全 文 ：31(4)553-560 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2015年 8月

收稿日期：2015-04-22
基金项目：国家国际合作重点项目（2011DFA32610）；国家“973”计划（2011CB7221301）；国家“863”计划（2011AA10A203）；湖南省协同
创新中心项目（20134486）
作者简介：蔡妹，女，硕士研究生，E-mail：623739262@qq.com；*通信作者，博士，副教授，硕士生导师，E-mail：sunyi@hunnu.edu.cn。

DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2015.04.016

刺糖多孢菌bldD基因过表达对多杀菌素合成
及其孢子形成的影响
蔡 妹，刘红雪，杨 琦，孙运军*，胡胜标，余子全，黄伟涛，丁学知，夏立秋
（湖南师范大学生命科学学院/微生物分子生物学国家重点实验室培育基地，长沙 410081）
摘要: bldD基因是链霉菌中的全局性调控基因，调节菌体的形态分化与次级代谢产物的合成。本研究采用
重叠延伸 PCR 将 bldD 基因置于红霉素强启动子（PermE）的控制下克隆至大肠杆菌−链霉菌穿梭载体
pUC−spn上，构建重组载体 pUC−spn−PermE−bldD；通过接合转移将其导入刺糖多孢菌中，获得遗传性能稳
定的重组菌株 S. spinosa−BldD。平板培养观察发现，在 BHI和 TSB平板上，重组菌株的孢子形成受到明
显抑制。摇瓶发酵结果显示，重组菌株多杀菌素产量相比对照菌株提高了 1.35 倍。因此，bldD 基因的过
量表达在一定程度上抑制刺糖多孢菌的孢子形成，并有效促进多杀菌素的生物合成，为研究其他正调控基
因的过量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了重要基础。
关 键 词：刺糖多孢菌；bldD基因；过量表达；多杀菌素
中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2015)04-0553-08
Impact on Spinosad Biosynthesis and Spore Formation by Overexpression of bldD
Gene in Saccharopolyspora spinosa
CAI Mei, LIU Hongxue, YANG Qi, SUN Yunjun*, HU Shengbiao, YU Ziquan,
HUANG Weitao, DING Xuezhi, XIA Liqiu
(State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular Biology/College of Life Science, Hunan Normal University,
Changsha 410081, China)
Abstract: Previous report revealed that bldD was a global transcriptional regulator, participating in morphological
development and secondary metabolism in Streptomyces. Here, we studied the effects of overexpression bldD gene
on spinosad biosynthesis and spore formation in Saccharopolyspora spinosa. Cm-PermE gene segment and bldD
gene were amplified, then spliced by overlap PCR. Thus, the open reading frame of bldD was placed under the
control of the promoter for erythromycin resistance gene PermE. The cm-PermE-bldD frangment was cloned into
Escherichia coli-Streptomyces shuttle vector pUC-spn by Red/ET homologous recombination, generating
recombinant vector pUC-spn-PermE-bldD. This was introduced into S. spinosa from E. coli S17 through conjugal
transfer, and integrated to the chromosome of S. spinosa via homologous recombination. Apramycin resistant
colonies were picked up and identified by PCR. Positive transconjugants of which bldD gene was successfully
integrated into chromosome of S. spinosa SP06081 were chosen for further study. On BHI and TSB agar, the
sporulation of recombination strain S. spinosa-BldD was apparently inhibited. Flask fermentation demonstrated that
the recombination strain overproduced 1.35-fold spinosad compared with the control strain. The recombination
strain, S. spinosa-BldD, was genetically stable. These findings revealed that overexpression of bldD in S. spinosa
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had a negative effect on sporulation in some cases, and effectively promoted spinosad biosynthesis in S. spinosa,
which provides a basis for improving spinosad production by overexpression of other positive regulatory genes.
Key words: Saccharopolyspora spinosa; bldD; overexpression; spinosad

多杀菌素（spinosad）是由土壤放线菌刺糖多孢菌 Saccharopolyspora spinosa经有氧发酵产生的大环内
酯类化合物，是一种新型高效生物杀虫剂，具有广谱、低毒、低残留等特点，主要活性组分为 spinosad A
和 spinosad D。多杀菌素的杀虫机理独特[1]，具有胃毒和快速触杀双重作用方式，能有效防治鳞翅目
Lepidoptera、双翅目 Diptera、鞘翅目 Coleoptera 等多种农作物害虫[2]。然而，刺糖多孢菌野生菌株中多杀
菌素的生物合成量极低且发酵周期长，限制了多杀菌素大面积推广应用。刺糖多孢菌的次级代谢受多种调
控因子的影响，通过对多杀菌素生物合成途径中的关键功能基因进行修饰，改变前体物质的代谢流；增加
次级代谢合成相关的正向调控基因的表达都可能有效提高目标代谢产物的生物合成[3-5]。Pan等[6]通过增加
修饰基因 gtt、gdh 的拷贝数，显著提高了刺糖多孢菌中多杀菌素的产量。Luo 等[7]通过位点特异性重组将
透明颤菌血红基因（vhb）整合到刺糖多孢菌染色体上，有效地改善了刺糖多孢菌发酵培养过程中供氧不
足的问题，使多杀菌素产量显著增加。
bld 基因是链霉菌中的一种典型的全局性调控因子，在模式菌株天蓝色链霉菌中对细胞的形态分化以
及次级代谢产物的合成具有重要影响，其基因家族成员包括 bldA、bldD、bldH、bldN、bldK等。其中 bldD
基因的调控机制研究较为透彻。在天蓝色链霉菌中，bldD基因编码含有 167个氨基酸残基的小分子量 DNA
结合蛋白，分子量约为 18 kD[8]。一般情况下，BldD作为转录抑制因子，不仅能与自身的启动子区域结合
阻遏自身表达，还能与 bldN、sigH、whiG等的启动子结合，影响发育期重要的 sigma因子的表达[9]，从而
调控链霉菌孢子形成与抗生素的产生。Chng等[10]研究表明，bldD基因位于 ery基因簇的上游，BldD蛋白
作为 ery基因簇的一个共同转录调节因子，可以与整个 ery基因簇的启动子区域结合，从而促进 ery基因簇
的表达。bldD 基因缺失的红色糖多孢菌突变株，其红霉素产量显著下降仅为原始菌的 1/7，菌株的形态分
化也受到明显的抑制。何晶晶等[11]研究报道在红色糖多孢菌中超量表达光秃型基因 bldD，红霉素的产量得
以显著提高。
本研究选取刺糖多孢菌中的 bldD 基因进行克隆，构建 bldD 基因过表达载体 pUC-spn-PermE-bldD，再
利用接合转移和单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上，使 bldD基因在刺糖多孢菌中的拷贝
数增加，以期通过过量表达该基因，促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成，并研究其对孢子形成的
影响。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和质粒
本研究供试菌株、质粒见表 1。
表 1 供试菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株 Strains 相关描述 Relative description 来源 Sources
E. coli GBRed 克隆宿主，含 Redα/Redβ重组酶 本实验室
E. coli S17 接合转移宿主菌 本实验室
S. spinosa SP06081 刺糖多孢菌 SP06081 本实验室
S. spinosa-1 整合有原始质粒 pUC-spn 的刺糖多孢菌对照菌株 本研究
S. spinosa-BldD 整合有 bldD基因的刺糖多孢菌重组菌株 本研究
质粒 Plasmids
pIJ86-cm 含 pUC 复制子，红霉素抗性基因启动子 PermE，氯霉素抗性基因 CmR ，阿伯拉霉素抗性基因 AmR 本实验室
pUC-spn 含 pUC 复制子，接合转移起始位点 oriT，部分多杀菌素合成基因簇，位点特异性整合酶 phiC31 int，
phiC31 attP位点，阿伯拉霉素抗性基因 AmR
本实验室
pUC-spn-PermE-bldD 置于强启动子 PermE控制下的 bldD基因替换 pUC-spn 上的 phiC31 int-attP片段 本研究
第 4期 蔡妹等：刺糖多孢菌 bldD基因过表达对多杀菌素合成及其孢子形成的影响 555

1.2 培养基及培养条件
大肠杆菌 Escherichia coli培养基为 Luria-Bertani（LB）或 TY液体培养基，培养温度为 37 ℃；刺糖
多孢菌菌种活化培养基为种子培养基（脑心浸液 4.5%，葡萄糖 1%，酵母抽提物 0.9%，MgSO4·7H2O 0.22%）；
大肠杆菌-刺糖多孢菌属间接合转移培养基为 R6 固体培养基；刺糖多孢菌发酵培养基为合成发酵培养基
（葡萄糖 2%，胰蛋白胨 0.4%，酵母抽提物 0.4%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，MgSO4·7H2O 0.22%,
FeSO4·7H2O 0.001%），培养温度为 30 ℃，相对湿度为 70%。孢子形态观察培养基为 BHI（Brain Heart Infusion
3.7%）培养基和 TSB（Tryptic Soy Broth 3%）培养基。
1.3 试剂、抗生素与使用浓度
LA Taq DNA聚合酶、限制性内切酶（Hind III）购自 TaKaRa公司。SanPrep柱式质粒小量抽提试剂
盒、细菌基因组 DNA快速抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。L−阿拉伯糖和抗生素购
自 Sigma−Aldrich公司。使用浓度分别为氯霉素（chloramphenicol，Cm）15 mg/L、阿伯拉霉素（apramycin，
Apra）50 mg/L、链霉素（streptomycin，Str）100 mg/L、萘啶酮酸（nalidixic acid，NA）25 mg/L。
1.4 引物
本研究所用引物（表 2）由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
表 2 引物
Table 2 Primers used in this study
引物 Primer 序列 Sequence (5′−3′)
Apra-F GCTCATCGGTCAGCTTCTCAAC
Apra-R CTTCGCATCCCGCCTCTG
cm-reg-1 gacgtcccgaaggcgtggcgcggcttccccgtgccggagcaatcgccctgATCTAAAGGAAGCGGATGTGAC
cm-ermE-reg-2 GGATCCTACCAACCGGCACGAT
cm-ermE-BldD-3 atcgtgccggttggtaggatccATGGGCGACTACGCCAAGGCGCTG
cm-BldD-4 ctacgccgctacgtcttccgtgccgtcctgggcgtcgtcttcgtcgtcgtGGTGCCCCTCGTACGTAACTG
注：小写部分为同源臂。
Note: Lowercase letters indicated homologous arms.
1.5 过表达载体 pUC-spn-PermE-bldD的构建
以质粒 pIJ86-cm为模板，设计引物对 cm-reg-1/cm-ermE-reg-2，PCR扩增 cm-PermE基因片段。PCR
反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸 10 min。以刺糖多孢菌
SP06081基因组为模板，引物对 cm-ermE-BldD-3/cm-BldD-4，PCR扩增 bldD基因。反应程序：94 ℃ 5 min；
94 ℃ 45 s，64 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸 10 min。以上述 2个 PCR回收产物为模板，引物
对 cm-reg-1/cm-BldD-4进行重叠延伸 PCR，扩增带同源臂的 cm-PermE-bldD 基因片段。在 Redα/Redβ 重
组酶的作用下，cm-PermE-bldD基因片段替换载体 pUC-spn上的 phiC31 attP位点和 phiC31整合酶基因，
得到重组质粒 pUC-spn-PermE-bldD。
1.6 重组菌株 S. spinosa-BldD的构建
将构建的重组质粒 pUC-spn-PermE-bldD及原始质粒 pUC-spn分别电转化接合转移宿主菌 E. coli S17，
经 Cm、Apra、Str 三抗筛选阳性转化子，获得转化子 S17/pUC-spn-PermE-bldD、S17/pUC-spn。通过接合
转移 [12]将其导入刺糖多孢菌中，经 Apra、NA 二抗筛选阳性接合子，提取接合子基因组，引物对
Apra-F/Apra-R PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因以鉴定接合子正确性。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，
58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸 10 min。将整合有原始质粒 pUC-spn的接合子命名为 S.
spinosa-1；整合有重组质粒 pUC-spn-PermE-bldD的接合子命名为 S. spinosa-BldD。
1.7 刺糖多孢菌菌落形态观察
将对照菌株 S. spinosa-1和重组菌株 S. spinosa-BldD 20 μL 菌液分别涂布于 BHI、TSB 和 R6固体培
养基上，30 ℃恒温培养，观察其在不同培养基上菌落形态及孢子形成情况。
556 中 国 生 物 防 治 学 报 第 31卷
1.8 发酵培养及多杀菌素产量分析
取 1 mL -80 ℃刺糖多孢菌菌种保藏液接种至装液量为 50 mL种子培养基的 300 mL三角瓶中，30 ℃、
250 r/min培养 2 d；以 10%的比例转接种子液至装液量为 30 mL合成发酵培养基的 300 mL三角瓶中，30 ℃、
250 r/min发酵 10 d。取 700 μL发酵液加入等体积的丙酮混匀，4 ℃浸提 24 h。离心取上清，经 0.22 μm微
孔滤膜过滤，使用 Agilent 1290超高效液相色谱系统测定多杀菌素含量。色谱柱规格为 ZORBAX SB-C18
（5 μm，4.6 mm×150 mm）；柱温：室温；流动相：甲醇/乙腈/2%乙酸铵溶液（体积比 45/45/10）；流速：
1.5 mL/min；上样体积：10 μL；检测波长：250 nm。通过检测系统自带分析软件计算多杀菌素 A、D的响
应峰面积，与标准品比对便可得出样品中多杀菌素的含量。
1.9 重组菌株 S. spinosa-BldD的遗传稳定性测定
将重组菌株 S. spinosa-BldD接种至 CSM培养基中活化 2 d，取适量稀释后的菌液均匀涂布于 TSB平
板（无抗生素）上，30 ℃培养 5～7 d；挑取 70个单克隆转接至添加有阿伯拉霉素（50 μg/mL）的 TSB平
板上，30 ℃培养 3～4 d，计算抗性克隆数；并从中随机挑取 20个单克隆，进行菌落 PCR扩增阿伯拉霉素
抗性基因片段，研究重组菌株 S. spinosa-BldD的遗传稳定性。
2 结果与分析
2.1 过表达载体 pUC-spn-PermE-bldD的构建
以天蓝色链霉菌中 bldD基因核苷酸序列为标准，通过 NCBI Blast检索刺糖多孢菌基因组中 bldD基因
同源片段。刺糖多孢菌中 bldD基因 ORF为 489 bp，编码 162个氨基酸，与天蓝色链霉菌中的 bldD基因
核苷酸相似性为 75%，氨基酸相似性为 77%（图 1）。

图 1 bldD基因编码蛋白的同源性分析
Fig. 1 Homology comparison of amino acid sequences coded by bldD gene
以质粒 pIJ86-cm为模板，引物对 cm-reg-1/cm-
ermE-reg-2，PCR扩增 cm-PermE基因片段；以刺糖
多孢菌基因组为模板，引物 cm-ermE-BldD-3/cm-
BldD-4，PCR扩增 bldD基因片段。以上述 2种 PCR
回收产物为模板，cm-reg-1/cm-BldD-4为引物，将
cm-PermE基因片段和 bldD基因片段“缝合”，得到
两端带有同源臂的目的片段 cm-PermE-bldD。在
Redα/Redβ重组酶的作用下，cm-PermE-bldD片段替
换载体 pUC-spn上的 phiC31 attP位点和 phiC31整
合酶基因，得到重组质粒 pUC-spn-PermE-bldD（图
2）。该载体含有 pUC 复制子，接合转移起始位
点 oriT，阿伯拉霉素抗性基因 acc3（Ⅳ），部分多杀
菌素合成基因簇以及置于红霉素抗性基因启动子

M：λ/Hind III DNA Marker；CK：质粒 pUC-spn Hind III酶切 pUC-spn
vector digested with Hind III；1～4：质粒 pUC-spn-PermE-bldD Hind III
酶切 pUC-spn-PermE-bldD vector digested with Hind III
图 2 pUC-spn-PermE-bldD的构建及鉴定
Fig. 2 The construction and confirmation of recombinant vector
pUC-spn-PermE-bldD
1 MSSEYAKQLGAKLRAIRTQQGLSLHGVEEKSQGRWKAVVVGSYERGDRAVTVQRLAELAD
::|||.||.|||||| ||||||||||:||.|||||||||||||||||||||:||||||
1 .MGDYAKALGSKLRAIRQQQGLSLHGVEQKSGGRWKAVVVGSYERGDRAVTVQKLAELAD

61 FYGVPVQELLPGTTPGGAAEPPPKLVLDLERLATVPAEKAGPLQRYAATIQSQRGDYNGK
||||||.||||:. ..::|||:.|:|::||||. :||||.|||.||||||||||||||||
60 FYGVPVAELLPEGRVPSGAEPATKVVINLERLQQLPAEKVGPLARYAATIQSQRGDYNGK

121 VLSIRQDDLRTLAVIYDQSPSVLTEQLISWGVLDADARRAVASHDEL
||||| :|||.||:||| .|: ||||||.||||.::||.| ..
120 VLSIRTEDLRSLAIIYDMTPGELTEQLIDWGVLPPEARPAREE
第 4期 蔡妹等：刺糖多孢菌 bldD基因过表达对多杀菌素合成及其孢子形成的影响 557

PermE控制下的 bldD 基因。
2.2 重组菌株 S. spinosa-BldD的构建及 PCR检测
将目标质粒电转入大肠杆菌 E. coli S17中，与刺糖多孢菌 SP06081进行属间接合转移，再通过单交换
同源重组将 bldD基因整合到刺糖多孢菌染色体上（图 3）。挑取 R6平板上的接合子，提取接合子基因组
作为模板，用引物对 Apra-F/Apra-R进行 PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因片段（719 bp）。结果（图 4）显
示，重组菌株 S. spinosa-BldD 以上述引物 PCR扩增呈阳性，而以原始菌株 S. spinosa基因组为模板的阴
性对照无目的条带出现，说明携带有 bldD基因的外源质粒已成功整合到刺糖多孢菌染色体上。
spn
spn spn
spn
spn pUC
pUC
pUC
AmR
AmR
AmR
CmR
CmR
CmR
oriT
oriT
oriT
spnA spnB spnC spnD
spnA spnB spnC spnD
PermE
bldD
bldD
bldD
intattP
chromosome
chromosome
PermE
PermE
pUC-spn- PermE- bldD (39 kb)
pUC-spn (39 kb)

图 3 重组载体与刺糖多孢菌基因组重组示意图
Fig. 3 Schematic of recombination between combinational vector and S. spinosa genome
2.3 bldD基因过表达对刺糖多孢菌孢子形成的影响
通过对重组菌株 S. spinosa-BldD 和对照菌株
S. spinosa-1 在不同培养基中的菌落形态及孢子形
成情况观察发现，重组菌株和对照菌株在 BHI 和
TSB 培养基上的菌落形态没有明显差异（图 5）。
在 BHI和 TSB培养基上培养 3 d后，对照菌株已产
生较多白色孢子，而重组菌株只产生很少量的孢
子。与对照菌株相比，重组菌株的孢子形成受到明
显抑制。
2.4 bldD基因过表达对多杀菌素产量的影响
摇瓶发酵结果（图 6）表明，合成发酵培养基
中对照菌株 S. spinosa-1的多杀菌素 A＋D的产量
为 99.2 mg/L，重组菌株 S. spinosa-BldD多杀菌素
A＋D的产量为 133.6 mg/L，比对照菌株提高了 1.35
倍。说明 bldD 基因的过量表达能有效地促进刺糖
多孢菌中多杀菌素的生物合成。
2000
750
500
bp
M CK 1 2 3 4

M：DL2000 Marker；CK：以 S. spinosa 为模板作阴性对照 Negative
control using S. spinosa genome as template；1：以质粒 pUC-spn为模
板作阳性对照 Positive control using pUC-spn as template；2：以 S.
spinosa-1基因组为模板 PCR product of S. spinosa-1；3：以质粒 pUC-
spn-PermE-bldD 为模板作阳性对照 Positive control using pUC-spn-
PermE-bldD as template；4：以 S. spinosa-BldD基因组为模板 PCR product
of S. spinosa-BldD
图 4 重组菌株 S. spinosa-BldD的 PCR鉴定
Fig. 4 PCR confirmation of the transconjugant S. spinosa-BldD
2.5 重组菌株 S. spinosa-BldD的遗传稳定性分析
重组菌株 S. spinosa-BldD在无抗性选择压力下，连续传代培养 8次，98%以上的单菌落仍具有阿伯拉
霉素抗性，且菌落 PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因结果呈阳性，表明在连续传代的过程中，整合的 bldD基
因没有丢失，S. spinosa-BldD的遗传稳定性良好。
558 中 国 生 物 防 治 学 报 第 31卷
3 d
4 d
5 d
BHI TSB BHI TSB
S. spinosa-1 S. spinosa-BldD

图 5 不同培养基上对照菌株、重组菌株的菌落形态比较
Fig. 5 Morphological comparison of control strain and recombination strain on different media
5
0 1 2 3 4 5 6
sp
in
os
ad
A
sp
in
os
ad
D
0 1 2 3 4 5 6 7
sp
in
os
ad
A
sp
in
os
ad
D
7
10
15
20
25
30
35
40
45
5
10
15
20
25
30
35
40
45
吸
光
值
A
bs
or
ba
nc
e
(m
A
U
)
保留时间 Retention time (min)
吸
光
值
A
bs
or
ba
nc
e
(m
A
U
)
A
B

A：对照菌株多杀菌素产量的 HPLC分析 HPLC analysis of spinosad production in S. spinosa-1
B：重组菌株多杀菌素产量的 HPLC分析 HPLC analysis of spinosad production in S. spinosa-BldD
图 6 bldD基因过表达对刺糖多孢菌多杀菌素产量的影响
Fig. 6 Effects of bldD overexpression on spinosad production in S. spinosa
第 4期 蔡妹等：刺糖多孢菌 bldD基因过表达对多杀菌素合成及其孢子形成的影响 559

3 讨论
野生型刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成量极低且发酵周期长，促使人们对其进行菌种改良和发酵工
艺优化，提高多杀菌素产量。本研究利用基因工程方法构建 bldD 过表达载体 pUC-spn-PermE-bldD，通过
单交换同源重组将 bldD整合至刺糖多孢菌染色体上，获得重组菌株 S. spinosa-BldD。同时研究了 bldD的
过表达对刺糖多孢菌孢子形成及多杀菌素合成等方面的影响。
前人研究表明，BldD 蛋白的过量表达促使红色糖多孢菌产孢子时间明显提前[11]。本研究发现在 BHI
和 TSB培养基上，重组菌株孢子形成受到明显抑制，这可能是由于在不同的微生物内 BldD蛋白对细胞分
化具有不同的调控作用。链霉菌中次级代谢产物的合成受到复杂的调控作用，通过遗传修饰增加正调控基
因的表达，能有效提高有用发酵产物的产量。Bruheim等[13]导入途径特异性基因 actII-ORF4或全局性调控
基因 afsR2，均能有效激活变铅青链霉菌中沉默的放线紫红素生物合成基因簇，有效地促进了放线紫红素
的合成。在红色糖多孢菌中，BldD通过与整个 ery基因簇的启动子结合，促进 ery基因簇的表达，过量表
达 BldD 蛋白，能有效提高红霉素的产量[10,11]。本研究中重组菌株多杀菌素的产量相比于对照菌株显著提
高。BldD 是链霉菌中的一个全局性调控因子，受其调控的靶基因很多，涉及形态分化、信号转导、抗生
素合成、多糖代谢等方面。Den Hengst等[14]的研究表明，在天蓝色链霉菌中，bldD突变株与抗生素形成相
关的负调控基因 cnv9、nsdA等的表达水平明显提高。BldD能抑制支链氨基酸生物合成必需的 leuB、leuC
的表达[15]。乙酸盐是形成聚酮化合物的中间体的原料之一，约 50%乙酸盐来自支链氨基酸的分解代谢[16]。
此外，BldD蛋白可能通过调节生长稳定期三酰甘油（TAG）的转运以及多糖代谢来影响抗生素的产量[15,17]。
而有关 BldD在刺糖多孢菌中的具体调控网络有待进一步研究。
刺糖多孢菌具有较强的限制性修饰系统，因此对其进行遗传修饰存在一定的难度。目前对刺糖多孢菌
的遗传改造主要采用同源重组的方法，但同源重组效率较低，小于 1 kb的同源臂更是难以得到重组子。研
究中使用的穿梭载体 pUC-spn含有 28 kb多杀菌素基因簇部分基因，足够长的同源臂有利于提高重组效率。
原始载体 pUC-spn长达 39 kb，难以找到合适的单一限制性酶切位点对其进行改造。利用 Red/ET重组将置
于红霉素强启动子驱动下的 bldD基因插入 pUC-spn，构建 bldD基因过表达载体。此方法简便易行，特别
适合大质粒的修饰，同时为其他基因的克隆与 DNA修饰提供了重要参考。
参 考 文 献
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