菌的发酵过程 ,可以为工业生产提供参考.
参考文献:
[ 1] 　杜顺堂 , 朱明军 ,梁世中. 生物农药多杀菌素的研究进
展 [ J] . 农药 , 2005, 44(10):441-444.
[ 2] 　李如 , 汪清民 ,黄润秋 . 多杀菌素的研究进展 [ J] . 农药
学学报 , 2003, 5(2):1-12.
[ 3] 　V INCENT L, SALGADO L, JOEL J, et a.l S tud ie s on the
m ode o f ac tion of spino sad:The in te rnal effec tive concen-
tration and the concentration dependence o f neural exc ita-
tion[ J] . Pe sticide Biochem is T ry and Physio logy, 1998,
60:103-110.
[ 4] 　陈晓霞 , 郭聆讯 ,张宇锴 ,等. 新型杀虫剂 Spino sad发酵
工艺的研究 [ J] . 微生物学通报 , 2002, 29(5):21-25.
[ 5] 　李福. 刺糖菌素产生菌的菌种选育及发酵条件优化研
究 [ D] . 杭州:浙江工业大学药学院 , 2004.
[ 6] 　张苑. 多杀菌素高产菌种的推理选育和发酵工艺的优
化 [ D] . 杭州:浙江大学材料与化工学院 , 2004.
[ 7] 　GREASHAM R, INAM INE E. Nutritional im provement of
processe s[M ] ∥ARNOLD D, JUL IAN E D. M anua l o f In-
dustria l M icrob io logy and B iotechno logy. W ashing ton:A-
m erASM Press, 1999:59-63.
[ 8] 　聂果 , 王广成 , 张忠明 , 等. 多杀菌素高效液相色谱分
析 [ J] . 农药科学与管理 , 2003, 24(8):6-8.
[ 9] 　侯学文. 悬浮玫瑰茄细胞的生长及泛醌合成的代谢调
控 [ D] . 广州:华南理工大学食品与生物工程学院 ,
1998.
[ 10] 马雷. 应用 MATLAB软件构建谷氨酸温度敏感突变株
补料分批发酵动力学模型 [ J] . 天津科技大学学报 ,
2004, 19(1):36-38.
[ 11] 王岁楼 , 李志. 微生物动力学模式及在工业发酵中的应
用 [ J] . 工业微生物 , 1995, 25(1):30-40.
[ 12] 熊晓辉 , 张李李 ,韦策. 固体发酵生产 M onaco lin K的动
力学模型 [ J] . 工业微生物 , 2003, 33(4):27-31.
[ 13] 苏建亚 , 沈晋良. 多杀菌素的生物合成 [ J] . 中国生物
工程杂志 , 2003, 23(5):55-73.
【责任编辑　李晓卉】
54 　　 华　南　农　业　大　学　学　报　　　 第 27卷