全 文 ：China Pharmacy 2016 Vol. 27 No. 13 中国药房 2016年第27卷第13期
Δ基金项目：全军医药卫生科研基金课题（No.CLZ11JA06）；甘肃
省自然科学研究基金计划项目（（No.1107RJZA100）
＊药师，硕士。研究方向：药物分析、药理学。E-mail：helei800@
163.com
#通信作者：教授，硕士生导师。研究方向：天然药物化学、药理
学。E- mail：360089525@qq.com
藏紫菀为菊科植物缘毛紫菀Aster souliei Franch.的干燥花
序，多年生草本植物，生长在海拔3 000～4 500 m的高原地区，
主要分布于西藏、青海、四川、甘肃、云南等地[1-2]。其具有清热
解毒、镇咳祛痰之效，临床上用于瘟疫病、中毒症、支气管炎、
咳嗽气喘、咳吐脓血等的治疗[3-5]。有关藏紫菀的化学成分，有
文献进行了系统研究[6-7]，并从中分离得到包括芦丁、槲皮素等
多种黄酮类化合物，但目前尚未见对藏紫菀总黄酮成分的活
性进行深入研究的文献报道。本课题组前期研究发现，藏紫
菀具有抗高原缺氧的作用，且活性超过公认的抗缺氧药红景
天胶囊和乙酰唑胺，并确定藏紫菀总黄酮成分是其抗缺氧作
用的活性成分。为充分开发利用这一资源，本试验对藏紫菀
总黄酮的提取工艺进行研究。
目前我国在中成药制备中，普遍注重提取的产量，往往忽
视了最根本的药效因素。故本试验首先采用小鼠常压密闭缺
氧耐力实验考察藏紫菀不同溶剂提取物的抗缺氧活性，再优
选出提取溶剂，进而采用单因素和正交试验，以浸膏得率和总
黄酮含量为评价指标，优化藏紫菀总黄酮的提取工艺，以获得
提取方法简便、提取率高、适合工业化大生产的提取工艺。
1 材料
1.1 仪器
UV2800SPC型紫外-可见分光光度计（上海舜宇恒平科学
仪器有限公司）；SK3300LH型超声清洗机（上海科导超声仪
器有限公司）；AE200型电子天平（上海梅特勒-托利多公司）；
H.HS型电热恒温水浴锅（北京长风仪器仪表公司）；RE-52A型
旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真
空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；HWB-2型电热恒温培养干燥
两用箱（厦门医疗电子仪器厂）；BPZ-6033LC型真空干燥箱
（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.2 药材、药品与试剂
藏紫菀[购自拉萨当雄商贸有限公司，批号：140712，经兰
州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定为菊科紫菀属植
物缘毛紫菀（Aster souliei Franch.）的干燥花序]；芦丁对照品
（中国食品药品检定研究院，批号：10753-200413，供含量测定
用）；乙酰唑胺原料药（武汉远城科技发展有限公司，批号：
100114，纯度：98％）；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试
剂均为分析纯。
1.3 动物
SPF级BALB/c小鼠，♂，体质量为（20±2）g，购自甘肃中
小鼠抗缺氧活性实验结合正交试验优选藏紫菀中总黄酮的提取
工艺Δ
何 蕾＊，马慧萍#，李兰茹，贾正平（兰州军区兰州总医院药材科，兰州 730050）
中图分类号 R283 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2016）13-1832-04
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.13.30
摘 要 目的：优选藏紫菀中总黄酮的提取工艺。方法：通过小鼠常压密闭缺氧耐力实验筛选提取藏紫菀中总黄酮的溶剂（水、
60％乙醇、95％乙醇）；以浸膏得率和总黄酮含量为指标，采用单因素和正交试验筛选提取溶剂加入量、提取时间和提取次数的最
优水平，并进行验证试验。结果：提取溶剂为水时小鼠存活时间最长；最优提取工艺为加12倍量水，回流提取2次，每次2 h；验证
试验中总黄酮平均含量为 29.70％（RSD＝0.54％，n＝3）、浸膏得率平均为 24.58％（RSD＝0.48％，n＝3）。结论：优选的提取工艺
条件稳定、可行，可为藏紫菀总黄酮的开发利用提供科学依据。
关键词 藏紫菀；总黄酮；小鼠；常压密闭缺氧耐力实验；含量测定；正交试验；提取工艺
Optimization of the Extraction Technology of Total Flavonoids from Aster souliei by Orthogonal Test Com-
bined with Anti-hypoxia Activity Test of Mice
HE Lei，MA Huiping，LI Lanru，JIA Zhengping（Dept. of Pharmacy，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Mili-
tary Command，Lanzhou 730050，China）
ABSTRACT OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of total flavonoids from Aster souliei. METHODS：Atmospher-
ic pressure closed hypoxia tolerance test of mice was used to screen the solvents（water，60％ ethanol，95％ ethanol）for the ex-
traction of total flavonoids from A. souliei. Using extract yield and the content of total flavones as index，single factor test and or-
thogonal test were used to screen the amount of solvent，extraction time and extraction times. The validation test was also conduct-
ed. RESULTS：When the extraction solvent was water，the survival time of the mice was the longest. The optimized extraction tech-
nology was as follows as 12-fold water，extracting for 2 times，lasting for 2 h each time；average content of total flavonoids in vali-
dation test was 29.70％（RSD＝0.54％，n＝3）and extract yield was 24.58％（RSD＝0.48％，n＝3）. CONCLUSIONS：The opti-
mized extraction technology is stable and feasible，and can provide scientific evidence for the development and utilization of total
flavonoids from A. souliei.
KEYWORDS Aster souliei；Total flavones；Mice；Atmospheric pressure closed hypoxia tolerance test；Content determination；
Orthogonal test；Extraction technology
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中国药房 2016年第27卷第13期 China Pharmacy 2016 Vol. 27 No. 13
医学院，动物合格证号：SCXK（甘）2011-0001，在兰州军区总
医院动物实验中心进行饲养。动物自由摄取水和饲料。实验
开始前，正常饲养1周，以适应环境，自第2周开始实验。饲养
室保持良好通风，控制环境温度在 24～26 ℃、湿度 50％～
60％、12 h循环光照。
2 方法与结果
2.1 总黄酮含量的测定
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品 49.2 mg置
于 100 ml量瓶中，加 60％乙醇使其溶解并定容。分别精密吸
取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，置于25 ml量瓶中，各加60％乙
醇定容，即得不同质量浓度的芦丁对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取藏紫菀提取物干粉 0.10
g，置于 50 ml量瓶中，加 60％乙醇，超声（功率 250 W，频率 40
kHz）30 min，再用60％乙醇定容至刻度，混匀，即得。
2.1.3 标准曲线的制备 分别精密量取不同质量浓度对照品
溶液 1 ml，依次加入 5％亚硝酸钠溶液 1 ml、10％硝酸铝溶液
1 ml、氢氧化钠试液10 ml、60％乙醇适量，摇匀，放置15 min后
在 510 nm波长处测定吸光度（A）。以A为纵坐标、质量浓度
（c）为横坐标进行线性回归，得线性回归方程：A＝0.012 5c－
0.000 6（r＝0.999 7），表明芦丁检测质量浓度线性范围为
9.84～59.04 µg/ml。
2.1.4 稳定性、精密度、重复性、准确度试验 按相关方法进
行试验。结果，稳定性试验中供试品溶液在 50 min内稳定
（RSD＝0.53％，n＝6），精密度和重复性试验的 RSD分别为
0.17％、1.18％（n＝6），样品平均回收率为 98.38％（RSD＝
2.01％，n＝6）。
2.2 藏紫菀不同溶剂提取物的小鼠抗缺氧活性实验
分别选取水、60％乙醇和95％乙醇提取藏紫菀药材粗粉，
采用真空干燥制得提取物干粉待用。将小鼠随机分成缺氧模
型组、乙酰唑胺组（阳性对照药）、水提取组、60％乙醇提取组
和 95％乙醇提取组，每组 10只。其中乙酰唑胺剂量为 200
mg/kg（由前期实验筛选出的有效剂量），藏紫菀提取物剂量为
500 mg/kg（由前期实验筛选出的有效剂量），缺氧模型组给予
生理盐水。各组均灌胃给药，50 min后将小鼠放入 250 ml广
口瓶中（瓶中事先放入5 g碱石灰，用于吸收二氧化碳与水分，
并且在瓶底放入适量滤纸吸取尿液与粪便），在瓶口涂抹凡士
林进行密闭，随后开始计时，当小鼠呼吸停止时结束计时，记
录小鼠在密闭实验瓶中的存活时间。结果，各藏紫菀提取物
组小鼠存活时间均长于缺氧模型组，其中水提取物组延长率
[（实验组存活时间－缺氧模型组存活时间）/缺氧模型组存活
时间×100％]达35.54％，表明藏紫菀水提取物的抗缺氧活性最
优（各组数据采用 t检验），故以下试验选取水为提取溶剂。各组
小鼠抗缺氧活性比较详见表1。
表1 各组小鼠抗缺氧活性比较（x±s，n＝10）
Tab 1 Comparison of anti-hypoxia activity of mice in each
group（x±s，n＝10）
组别
缺氧模型组
乙酰唑胺组
水提取组
60％乙醇提取组
95％乙醇提取组
给药剂量，mg/kg
200
500
500
500
存活时间，min
31.23±2.57
36.42±4.55＊
42.33±3.19＊＊
37.60±3.48＊
35.13±3.98＊
延长率，％
16.62
35.54
20.40
12.49
注：与缺氧模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
Note：vs. hypoxia model group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
2.3 提取工艺的单因素试验
2.3.1 溶剂加入量对总黄酮含量的影响 精密称定 5份藏紫
菀药材粉末各 20 g，以加水倍量为变量（8、10、12、14、16倍药
材量），考察其对总黄酮含量的影响，结果见图1。
由图1可见，不同加水倍量下总黄酮含量分别为19.21％、
23.77％、27.68％、27.21％、27.11％。随着溶剂量的增加，总黄
酮的含量也随之增加，这是因为溶剂量的增大会增加总黄酮
的溶出；当溶出达到最大值后，随溶剂量的增加，含量略有下
降，这可能是因总黄酮溶出达饱和而杂质物溶出相对增加所
致。因此选取加水倍量为8、10、12倍药材量进行正交试验。
2.3.2 提取时间对总黄酮含量的影响 精密称定 5份藏紫菀
药材粉末各 20 g，以提取时间为变量（1、1.5、2、2.5、3 h），其余
条件为加水倍量10倍、提取3次，考察提取时间对总黄酮含量
的影响，结果见图2。
由图2可见，不同提取时间下总黄酮含量分别为24.54％、
26.78％、29.62％、29.87％、30.03％。总黄酮含量随提取时间
延长而增加，提取时间在2 h以后呈缓慢上升的趋势。因此选
取提取时间1、1.5、2 h进行正交试验。
2.3.3 提取次数对总黄酮含量的影响 精密称定 5份藏紫菀
药材粉末各 20 g，以提取次数为变量（1、2、3、4、5次），其余条
件为加水倍量10倍、提取1.5 h，考察提取次数对总黄酮含量的
影响，结果见图3。
图1 加水倍量对藏紫菀总黄酮含量的影响
Fig 1 Effects of the amount of water on total flavonoids
from A. souliei
30
25
20
15 8 10 12 14 16
加水倍量
总
黄
酮
含
量
，％
图2 提取时间对藏紫菀总黄酮含量的影响
Fig 2 Effects of extraction time on the content of total flavo-
noids from A. souliei
35
30
25
20
1 1.5 2 2.5 3
提取时间，h
总
黄
酮
含
量
，％
图3 提取次数对藏紫菀总黄酮含量的影响
Fig 3 Effects of extraction times on the content of total fla-
vonoids from A. souliei
31
29
27
25
1 2 3 4 5
提取次数
总
黄
酮
含
量
，％
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China Pharmacy 2016 Vol. 27 No. 13 中国药房 2016年第27卷第13期
由图 3可见，各提取次数下总黄酮含量分别为 26.38％、
28.91％、29.07％、29.12％、29.25％。总黄酮含量在提取3次后
呈缓慢上升的趋势，但是上升程度不大。因此选取提取次数
1、2、3次进行正交试验。
2.4 提取工艺的正交试验
选取加水倍量、提取时间、提取次数为考察因素，每个因
素选取3个水平，因素与水平见表2。
表2 因素与水平
Tab 2 Factors and levels
水平
1
2
3
A（加水倍量）
8
10
12
因素
B（提取时间），h
1
1.5
2
C（提取次数）
1
2
3
采用L9（34）正交设计，取药材分别加水浸泡 12 h后加热
回流提取，过滤，合并药液，减压浓缩成稠膏，转移至干燥至恒
质量的蒸发皿中，放入真空干燥箱中 70℃干燥 60 h，得干膏，
精密称定质量，备用。
以藏紫菀提取物中浸膏得率、总黄酮含量为评价指标，采
用综合评分法进行数据处理，权重系数分别为0.3和0.7。浸膏
得率＝浸膏干粉质量/药材质量×100％；综合评分＝（浸膏得
率/浸膏得率最大值）×30+（总黄酮含量/总黄酮含量最大值）×
70。正交试验结果见表3；方差分析结果见表4。
表3 正交试验结果
Tab 3 Results of orthogonal test
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
因素
A
8
8
8
10
10
10
12
12
12
68.98
72.44
75.46
6.474
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
57.86
66.86
92.15
34.29
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
67.53
78.69
70.65
11.16
D（空白）
1
2
3
3
1
2
2
3
1
71.25
73.05
72.58
1.806
指标
浸膏得率，％
19.69
24.23
26.69
20.22
24.14
25.35
21.25
23.37
27.29
总黄酮，％
12.19
19.91
26.33
19.22
17.03
27.39
16.61
17.99
32.06
综合评分
48.75
70.71
87.49
64.69
64.32
88.30
60.15
65.55
100.67
表4 方差分析结果
Tab 4 Results of variance analysis
因素
A
B
C
误差
偏差平方和
62.950
1 896.497
198.794
62.950
自由度
2
2
2
2
均方差
31.411
948.342
99.735
F
1.000
30.127
3.158
P
＜0.05
注：F0.05（2，2）＝19
Note：F0.05（2，2）＝19
由表3和表4可知，各因素对综合评分的影响大小顺序为
B＞C＞A；每个因素 3个水平之间的影响大小为A3＞A2＞A1，
B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，其中因素B（提取时间）对提取结果有
显著性影响（P＜0.05）。综合直观分析与方差分析的结果，优
选出最优提取工艺为A3B3C2，即加入 12倍量的水，每次提取 2
h，共提取2次。
2.5 验证试验
为确证该工艺的稳定性，据所筛选的最优工艺条件提取3
批样品，取样量均为 200 g。结果浸膏得率分别为 24.12％、
25.08％、24.54％（RSD＝0.48％，n＝3），总黄酮含量分别为
29.18％、30.26％、29.66％（RSD＝0.54％，n＝3），综合评分分别
为 96.35、100、97.97（RSD＝1.08％，n＝3），表明优选的工艺条
件稳定、可行。
3 讨论
黄酮类化合物因具有抗氧化、抗炎、镇痛、降脂等作用而
成为近年来的研究热点[8-10]。藏紫菀中已发现以芦丁、槲皮素
为代表的大量黄酮类成分的存在，具有较好的开发利用价
值。本课题组前期发现藏紫菀总黄酮具有良好抗缺氧活性，
考虑到有利于药物研究开发，因此对其提取工艺进行优化。
目前总黄酮的含量测定方法主要原理是显色剂与黄酮类
化合物可形成有色络合物，然后以芦丁为对照品，采用分光光
度法进行比色测定。文献报道的显色方法中的显色剂主要有
三氯化铝[11]、二氯氧锆[12]和亚硝酸钠-硝酸铝[13]3种。笔者经过
比较后发现，当测定藏紫菀总黄酮含量时，采用前 2种显色剂
显色后芦丁对照品和样品溶液的波形差异较大，而采用第3种
显色剂显色后芦丁对照品和样品溶液在510 nm波长处均有最
大吸收，故本试验选用亚硝酸钠-硝酸铝为显色剂测定总黄酮
含量。试验中发现该方法显色稳定，线性关系良好，重复性、
回收率及精密度均达到定量分析的方法学考察要求，且简便
易行。
对不同溶剂提取的藏紫菀总黄酮进行抗缺氧药效实验，
其中选取提取物来比较药效的原因是：在醇提物和水提物比
较中，测定出总黄酮的含量有差异，水提物中总黄酮含量更
高，表明水提取总黄酮更为有效；在后期实验中，笔者又对藏
紫菀总黄酮进行富集和纯化，其纯化效果更优于水提物，表明
了藏紫菀总黄酮确实是其有效部位。因此相同质量提取物药
效的比较，可以优选提取溶剂来提取出有效成分。在小鼠密
闭缺氧实验中发现，水提取物组的小鼠存活时间最长，优于不
同体积分数的乙醇提取物组。这表明采用水为溶剂，能够将
藏紫菀中有效成分总黄酮充分提取，从而发挥其最大抗缺氧
药效；且水提取法溶剂为水，具有成本低、污染小的优点，可为
其后续工业化大生产的推广应用提供便利。
在本试验中，以总黄酮含量和出膏率为评价指标，使该提
取工艺同时兼顾理化指标与药效学指标，较单纯理化指标的
提取筛选工艺相对更科学、合理。本试验结果为藏紫菀总黄
酮的开发利用提供了科学依据。
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中国药房 2016年第27卷第13期 China Pharmacy 2016 Vol. 27 No. 13
Δ基金项目：江苏省科技项目（No.BK20141093）
＊硕士研究生。研究方向：中药炮制机制及质量标准。E-mail：
fandana@126.com
#通信作者：教授，博士生导师。研究方向：中药炮制机制及质量
标准。电话：025-68193567。E-mail：bccai@126.com
Box-Behnken响应面法结合多指标综合加权法优选升麻中酚酸
类成分的提取工艺Δ
范孟雪 1，2，3＊，秦昆明 1，2，3，丁 斐 3，黄雨婷 1，2，3，蔡宝昌 1，2，3 #（1.南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验室，南京
210046；2.南京中医药大学国家教育部中药炮制规范化及标准化工程研究中心，南京 210023；3.南京海昌中药
集团有限公司/江苏省企业研究生工作站，南京 210061）
中图分类号 R983 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2016）13-1835-04
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.13.31
摘 要 目的：优化升麻中酚酸类成分的提取工艺。方法：在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、回流提取时间和液料比3个
因素为自变量，以咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸含量和浸出物得率的综合评分为因变量，采用基于Box-Behnken设计的响应面法优化
升麻中酚酸类成分的提取工艺。结果：最优提取工艺为以8倍药材量的70％乙醇提取2次，每次200 min。验证试验结果表明，综
合评分指标的预测值与实测值相对偏差仅为2.20％。结论：优选的提取工艺方法简单、稳定可行，可为后续升麻药材的制剂生产
提供参考。
关键词 升麻；咖啡酸；阿魏酸；异阿魏酸；含量；浸出物得率；Box-Behnken设计；响应面法；提取工艺
Optimization of the Extraction Technology of Phendic Acids in Cimicifugae foetidae by Using Box-Behnken
Response Surface Methodology Combined with Multi-index Comprehensive Weighted Method
FAN Mengxue1，2，3，QIN Kunming1，2，3，DING Fei3，HUANG Yuting1，2，3，CAI Baochang1，2，3（1.Jiangsu Key Lab of
TCM Processing，Nanjing University of TCM，Nanjing 210046，China；2.National Reengineering Research Cen-
ter for Standardization of TCM Processing，Nanjing University of TCM，Ministry of Education，Nanjing
210023，China；3.Nanjing Haichang TCM Group Company Limited/Enterprises Graduate Workstation in Jiangsu
Province，Nanjing 210061，China）
ABSTRACT OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of phenolic acids from Cimicifugae foetidae. METHODS：
Based on single factor test，the extraction technology of phenolic acids from C. foetidae was optimized by response surface method-
ology based on Box-Behnken design using ethanol volume fraction，reflux extraction time and liquid to solid ratio as independent
variables，comprehensive score of the content of caffeic acid，ferulic acid and isoferulic and extract yield as dependent variable. RE-
SULTS：The optimal extraction technology was as follows as 8-fold 70％ ethanol，extracting for 2 times，200 min each time. Re-
sults of validation test indicated that the difference between predicted value of comprehensive score indicators and measured value
was 2.20％. CONCLUSIONS：The optimal extraction technology is simple，stable and feasible，and can provide reference for fol-
lowing production of C. foetidae preparation.
KEYWORDS Cimicifugae foetidae；Caffeic acid；Ferulic acid；Isoferulic acid；Content；Extract yield；Box-Behnken design；
Response surface methodology；Extraction technology
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（收稿日期：2015-09-08 修回日期：2015-11-18）
（编辑：刘 萍）
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