全 文 ： Drug Evaluation Research 第 39 卷 第 2 期 2016 年 4 月

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藏紫菀总黄酮对模拟高原缺氧小鼠抗氧化能力及细胞凋亡的影响
何 蕾，马慧萍，景林临，蒙 萍，贾正平
兰州军区兰州总医院 药剂科，全军高原环境损伤防治重点实验室，甘肃 兰州 730050
摘 要：目的 探讨藏紫菀总黄酮对高原缺氧小鼠抗氧化能力及细胞凋亡的影响。方法 采用常压密闭实验筛选藏紫菀总黄
酮最佳抗缺氧剂量；40 只小鼠随机分为对照组、模型组、乙酰唑胺（200 mg/kg）组和藏紫菀总黄酮（500 mg/kg）组，模拟
海拔 8000 m 高原环境，减压缺氧 12 h，测定小鼠脑组织中的过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、还原型
谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，Western blotting 法检测 Nrf-2、SOD、Bcl-2 和 Bax 蛋白表达。结果 常
压密闭实验中，藏紫菀总黄酮 500 mg/kg 剂量组小鼠的存活时间最长，为最佳给药剂量；与对照组比较，缺氧后小鼠脑组织
中 SOD、CAT、GSH 和 GSH-Px 活性均显著降低，Nrf-2 蛋白表达显著升高，SOD 蛋白表达和 Bc1-2/Bax 比值显著降低
（P＜0.01）；经藏紫菀总黄酮预处理后，小鼠脑组织中 SOD、CAT、GSH 和 GSH-Px 活性均显著升高，Nrf-2、SOD 蛋白表
达和 Bcl-2/Bax 比值显著升高（P＜0.05、0.01）。结论 藏紫菀总黄酮提高高原缺氧小鼠脑组织抗氧化能力，降低细胞凋亡。
关键词：藏紫菀总黄酮；常压密闭缺氧；高原缺氧；抗氧化；凋亡
中图分类号：R965 文献标志码：A 文章编号：1674 - 6376 (2016) 02 - 0211 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.1674-6376.2016.02.011
Effects of total flavonoids from Aster souliei on hypoxia and apoptosis-ssociated
proteins in brain of mice under hypobaric hypoxia condition
HE Lei, MA Hui-ping, JING Lin-lin, MENG Ping, JIA Zheng-ping
Department of Pharmacy, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command of PLA; Key Lab of PLA for Prevention and Treatment of
Injuries induced by High Altitude, Lanzhou, 730050, China
Abstract: Objective To study the effects of total flavonoids from Aster souliei (ASF) on the expression of hypoxia-associated and
apoptosis-associated proteins in brain of mice under hypobaric hypoxia condition. Methods The best dose of ASF to antihypoxia was
determined by closed normobaric hypoxia experiment. Forty BALB/c mice were randomly divided into control group, model group,
acetazolamide (200 mg/kg) group, and ASF (500 mg/kg) group. The mice were exposed to a simulated high altitude of 8 000 m for 12
h. After hypoxic exposure, mice were sacrificed and the activities of catalase (CAT), supersxide dismutase (SOD), glutathione (GSH),
and reduced glutathione tablets (GSH-Px) in brain were determined. Nrf-2, SOD, Bax, and Bcl-2 were detected by Western blotting.
Results Compared with control group, the CAT, SOD, GSH, and GSH-PX activity in model group significantly decreased. In
addition, the expression of Nrf-2 increased, SOD and Bc1-2/Bax ratio decreased (P < 0.01). Prior administration of ASF effectively
increased CAT, SOD, GSH, and GSH-Px activity as well as the expression of Nrf-2, SOD, and Bc1-2/Bax ratio(P < 0.05, 0.01).
Conclusion ASF can improve the ability of anti-oxidant enzymes, alleviate oxidative stress as well as inhibit myocardial apoptosis of
mice under hypobaric hypoxia condition.
Key words: total flavonoids from Aster souliei; closed normobaric hypoxia; high altitude anoxia; anti-oxidant; apoptosis

高原地区占我国领土面积的三分之一，其特有
的低压低氧环境给急进高原的人们带来了许多疾病
危害。主要因为高原上机体无法获得足够量的氧气，
从而使初入高原者极易出现急性高原反应（acute
mountain sickness，AMS），继而可能出现脑水肿和
肺水肿，导致死亡[1]。而碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺
是美国 FDA 唯一批准用于防治 AMS 的药物，可以
明显改善气体交换和运动效率，减轻 AMS，但明显
的毒副作用限制了其广泛应用[2]。国内长期用红景
天制剂预防 AMS，但最新的临床研究表明，红景天

收稿日期：2016-01-21
基金项目：全军医药卫生科研基金课题（CLZ11JA06）；甘肃省自然科学基金（1107RJZA100）
作者简介：何 蕾，女，硕士，研究方向为抗高原缺氧新药。Tel: (0931)8994671 E-mail: helei800@163.com
*通信作者 马慧萍，女，教授，研究生导师，研究方向为抗高原环境损伤防护研究。Tel: (0931)8994652 E-mail: 360089525@qq.com
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的提取物对 AMS 无预防效果[3]。因此，开发新型的
抗高原缺氧的药物具有重要的意义。
AMS 发病机制复杂，但目前公认缺氧是其重要
的诱发因素之一。缺氧可抑制线粒体中的电子传递，
改变电子载体中的氧化还原电位，增加活性氧
（ROS）的产生，引起组织细胞发生氧化损伤而导致
凋亡，因此，防止细胞氧化损伤是防治 AMS 发生
的有效策略[4]。研究证明，藏紫菀总黄酮具有良好
的体外抗氧化作用和体内抗缺氧活性[5-6]。本研究首
先采用常压密闭缺氧实验对藏紫菀总黄酮进行剂量
筛选，选择最佳实验结果剂量，随后采用小型低压
低氧动物实验舱模拟高原低压性缺氧环境，进一步
研究其对高原缺氧小鼠脑组织抗氧化蛋白和凋亡蛋
白水平的影响，探讨其抗缺氧的可能机制。
1 材料
1.1 药物与主要试剂
藏紫菀，购自拉萨当雄商贸有限公司，经兰州
大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定为菊科紫
菀属植物缘毛紫菀 Aster souliei Franch.的干燥花序。
藏紫菀总黄酮为实验室自制，制备工艺为：取适量
藏紫菀药材，加 12 倍量水，提取 2 次，每次提取 2
h，60 ℃真空干燥。藏紫菀总黄酮质量分数可达到
29.70%，批号 20150107。
乙酰唑胺（批号 100114），购自武汉远城科技发
展有限公司；BCA 法蛋白定量、过氧化氢酶（CAT）、
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、还原型谷胱甘肽
（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，均购自
南京建成生物工程研究所；Nrf-2、SOD、Bax 和 Bcl-2
兔单克隆抗体，均购自 abcam 公司；β-actin 山羊抗
小鼠单克隆抗体、IgG/辣根酶标记抗体和辣根标记山
羊抗兔 IgG，均购自北京中杉金桥生物技术有限公
司；ECL 超敏发光液，购自美国 Sigma 公司。
1.2 主要仪器
FLYDWC50-IIC 低压低氧动物实验舱（贵州风
雷航空军械有限公司）；DK-8A 型电热恒温水槽（上
海精宏实验设备有限公司）；冷冻高速离心机（德国
赫利氏公司）； Spectramax i3 多功能酶标仪
（Molecular Devices 公司）；Tanon-4200SF 数码凝胶
图像分析系统（上海天能科技有限公司）。
1.3 动物
SPF 级雄性 BALB/c 小鼠，体质量（20±2）g，
由兰州军区兰州总医院动物实验科提供，生产许可
证号 SCXK（军）2014-0029。温度 21～23 ℃、湿
度 45%～65%、12 h 明暗周期饲养，全价颗粒饲料
喂养，自由进食和饮水。
2 方法
2.1 常压密闭缺氧实验
将 SPF 级雄性 BALB/c 小鼠随机分成 5 组，模
型组，乙酰唑胺（200 mg/kg）组，藏紫菀总黄酮低、
中、高剂量（300、500、700 mg/kg）组，每组 10
只。ig 给药，模型组给予同等体积生理盐水，50 min
后将小鼠放入 250 mL 广口瓶中（瓶中事先放入 5 g
碱石灰，用于吸收二氧化碳和水，在瓶底放入适量
滤纸吸取尿液与粪便），在瓶口涂抹凡士林进行密
闭，随后开始计时，当小鼠呼吸停止时结束计时，
记录小鼠在密闭实验瓶中的存活时间。
2.2 高原低压缺氧脑损伤模型的制备
随机数字表法将小鼠分为对照组、模型组、乙
酰唑胺（阳性药，200 mg/kg）组、藏紫菀总黄酮（500
mg/kg）组，每组 10 只，ig 给药，对照组和模型组
给予等体积生理盐水。给药 50 min 后，除对照组外，
将其余 3 组小鼠置于低压低氧动物实验舱中，以 10
m/s 的速度升至海拔 8 000 m，并维持 12 h，随后快
速将实验舱中气压升至与外界大气压相同，将小鼠
取出实验舱后，立刻脱臼处死，取脑组织。
2.3 抗氧化酶活性测定
取小鼠脑组织样本，称质量后加入 9 倍冰生理
盐水，使用组织匀浆器在冰水浴中匀浆，4 ℃、3 500
r/min 离心 10 min，取上清，－20 ℃保存，用作抗
氧化酶指标 CAT、SOD、GSH-Px、GSH 水平测定，
具体操作严格按照相关试剂盒说明书进行。
2.4 氧化和凋亡相关蛋白表达水平的测定
取小鼠脑组织样本，称质量后加入 9 倍冰生理
盐水，使用组织匀浆器在冰水浴中匀浆，4 ℃、
12 000 r/min 离心 15 min，取上清，采用 BCA 法计
算蛋白浓度。蛋白样品中加入 4×上样缓冲液，沸
水煮 15 min，－20 ℃保存备用。进行 Western
blotting 实验，取 30 μg 样品上样，采用 5%
SDS-PAGE 浓缩胶、10% SDS-PAGE 分离胶进行分
离，湿法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶
封闭 2 h 后，加入一抗，包括 Nrf-2、SOD、Bcl-2 和
Bax（1:500）和 β-actin（1:1000），4 ℃过夜，TBST
缓冲液漂洗 3 次，每次 10 min。加入二抗，除 β-actin
蛋白使用山羊抗小鼠 IgG/辣根酶标记抗体（1:
2 000），其余均用辣根标记山羊抗兔 IgG（1:5 000），
室温孵育 2 h，化学发光法显色，Tanon-4200SF 全
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自动数码凝胶图像分析系统曝光，灰度值用
Image-Pro Plus 6.0 软件扫描测定。
2.5 统计学分析
数据均以 ±x s 表示，采用 SPSS 13.0 软件进行
统计学分析，两间组均值比较采用 t 检验。
3 结果
3.1 对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响
为了考察藏紫菀总黄酮的最佳有效剂量，本研
究通过常压密闭实验对小鼠的存活时间进行了考
察。与模型组比较，乙酰唑胺和藏紫菀总黄酮中、
高剂量组均能显著地延长小鼠的存活时间（P＜
0.01），其中藏紫菀总黄酮中剂量组小鼠的存活时间
最长，为最佳给药剂量。结果见表 1。
表 1 藏紫菀总黄酮对常压密闭缺氧小鼠存活时间的影响
( x±s, n = 10)
Tabel 1 Effects of ASF on survival time of mice under closed
normobaric hypoxia ( x±s, n = 10)
组别 剂量/(mg·kg−1) 存活时间/min 延长率/%
模型 — 30.09±3.78 —
乙酰唑胺 200 38.24±2.46** 27.09
藏紫菀总黄酮 300 34.80±8.30 15.65
500 49.30±8.50** 63.84
700 40.80±4.50** 35.59
与模型组比较：**P＜0.01
**P < 0.01 vs model group
3.2 对脑组织 CAT、SOD 和 GSH-Px 活性、GSH
水平的影响
与对照组比较，模型组 CAT、SOD 和 GSH-Px
活性，GSH 水平均显著降低（P＜0.01）；与模型组
比较，乙酰唑胺组 CAT 和 SOD 活性有升高趋势，但
差异不显著，而藏紫菀总黄酮显著提高 CAT 和 SOD
活性（P＜0.01）；乙酰唑胺和藏紫菀总黄酮组小鼠脑
组织中 GSH 和 GSH-Px 活性均显著升高（P＜0.01）。
结果见表 2。
3.3 对脑组织 Nrf 2、SOD 蛋白表达的影响
与对照组比较，模型组小鼠脑组织中 Nrf 2 的
蛋白表达显著升高（P＜0.01），SOD 的蛋白表达显
著降低（P＜0.01）；乙酰唑胺可明显升高脑组织中
Nrf 2 蛋白表达（P＜0.05），藏紫菀总黄酮可明显升
高脑组织中 Nrf 2 和 SOD 蛋白表达（P＜0.01）。结
果见图 1。
3.4 对凋亡相关蛋白 Bcl-2 和 Bax 表达的影响
与对照组比较，模型组 Bcl-2/Bax 蛋白比值显
著降低（P＜0.01），说明急性减压缺氧可以造成
小鼠脑组织细胞凋亡；给予藏紫菀总黄酮后，脑
组织中 Bcl-2/Bax 蛋白比值显著升高（P＜0.01），
说明藏紫菀总黄酮具有抗细胞凋亡的作用。结果
见图 2。
表 2 藏紫菀总黄酮对高原缺氧小鼠脑组织 CAT、SOD 和 GSH-Px 活性、GSH 水平的影响 ( x±s, n = 10)
Tabel 2 Effects of ASF on CAT, SOD, and GSH-Px activity, GSH levels in brain of mice under hypobaric hypoxia condition
( x±s, n = 10)
组别 剂量/(mg·kg−1) CAT/(U·g−1) SOD/(U·g−1) GSH/(mmol·g−1) GSH-Px/(U·g−1)
对照 — 125.69± 8.56 127.72±12.03 90.68±8.67 90.68±8.27
模型 — 87.57±11.18## 98.77± 4.57## 79.08±7.40## 71.08±7.04##
乙酰唑胺 200 94.79± 7.32 108.21± 8.99 167.76±6.11** 165.76±6.71**
藏紫菀总黄酮 500 118.91±13.31** 139.16±10.68** 140.91±9.91** 148.91±9.19**
与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01
##P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs model group



与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group
图 1 藏紫菀总黄酮对高原缺氧小鼠脑组织抗氧化相关蛋白表达的影响 ( x±s, n = 3)
Fig. 1 Effect of ASF on anti-oxidation associated proteins in brain of mice under hypobaric hypoxia condition ( x±s, n = 3)
Nrf 2
SOD
β-actin
3
2
1
0
63×103
16×103
43×103
0.8
0.6
0.4
0.2
0
N
rf
-2
/β-
ac
tin

SO
D
/β-
ac
tin

对照 模型 乙酰唑胺 藏紫菀总黄酮 对照 模型 乙酰唑胺 藏紫菀总黄酮 对照 模型 乙酰唑胺 藏紫菀总黄酮
## *
**
## ***
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与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group
图 2 藏紫菀总黄酮对高原缺氧小鼠脑组织中凋亡相关蛋白
表达的影响 ( x±s, n = 3)
Fig 2 Effect of ASF on apoptosis - associated proteins in
brain of mice under hypobaric hypoxia condition ( x
±s, n = 3)
4 讨论
脑是机体主要的耗氧器官之一，脑组织对低压
低氧环境极其敏感。缺氧能够引起脑组织中的自由
基代谢失衡，产生的 HO 损害膜磷脂不饱和酸，使
磷脂降解生成花生四烯酸，后者在级联反应中产生
更多的自由基，上述过程循环往复，加重脑组织损
害，从而导致记忆损伤，思维反应迟缓，严重时可
出现脑水肿危及生命[7-9]。本课题组前期发现藏紫菀
总黄酮具有良好的体外清除自由基作用以及体内良
好的抗缺氧作用，但是作用机制尚不明确。
缺氧诱导脑组织产生大量自由基，如果不能及
时处理，就会导致机体产生氧化应激损伤[10]。而
SOD、CAT、GSH 和 GSH-Px 是机体内主要的抗氧
化酶系，对机体的氧化和抗氧化平衡起着重要的作
用，帮助机体清除自由基，保护细胞免受损伤[11]。
研究结果显示，高原缺氧模型小鼠脑组织中 SOD、
CAT、GSH 和 GSH-Px 活性显著降低，说明机体氧
化应激产生大量 ROS，抑制 SOD、CAT、GSH 和
GSH-Px 活性。与模型组比较，藏紫菀总黄酮显著
提高小鼠脑组织中 SOD、CAT、GSH 和 GSH-Px 活
性，改善低压低氧所致的氧化应激失调，维持脑组
织中的氧化和抗氧化平衡。
研究发现，核因子 2（NF-E2）相关因子（Nrf 2）
是调控细胞对抗氧化损伤的关键转录因子，Nrf 2
在氧化应激性疾病中起着重要的调控作用[12]。Nrf 2
的激活可诱导一系列内源性抗氧化酶和抗氧化蛋白
上调，这些酶类和蛋白可催化自由基转化为无毒物
质并增加其水溶性，协同加强细胞清除自由基的防
御系统，维持细胞内还原电位[13-14]。实验结果表明，
与对照组比较，模型组小鼠脑组织中 Nrf 2 显著升
高，SOD 显著降低，说明在氧自由基的刺激下，机
体产生相应的抗氧化调节，Nrf 2 降解减少，相对水
平升高，但大量的氧自由基仍消耗了大量 SOD。与
模型组比较，藏紫菀总黄酮组 Nrf 2 水平显著升高，
SOD 水平显著升高，说明藏紫菀总黄酮可以促进
Nrf 2 的产生，从而刺激机体产生更多的 SOD。结
果表明，藏紫菀总黄酮可能通过 Nrf 2-ARE 通路防
治急性高原病。
ROS 是细胞内重要的第二信使，在细胞基因调
控“信号转导”过程中发挥重要生理功能。大量 ROS
可诱导前列腺素等细胞因子释放，导致细胞的损伤
和凋亡。大量文献报道缺氧会造成细胞凋亡，其可
能原因就是缺氧诱导大量ROS产生[15]。Bcl-2和Bax
是 Bcl-2 家族的关键蛋白，在凋亡途径中发挥着截
然相反的作用。其中 Bcl-2 被称为抗凋亡蛋白，能
够通过抑制细胞色素 c 的释放抑制凋亡，而 Bax 被
称为促凋亡蛋白，其过度表达能够促进细胞凋亡[16]。
通过 Bcl-2/Bax 比率可以反映细胞凋亡的趋势。与对
照组比较，模型组比值降低，说明缺氧造成细胞凋
亡。藏紫菀总黄酮组比值显著升高，说明藏紫菀总
黄酮在抑制细胞缺氧凋亡方面有一定的药理作用。
综上所述，藏紫菀总黄酮对缺氧造成的损伤具
有缓解作用，与升高体内抗氧化酶 CAT、SOD、GSH
和 GSH-Px 活性、激活 Nrf 2 信号通路有关，同时，
通过抑制促凋亡蛋白 Bax、激活抗凋亡蛋白 Bcl-2，
发挥抗凋亡作用。
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对照 模型 乙酰唑胺 藏紫菀总黄酮
Bcl-2
Bax
β-actin
2
1
0
B
cl
-2
/B
ax

26×103
20×103
43×103
对照 模型 乙酰唑胺 藏紫菀总黄酮
## ***
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