全 文 ：基金项目：国家自然科学基金 (No. 31300092)和粮食公益性行业科研专项(No. 201313002-3)
收稿日期：2014-08-018 接受日期：2014-08-27
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2014, 22(11): 1337~1346
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.11.003
刺糖多孢菌高产菌株和野生型菌株多杀菌素生物合成基因簇(spn)在
发酵过程中的表达分析
黄颖 1，2，3 赵晨 1 杨博磊 1 陈园 1 关雄 2 宋渊 3 张晓琳 1*
1国家粮食局科学研究院，北京 100037；2福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州350002；3中国农业大学生物学
院微生物学系，北京 100193
*通讯作者，zxl@chinagrain.org
摘 要 多杀菌素(spinosad)作为一种高效、低毒生物杀虫剂，已在农药、兽药、卫生用药等领域得到应
用。中国关于多杀菌素的研究起步较晚，进展缓慢，目前仍无法实现产业化生产。本研究旨在分析刺糖
多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)高产菌株ASAGF73与野生型菌株ATCC49460在发酵过程中多杀菌素
合成基因簇(spinosyn biosynthetic gene cluster, spn)的表达变化及差异，初步判断影响多杀菌素合成的关
键限速步骤。生物信息学分析表明，spn基因簇含有 9个转录子，分别在各转录子中设计引物，进行RT-
PCR检测其表达情况。结果显示，突变株ASAGF73中多杀菌素的产量提高可能与 spn基因簇中部分基
因的高表达有关，其中编码聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)的基因和参与大环内联桥形成的基因表达
量远高于野生型菌株的。在ASAGF73中编码鼠李糖转移酶的 spnG基因在发酵前期过量表达，而在后期
大量合成多杀菌素时表达减弱，有可能成为多杀菌素合成的限速步骤。本研究初步阐明能够提高多杀菌
素产量的分子机制，为构建多杀菌素高产基因工程菌提供参考。
关键词 多杀菌素，刺糖多孢菌，多杀菌素合成基因簇(spn)，基因表达
Expression Analysis of Spinosad Biosynthetic Gene Cluster(spn) in
Hyperproducing and Wild-type Saccharopolyspora spinosa Strains During
Fermentation
HUANG Ying1,2,3 ZHAO Chen1 YANG Bo- Lei1 CHEN Yuan1 GUAN Xiong2 SONG Yuan3
ZHANG Xiao-Lin1*
1 Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China; 2 Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of
Education, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 3 Department of Microbiology, College of Biological Sciences,
China Agricultural University, Beijing 100193, China
* Corresponding author, zxl@chinagrain.org
Abstract Spinosad is a kind of bio-insecticide showing advantages such as high-efficiency and low-toxicity,
which is wildly used in pesticide, veterinary drug, sanitary field, etc. However, industrial production of
spinosad still has not been implement in China, because of relatively late and undeveloped study on spinosad
high- yield strain breeding and relative fermentation process. Previously, a spinosad high- yield strain,
Saccharopolyspora spinosa ASAGF73, was obtained through multiple rounds mutagenesis. In this study, we
focused on analysing spinosyn biosynthetic gene cluster(spn) expression profile and comparing the difference
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
0 引言
多杀菌素(spinosad)为土壤放线菌刺糖多孢菌
(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵产生的次
级代谢产物，具有高效杀虫活性(Broughton et al.,
1997; Thompson et al., 2000; White et al., 2007;
Cueto et al., 2006）。多杀菌素为大环内酯类结构，
其母环C9和C17位上分别连有鼠李糖和福乐糖
胺，根据C6和鼠李糖基上携带基团的不同而被分
为不同组分，A和D组分为主要活性成分，其中A
组分占 80% ~95% (Kirst et al., 1992; Sparks et al.,
2001; Mynderse et al., 1998)。多杀菌素的杀虫机制
是通过作用于昆虫的神经系统，致其非功能性的肌
肉收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹，最终导致死亡
(Raymond et al., 2005; Millar, Denholm, 2007)。目
前发现对鳞翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)
和缨翅目(Thysanoptera)等多种害虫具有极强的杀
虫活性 (Semiz et al., 2006; Musser, Shelton, 2005;
Jones et al., 2005; Marina et al., 2014)。多杀菌素具
有作用靶标专一性和对哺乳动物无毒害作用等优
点，被认为是一种高效、绿色的杀虫剂(Holt et al.,
2006; Cleveland et al., 2001)。美国环保局(EPA)于
2005年批准多杀菌素用于储粮防护剂，欧盟于
2008年批准多杀菌素用于有机作物。多杀菌素在
中国具有广阔的应用前景，作为生物农药可用于大
田害虫控制和储粮害虫防治。然而，目前多杀菌素
的生产一直被美国陶氏益农公司所垄断，中国在这
方面研究起步较晚，且进展缓慢，关于多杀菌素高
产菌株的选育和发酵工艺仍处于实验室研究阶段。
传统的物理、化学诱变是提高微生物代谢产物
产量的有效方法，本实验室前期通过对刺糖多孢菌
进行物理、化学交替诱变，获得多杀菌素高产突变
株ASAGF73(陈园等, 2013)。但诱变方法存在盲目
性、筛选工作量大等问题，通过分子生物学的方法
可以更理性地向提高产量的方向改造目的菌株。
刺糖多孢菌全基因组测序已经完成 (Pan et al.,
2011b)，多杀菌素合成途径也已被基本阐明(Mad-
duri et al., 2001a; Waldron et al., 2000)。在近 80 kb
的多杀菌素生物合成基因簇(spinosyn biosynthetic
gene cluster, spn)内含有一个Ⅰ型聚酮合酶
(polyketide synthase, PKS)的编码基因，由 spnA、
spnB、spnC、spnD和 spnE基因组成，负责合成多杀
菌素的大环结构；基因簇内还有负责大环内交联基
因(spnF、spnJ、spnL和 spnM)(Kim et al., 2007)，鼠李
糖转移和修饰基因(spnG、spnK、spnI和 spnH)(Isi-
orho et al., 2012; Chen et al., 2009; Huang et al.,
2008)，福乐糖胺的合成及转移基因(spnN、spnO、
spnQ、spnR、spnS和 spnP) (Hong et al., 2008; Hong
et al., 2006; Zhao et al., 2005)。负责鼠李糖合成的
基因 gtt、gdh/kre和 epi不在该基因簇内，而是位于
染色体3个不同位置(Madduri et al., 2001b)。目前，
尚未有多杀菌素生物合成调控基因的相关报道。
相关研究表明，通过增加多杀菌素合成相关基
因拷贝数，即增强多杀菌素生物合成基因簇内某些
基因的表达水平可提高菌株的多杀菌素产量(Pan
et al., 2011a; Tang et al., 2011)。冯晓洲等(2013)对
刺糖多孢菌 NRRL18395中多杀菌素生物合成基因
簇的启动子的分布情况及其转录时序特征进行了
between wide- type strain ATCC49460 and high- yield ASAGF73 during fermentation process, and
preliminarily elucidated the rate-limiting step for spinosad synthesis. Bioinformatic analysis revealed that spn
gene cluster contained 9 transcripts, and their expressions were detected using RT-PCR with primers designed
inside each transcript. The results showed that the high production of ASAGF73 strain could be due to the
high expression of some transcripts in spn cluster, the expression of genes coding for polyketide synthase
(PKS) and cross- bridging in ASAGF73 was higher than those in ATCC49460. spnG, which coded
rhamnosyltransferase, showed high expression in ASAGF73 strain at the beginning of the fermentation but
decreased to a quite low level later, which was not ideal for spinosad high production and might be the rate-
limiting step for spinosad synthesis. The present study was the comprehensive and comparative expression
analysis of spinosad biosynthetic gene cluster and genes for rhamnose biosynthesis in the 2 S. spinosa strains
during fermentation, provided some clues to understand the molecular mechanisms which can lead to the
increasing of spinosad production yield.
Keywords Spinosad, Saccharopolyspora spinosa, Spinosyn biosynthetic gene cluster(spn), Gene expression
1338
分析，但缺乏对高产菌株相关数据的分析，因此，无
法解释高产菌株产素能力的提高在分子层面上的
原因，对高产菌株的分子改造和发酵工艺优化也无
指导意义。因此，了解多杀菌素高产菌株与野生型
菌株在发酵过程中各个时期与多杀菌素生物合成
直接相关的基因转录水平，并对菌株间的差异进行
比对分析显得尤为重要。本研究旨在通过对刺糖
多孢菌野生型菌株 ATCC49460和高产突变株
ASAGF73在发酵过程中 spn基因簇，及鼠李糖合成
基因的表达变化进行分析和对比，初步确定影响多
杀菌素合成的主要限速步骤基因，为下一步在
ASAGF73的基础上构建多杀菌素高产基因工程菌
提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
刺 糖 多 孢 菌 (Saccharopolyspora spinosa)
ATCC49460购自于中国普通微生物菌种保藏管理
中心(CGMCC)，高产突变株ASAGF73由国家粮食
局科学研究院发酵生物技术组选育和保藏，培养基
及培养条件按照陈园等(2013)进行。
1.2 方法
1.2.1 刺糖多孢菌总RNA的提取
取 2 mL发酵液，5 000 r/min 4 ℃离心 15 min，
弃去上清，加入 600 µL预冷的生理盐水，重悬细
胞，再次5 000 r/min 4 ℃离心20 min，弃去上清，加
入 200 µL焦碳酸二乙酯(DEPC)水和 400 µL酸酚
进行悬浮，加入 300 µL玻璃珠，置于球磨仪中
1 800 r/min震荡30 min。14 000 r/min 4 ℃离心10
min，将水相转移到一个新的1.5 mL离心管，加入1
mL TRIZOL剧烈混匀 15 s，室温放置 5 min。加入
预冷的 200 µL氯仿，剧烈混匀 15 s，室温放置 3
min。12 000 r/min 4 ℃离心 15 min，将水相转移到
一个新的 1.5 mL离心管。加入 500 µL预冷异丙
醇，轻轻上下颠倒 5、6下，在室温中放置 10 min。
15 000 r/min 4 ℃离心 10 min，弃去上清。加入 1
mL预冷 75%乙醇，轻摇几下，7 500 r/min 4 ℃离心
5 min，弃去上清，干燥，用 50 µL DEPC水溶解沉
淀，在60 ℃中温育10 min，即获得RNA溶液。
总RNA用Ambion® TURBO Recombinant DN-
ase Ⅰ(RNase-Free)(ABI,美国)进行处理，操作按照
说明书执行。总RNA的琼脂糖凝胶电泳谱带清
晰，A260/A280在 1.8~2.0之间，经 PCR检测无DNA残
留，可进行后续实验。
1.2.2 合成cDNA
取 2 µg RNA及 random hexamer合成 cDNA。
具体步骤参照反转录酶SuperScriptⅢReverse Tran-
scriptase(Invitrogen, 美国)试剂盒说明书进行。设
置阴性对照组。
1.2.3 荧光定量PCR鉴定
荧光定量PCR检测多杀菌素生物合成基因簇
的表达情况。根据NCBI上刺糖多孢菌生物合成
基因簇(spn)的序列信息，设计引物扩增 spn基因簇
每个转录子中的100~150 bp的片段，退火温度均在
60 ℃以上，引物信息参照表 1。对于多顺反子，用
转录子中首个或中部的基因的转录水平来代表整
个转录子的转录水平(Liu et al., 2009)。
20 μL荧光定量 PCR反应体系：cDNA模板
(1 ng/μL)9 μL，正反向引物(20 μmol/L)各0.5 μL，2×
Power SYBR green PCR master mix(ABI, 美国)
10 μL。使用ABI 7500 Real-time PCR system仪器，
反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃
退火并延伸1 min，共40个循环。所有的实验组中
都以刺糖多孢菌中的主要 sigma因子 sigA为内参，
重复3次，并以插入了目的基因片段的pMD18T载
体(Takara)为标准品制作标准曲线，依据双标准曲线
法(徐丽华等, 2011)计算实验结果和标准偏差。利
用Excel对数据进行单因素方差分析和多重比较。
1.2.4多杀菌素的检测
将发酵液与甲醇按照 1∶1比例混合，震荡，静
置 2 h后，3 500 r/min离心 15 min，取上清进行
HPLC测定。色谱柱为 150 mm×4.6 mm，5 μm的
C18反相柱(Agilent,中国)。流动相为甲醇∶乙腈∶
0.05 %乙酸铵水溶液=45∶45∶10。进样量10 μL；流
速1 mL/min；柱温25 ℃；检测波长244 nm。
2 结果与分析
2.1 spn基因簇转录子结构分析
刺糖多孢菌的 spn基因簇含有19个基因，其转
录方向见图1(Waldron et al., 2001)。通过生物信息
学分析，发现一些基因间距不具有启动子区域或
Rho-dependant终止子特征，因此可初步推测转录
刺糖多孢菌高产菌株和野生型菌株多杀菌素生物合成基因簇(spn)在发酵过程中的表达分析
Expression Analysis of spn Gene Cluster(spn) in Hyperproducing and Wild-type S. spinosa Strains During Fermentation
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Journal of Agricultural Biotechnology
表1 RT-PCR引物信息
Table 1 The primers used in this study for RT-PCR analysis
目的基因
Target gene
spnP
spnM
spnI
spnG
spnF
spnD
spnQ
spnJ
spnO
sigA
epi
gtt
gdh&kre
引物名称
Primer name
spnP-F
spnP-R
spnM-F
spnM-R
spnI-F
spnI-R
spnG-F
spnG-R
spnF-F
spnF-R
spnD-F
spnD-R
spnQ-F
spnQ-R
spnJ-F
spnJ-R
spnO-F
spnO-R
sigA-F
sigA-R
epi-F
epi-R
gtt-F
gtt-R
gdh&kre -F
gdh&kre-R
引物序列(5~3)
Primer sequence
CGCCTGCCTGTGGACTTGGA
TGCTCAGCCGCCGCTTGGTC
ATCTCGTCGTCCGTGCTGTG
GCGACTTCCTCGACACTTCC
TCTCCCGATTCCAGGATGCC
CGGAAGTACCGCTGCCACAT
TCTCCAGTGTCCGCACCAGC
TCACCGACTCAATCGCAACG
GGCGTCACCGAGGTCGTCAA
GCACGCAGCGATTCCAGAAG
CGGAGACACTGGACGAGACG
CACCACTCTGCGAACGAACA
CCGAATGCGGAAATCTTGCT
CACCGGGCTACGACCACAAG
GACGACGAGGTCCGGATAAC
GGTGCCCGAATTCCATGAC
GCACGACCTCCCAGCGACTT
CCAACGCCCACAAGCTATGC
CGCAGACCACCAAGCCAGAC
CTCTTCCTGTGCGGTGAGCA
CACGGGTGCATACGAGTTCA
GCCGAGACGCTGTGGTTGGT
CCGCTGTCGGTGCTGATGCT
CTCGATCC GAATGCCGAACT
TCGTGCTCGACAAGCTCACC
GACATCAGGCCGCCAACCAG
基因功能
Gene function
福乐糖胺转移酶
Forosamyltransferase
聚酮交联桥形成
Polyketide bridging
鼠李糖：O-甲基转移酶
Rhamnose; O-methyl-transferase
鼠李糖转移酶
Rhamnosyltransferase
聚酮交联桥形成
Polyketide bridging
聚酮合酶
Polyketide synthase
福乐糖胺：3, 4-脱氢酶
Forosamine; 3,4-dehydratase
聚酮交联桥形成
Polyketide bridging
福乐糖胺：2, 3-脱氢酶
Forosamine; 2,3-dehydratase
sigma因子(内参)
Sigma factor(reference)
3,5-差相异构酶
3,5 epimerase
NDP-葡萄糖合酶
NDP-glucose synthase
4,6-葡萄糖脱水酶和4-酮还原酶
dTDP- glucose- 4,6- dehydratase &4 -
ketoreductase
图1 spn基因簇转录子结构
Figure 1 Transcript structure in spn gene cluster
箭头代表基因转录方向，数字代表基因间距
The genes transcription direction are indicated by arrows; The numbers indicate the genetic distance between genes
1340
子组成(图 1)。spn基因簇内共有 9个转录子，分别
为 spnQ-R-S、spnP、spnO-N、spnM、spnJ-K-L、spnI、
spnG-H、spnF和 spnA-B-C-D-E。
2.2 刺糖多孢菌发酵过程菌体形态和产素变化
对刺糖多孢菌发酵过程中 spn基因簇的表达
进行检测，首先应确定其不同生长时期。刺糖多孢
菌摇瓶发酵时间为 7 d，从发酵 24 h时开始镜检，
菌丝随发酵时间延长逐渐延伸、分支，生长旺盛，直
至120 h菌丝开始出现断裂、自溶。
野生型菌株ATCC49460和突变株ASAGF73
的生长曲线较为相似，在48 h后进入对数期，120 h
后处于稳定期(图2A)。野生型菌株ATCC49460产
素能力有限，168 h时产量不到 100 μg/mL，而突变
株ASAGF73则达到约 800 μg/mL(图 2B)。同时发
现，两株菌均在发酵起始阶段即48 h就开始合成多
杀菌素，在发酵第120 h时突变株ASAGF73正处于
产素快速增长期。考虑到第 144 h菌体断裂、自溶
比较严重，RNA被降解，故选取 48和 120 h的菌体
进行基因表达分析。
2.3 ATCC49460 与 ASAGF73 发酵过程中 spn
基因簇的表达分析
选 取 spnQ、spnP、spnM、spnO、spnJ、spnI、
spnG、spnF和 spnD作为其所在转录单位表达的指
示基因，用于检测野生型菌株ATCC49460和突变
株ASAGF73在发酵第 48和 120小时 spn基因簇中
各转录单位表达变化。
2.3.1 聚酮链合成基因表达分析
由于编码聚酮合酶的5个基因是共同转录的，
spnD基因的表达水平反映了 spn基因簇中编码聚
酮合酶基因 (polyketide synthase, PKS)的表达情
况。如图3所示，野生型菌株ATCC49460和突变株
ASAGF73中 spnD在48和120 h时表达水平没有明
显变化，但在突变株中其表达量远大于野生型菌株
(P=0.000 154)。由此可见，高产突变株中PKS编码
基因的表达量增加即聚酮链合成能力的增强，可能
是多杀菌素产量提高的主要原因之一。
spnF、spnJ、spnL和 spnM 4个基因负责大环内
联桥的形成，其中 spnL与 spnJ在同一转录子内。
由图 3可知，突变株ASAGF73中编码催化聚酮链
分子内交联的基因表达和PKS编码基因的表达情
况 类 似 ，其 表 达 量 也 远 高 于 野 生 型 菌 株
ATCC49460(P＜0.01)。 spnL- spnJ和 spnM在 48 h
比120 h表达量高，但SpnF催化内联桥形成的第一
步反应，其编码基因 spnF的表达量在 48 和 120 h
无变化。在该基因阅读编码框的上游有一潜在的
BldD(bld光秃型基因家族中的一员)结合位点(李月
等, 2011)，通过序列比对，发现刺糖多孢菌中有
BldD同源序列，因此，spnF的表达有可能受到其调
控，进而影响突变株中拟糖苷配体(aglycone, AGL)
在发酵早期的大量合成(Creemer et al., 1998)。
2.3.2 三甲氧基鼠李糖生物合成基因表达分析
负责鼠李糖合成的基因位于 spn基因簇外染
色体 3个不同位点(Madduri et al., 2001b)，其中 gdh
与 kre共同转录。在Gtt(NDP葡萄糖合成酶)、Gdh
多
杀
菌
素
产
量
/(
μg
·m
L
-1
)
S
pi
no
sa
d
yi
el
d
t/h
图2 野生型菌株ATCC49460与突变株ASAGF73的生长曲线(A)及发酵过程中多杀菌素的产量变化(B)
Figure 2 The growth curve(A) and the spinosad yield(B) of wild type ATCC 49460 and high-yield ASAGF73 strains dur⁃
ing fermentation
*：P＜0.05水平差异显著；**：P＜0.01水平差异极显著；ns：无显著性差异。下同
* : Significant difference at P＜0.05; ** : Extremely significant difference at P＜0.01; ns: No significant difference. The same below
生
物
量
/%
B
io
ba
ss
t/h A B
ns
**
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0 24 48 72 96 120 144 168 24 48 72 96 120 144 168
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
刺糖多孢菌高产菌株和野生型菌株多杀菌素生物合成基因簇(spn)在发酵过程中的表达分析
Expression Analysis of spn Gene Cluster(spn) in Hyperproducing and Wild-type S. spinosa Strains During Fermentation
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农业生物技术学报
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(葡萄糖脱氢酶)作用下，将葡萄糖-1-磷酸转化为
NDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖，后者为鼠李糖与福乐糖
胺合成的共同前体，该前体在 3,5-差相异构酶(3,
3,5 epimerase, Epi)和 4-酮还原酶 (4- ketoreduc-
tase, Kre)作用下合成鼠李糖 (Waldron et al.,
2001)。对gdh、gdh/kre、epi基因的表达进行检测，发
现在突变株ASAGF73中鼠李糖的合成能力并没有
大幅度提高，同时在发酵前期和后期参与鼠李糖合成
的基因表达变化较小。
鼠李糖与AGL的连接是多杀菌素合成中的重
要一步(Madduri et al., 2001a)，这个过程受控于鼠
李糖转移酶SpnG。相比于野生型菌株，编码该转
移酶的基因 spnG在突变株ASAGF73中发酵 48 h
时的表达量远大于在120 h的表达量(P＜0.01)。拟
糖苷配体(pseudoaglycone, PSA)的合成还需要鼠李
糖基上的三步甲基化，分别由 SpnK、SpnI和 SpnH
催化完成(Madduri et al., 2001a)。spnK基因与负责
聚酮链环化的 spnJ基因共转录，spnH基因与 spnG
基因共转录，其和单独转录的 spnI在突变株中发酵
48 h时表达量均高于120 h(P＜0.01)(图4)。
2.3.3 负责福乐糖胺合成与修饰的基因表达分析
NDP-4-酮-6脱氧葡萄糖在SpnO、SpnN、SpnQ、
SpnR和SpnS的催化作用下合成TDP-二甲基福乐
糖胺(Hong et al., 2008)，编码这些酶的基因位于 2
个转录子内，分别用 spnO和 spnQ基因来代表这 2
个转录子 spnQ-R-S和 spnO-N的表达情况。如图 5
所示，负责福乐糖胺合成和修饰的基因在突变株
ASAGF73中的表达水平较野生型有小幅度提高，
且这些基因在发酵过程中的表达也无明显变化。
结合上述负责前体NDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖合成的
基因gtt、gdh的表达情况(图4)，表明在突变株中，福
乐糖胺的合成在发酵过程中是稳定的。
TDP-二甲基福乐糖胺在其专一性转移酶SpnP
的作用下连接到母环的C17位上，是多杀菌素生物
合成的最后一步(Waldron et al., 2000)。spnP基因
在突变株ASAGF73中的表达略高于野生型菌株
ATCC49460(P＜0.05)(图5)。spnP在发酵后期表达
量高于前期，表明随着发酵时间延长更多的PSA转
化成多杀菌素。
3 讨论
多杀菌素的合成分为几个步骤，分别为PKS催
sp
nD
相
对
表
达
量
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
菌株Strains
ns
**
**
ns
sp
nJ
相
对
表
达
量
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
**
**
**
**
sp
nF
相
对
表
达
量
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
ns
**
**
**
sp
nM
相
对
表
达
量
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
ns
**
**
**
图3 聚酮链合成基因 spnD、spnJ、spnF和 spnM在野生型菌株ATCC49460和突变株ASAGF73中发酵48和120 h时表达
变化
Figure 3 Transcriptional analysis of spnD, spnJ, spnF and spnM responsible for polyketide biosynthetic and aglycone
modification in wild type ATCC49460 and high-yield ASAGF73 strains at 48 and 120 h during fermentation
内参基因：sigA；n= 3；下同
Reference gene : sigA; n=3; The same below
菌株Strains
菌株Strains菌株Strains
7
6
5
4
3
2
1
0
30
25
20
15
10
5
0
12
10
8
6
4
2
0
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
1342
化聚酮链的合成、大环内联桥的形成、鼠李糖的合
成、添加与修饰、福乐糖胺的合成与添加(Waldron
et al., 2001)，每一步酶促反应都可能调控多杀菌素
的合成。增加参与多杀菌素合成基因的拷贝数可
提高产量(Pan et al., 2011a; Tang et al., 2011)，但关
于多杀菌素合成过程中限速步骤的研究及有针对
性的菌株改造目前还未见报道。
本研究通过对刺糖多孢菌高产突变株和野生
型菌株在发酵过程中 spn基因簇的表达分析发现，
多杀菌素合成相关基因在不同菌株间及不同发酵
时期表达量相差较大，可能是不同菌株间产素能力
不同的原因。编码PKS的基因在高产突变株中表
达水平有大幅提高，且在发酵初期表达水平就已较
高，这有可能是突变株多杀菌素合成能力提高的重
要原因。在发酵初期(48 h)与后期(120 h) PKS编码
基因表达量变化不大，这与冯晓洲等(2013)的研究
结果不同。在红色糖多孢菌和弗氏链霉菌的高产
工业菌株中PKS表达水平也是上升的(Chng et al.,
2008; Lum et al., 2004)，意味着PKS基因的表达水
平与产量成正相关。根据这一结果推断，多杀菌素
前体AGL从发酵早期开始就在菌体内大量合成。
研究发现，突变株ASAGF73的鼠李糖转移酶基因
spnG在对数生长期 48 h的表达量高于发酵后期，
但在初级代谢活跃的对数生长期菌体合成的鼠李
糖主要参与细胞壁合成，由于前体及能量竞争，使
得发酵前期 PSA的合成和多杀菌素的合成受限。
在发酵后期多杀菌素的合成量逐步提高，但 spnG
在发酵后期的弱表达可能限制了多杀菌素合成能
力的进一步提高。此外，鼠李糖合成相关基因在野
生型菌株和高产突变株中的表达量无明显差异，这
可能是限制ASAGF73产量的一个重要因素。因
此，在多杀菌素的合成过程中，鼠李糖的合成和添加
ep
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图 4 参与鼠李糖合成、连接与修饰基因 epi、gtt、gdh/kre、spnG和 spnI在野生型菌株ATCC49460和突变株ASAGF73中
发酵48和120 h时表达变化
Figure 4 Transcriptional analysis of epi, gtt, gdh/kre, spnG and spnI responsible for biosynthesis，attachment and methyl⁃
ation of rhamnose in wield type ATCC49460 and high-yield ASAGF73 strains at 48 and 120 h during the fermentation
菌株Strains 菌株Strains
菌株Strains 菌株Strains
菌株Strains
**
**
**
**
1.5
1.0
0.5
0
1.2
0.8
0.4
0
2.4
1.6
0.8
0
10
8
6
4
2
0
2.4
1.6
0.8
0
刺糖多孢菌高产菌株和野生型菌株多杀菌素生物合成基因簇(spn)在发酵过程中的表达分析
Expression Analysis of spn Gene Cluster(spn) in Hyperproducing and Wild-type S. spinosa Strains During Fermentation
1343
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
可能是一个主要的限速步骤。Yang等(2014)对野生
型菌株 CCTCCM206084的蛋白质组分析发现，spn
基因簇所编码蛋白的表达水平在菌体不同生长阶段
有所差别，变化趋势与本研究结果相似，即在菌株生
长对数期 spn基因簇内大部分基因、鼠李糖合成基
因及其转移酶基因spnG的表达量高于其它时间点。
4 结论
本研究首次对刺糖多孢菌野生型菌株
ATCC49460和高产菌株ASAGF73的多杀菌素合
成途径关键基因在发酵过程中的表达变化进行了
较为详细的对比研究。结果表明，负责聚酮链合成
与分子内交联基因的高表达可能是突变株
ASAGF73多杀菌素发酵产量提高的原因之一。而
鼠李糖和福乐糖胺的合成、连接与修饰有可能是限
制高产菌株ASAGF73多杀菌素合成的因素之一，
通过基因工程方法，针对高产菌株的代谢特点构建
多点突变基因工程菌，加强该限速步骤，将是提高
多杀菌素产量的有效途径。
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sp
nO
相
对
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量
R
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iv
e
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*
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图5 负责福乐糖胺合成、修饰与连接基因 spnO、spnQ和 spnP在野生型菌株ATCC49460和突变株ASAGF73中发酵48和
120 h时表达变化
Figure 5 Transcriptional analysis of spnO, spnQ and spnP related to synthesis, modification and attachment of forosa⁃
mine in wild type ATCC49460 and high-yield ASAGF73 strains at 48 and 120 h during fermentation
菌株Strains 菌株Strains
菌株Strains
6
5
4
3
2
1
0
8
6
4
2
0
3
2
1
0
1344
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(责任编辑 马丽萍)
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