全 文 ：第 30卷　第 3期
1998年 5月
生物化学与生物物理学报
ACTA BIOCHIM ICA et BIOPHYSICA SINICA
Vo l. 30, No. 3
May, 1998
收稿日期: 1997— 09— 12　　接受日期: 1997— 10— 27
噬菌体展示的豆蔻酰转移酶抑制肽
序列结构和功能研究
许正平　陈　虎　段治军　李伯良
( 中国科学院上海生物化学研究所 , 上海 200031 )
摘要　　对一个具有很强的抑制豆蔻酰转移酶 ( NM T )活性的抑制肽噬菌体所展示的随机区 15肽序列 TW-
PVV HGACRAHGHC进行关键氨基酸残基的单点、双点和缺失等一系列突变研究 , 以确定其功能区段。结果显示
W2A、 H6N和 H6R突变使抑制活性明显下降 , P3A、 V4V5→ A4A5双点突变对活性也有一定的影响 , 而 V4V 5→
W4W5、 H12N、 H14N、 C9S、 C15S、Δ C15、Δ H14C15和 Δ C9～ C15等突变则基本上不影响抑制作用。表明 W2、 P3和
H6在该抑制肽与 NM T的作用中是重要的 , 而且 P3与 H6之间的氨基酸倾向于带较大侧链基团的残基。 C9～
C15间的序列在抑制作用中无明显贡献。提示该抑制肽功能区域位于 N端的 8个氨基酸残基中。
关键词 　　豆蔻酰转移酶 ; 抑制肽噬菌体 ; 点突变 ; 结构功能关系
　　豆蔻酰辅酶 A∶蛋白质 N端豆蔻酰转移酶
( my ristoy l CoA∶ pro tein N-myristoyl t ransferase,
N MT)是抗肿瘤、抗病毒、抗真菌感染等治疗的重要
靶蛋白 [ 1, 2]。为了开展肿瘤和艾滋病治疗药物的分
子筛选工作 , 我们建立了基于噬菌体展示随机肽库
的 NMT抑制肽噬菌体筛选系统 , 并从噬菌体展示
随机 15肽库中筛选到了具有明显抑制 NMT活性
的抑制肽噬菌体 [3 ]。抑制肽噬菌体所展示的随机肽
序列中包含 PX( 0～ 3) H/R或 H/RX( 0～ 3) P特征性结
构 , 该结构在抑制肽与 NM T的作用中是否是关键
的? 需要在 DNA水平上进行逐点的点突变研究加
以确定。为了人工合成有活性的多肽 , 必须通过缺
失突变框定随机肽中真正发挥作用的最小功能区
段。
展示有 TWPVVHGACRAHGHC的抑制肽噬
菌体 (命名为 Pinh )可抑制 90%左右的 NMT活性 ,
是我们实验室利用包被法和固相柱法两种筛库方法
均筛选到的抑制肽噬菌体 , 因此被选作进一步研究
的对象。通过单点、双点和缺失等一系列突变研究 ,
成功地确定了该序列中的关键氨基酸残基 , 并将最
小功能区段框定在 N端 8个氨基酸内 , 为进一步人
工合成肽研究提供了指导。
材 料 和 方 法
1. 1　材料
1. 1. 1　质粒、菌种和噬菌体　　表达质粒 pMFT-
7-5-NMT含酵母豆蔻酰转移酶 ( N M T)基因。表达
质粒 pZPmCα4H携带 C端截短 96 bp并与 His6融
合的 cAPK催化亚基 α基因。以上质粒均由本组构
建。大肠杆菌 BL21( DE3)含有 λ融源的 T7 RNA
聚合酶基因 , 用作表达宿主菌。大肠杆菌 K91kan
作为噬菌体转导单位 ( Tu)测定的宿主菌。大肠杆
菌 RZ1032用于制备参 U单链模板 DNA。大肠杆
菌 TG1用作点突变反应混合物的转化受体菌和噬
菌体扩增的宿主菌。 Pinh噬菌体为展示有 TW-
PVVHGACRAHGHC的抑制肽噬菌体 , 为本组筛
选获得。野生型噬菌体 fd-tet由 Geo rge Smith教授
( Univ ersi ty of Missouri , Columbia)惠赠。
1. 1. 2　酶和化学试剂　　假单胞菌属乙酰辅酶 A
合 成 酶 ( Pseudomonas acyl Co A synthetase )、
LiCo A、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺购自 Sigma公司 ;
T4多核苷酸激酶和 T4 DNA聚合酶来自 New
Eng land Bio labs公司 ; T4 DN A连接酶和限制性内
切酶从 Boehringer M annheim公司购买 ; DN A测
序试剂盒来自 USB公司 ; AmplifyTM、 Hyperfilm
M P、 [α-32 P]dAT P和 [9, 10(n )-3 H]豆蔻酸 ( myristic
acid)由 Amersham公司提供。
1. 2　方法
1. 2. 1　带尿嘧啶的单链 DNA( U-ssDN A)制备　
　挑取大肠杆菌 RZ1032单菌落于 2 ml 2× YT /
四环素 ( Tc) ( 10 mg /L)培养基中 , 37℃振荡培养过
夜。以 1∶ 50的比例转接于 10 m l新鲜 2× YT /Tc
培养液中 , 37℃ 250 r /min, 培养约 3 h至 A600=
1。以 1∶ 10的比例再接种于 50 ml新鲜 2× YT /
Tc中 , 同时加入尿苷至终浓度为 0. 25 mg /L, 加入
Pinh噬菌体约 109个颗粒 , 37℃ 300 r /min, 培养 8
h。离心收集上清 , 加入 0. 15倍体积的聚乙二醇
( PEG) /NaCl溶液 ( 167 g /L PEG-8000, 3. 3 mol /L
NaCl ) , 冰浴 30 min。 12 000 r /min离心 15 min收
集噬菌体 , 并用 5 ml TE( pH 8. 0)悬浮。 12 000
r /min离心 10 min除去不溶物 , 上清用等体积酚抽
提一次 , 再用等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提一次 ,
最后用等体积氯仿∶异戊醇抽提。水相中加入 0. 1
倍体积的 3 mol /L NaAc( pH 5. 2)后用 2. 5倍体积
乙醇沉淀。 15 000 r /min离心 15 min, 沉淀用 70%
乙醇洗一次 , 15 000 r /min再离心 15 min。沉淀经
真空干燥后 , 溶于 200μl TE( pH 8. 0)中 , 在 260
nm对 DN A进行分光光度测定以确定含量。取约 1
μg DN A进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定所得单链
DNA的质量。
1. 2. 2　寡核苷酸介导的定点突变　　 ( 1)突变引
物 5′端磷酸化及与模板的退火反应　按分子克隆
手册进行。 ( 2) 突变引物延伸反应　基本按分子克
隆手册进行 , 但以 T4 DNA聚合酶代替 Klenow
酶。反应混合液于冰浴放置 5 min, 再置室温 5
min, 然后 37℃温浴 2 h进行延伸。 ( 3) DN A转化
　取 1 μl 延 伸 反 应 混 合 物 以 电 穿 孔
( elect roporation)方法转化 20μl大肠杆菌 TG1细
胞 , 加 1 ml LB培养液于 37℃恢复生长 1 h后 , 涂
于 LB / Tc ( 40 mg /L )平板 , 37℃培养过夜。 ( 4)
DN A序列分析　从上述转化平板中挑单菌落于
LB /Tc ( 20 mg /L )培养液中培养约 16 h, 一次
PEG /NaCl沉淀法纯化噬菌体后 , 根据文献 [4]用
煮沸法制备单链 DNA模板 , 按 U SB的 DNA测序
试剂盒操作手册进行。测序用引物为 GAATT
T TCT G T ATGA GGT。
1. 2. 3　噬菌体纯化和转导单位测定　　将带目标
突变的噬菌体在大肠杆菌 TG1中扩增后 , 按照文
献 [4 ]纯化噬菌体并测定其转导单位。
1. 2. 4　体外 NM T抑制剂活性分析　　按文献 [5]
用乙酰 Co A合成酶合成 3H标记的豆蔻酰 Co A后 ,
在 30μl反应体系中加 3μl 10× 反应缓冲液 ( 300
mmol /L Tris-HCl, 5 mmo l /L EGT A, 4. 5
mmol /L EDTA, 45 mmol /Lβ -巯基乙醇 , 10% Tri-
ton X-100, pH 7. 2) , 5μl 3H标记豆蔻酰 CoA, 约
0. 1μg NM T及约 1011突变噬菌体或野生型噬菌体
颗粒 , 混匀 ,室温放置 10 min。加入约 4μg mCα4H
启动反应 , 30℃保温 20 min。加等体积 2× 还原
型蛋白电泳上样缓冲液 , 煮沸 3 min。从中吸取 40
μl进行十二烷基硫酸钠 ( SDS) -聚丙烯酰胺凝胶电
泳 , 通过放射自显影确定噬菌体的抑制能力。
1. 2. 5　放射自显影分析　　将电泳胶在固定液
( 25%异丙醇 , 10%冰醋酸 )中固定 30 min, 再浸泡
在 AmplifyTM中 30 min, 真空加热干燥。在- 70℃
与 Hyperfilm MP感光片曝光。以野生型噬菌体为
对照 , 从条带强弱 (用黑度密度扫描仪确定 )判断抑
制程度。抑制活性表示为 ( 1 - 样品条带黑度 /对照
条带黑度 )× 100。
结 果 和 讨 论
2. 1　抑制肽序列的氨基酸置换突变
从噬菌体展示随机 15肽库中筛选到的一个强
抑制活性噬菌体 Pinh所展示的 15肽为 TWPVV H-
GACRAHGHC, 含 3个 His残基 , 2个 Cys残基和
1个 Pro残基。从多肽结构角度考虑 , 2个 Cys残
基可能形成一个二硫键 , 而 Pro则可能形成转角 ,
从而产生特殊的结构 , 对该肽的构象产生限制作
用。为确定这些氨基酸残基的作用 , 我们先对 P3、
H6、 C9、 H12、 H14和 C15进行突变研究。
　　按照有关结构分析的原则 , 设计将 P突变为
A, H突变为 N , C突变为 S。突变引物的设计见图
1。将磷酸化后的突变引物与 U-ssDN A模板退火
后 , 采用 T4 DNA聚合酶延伸引物。反应完成后 ,
转化大肠杆菌 TG1以剔除参有尿嘧啶的模板
DNA, 从而提高突变效率。从转化子培养物中分别
提取 RF DNA和 ssDN A, 其中 RF DNA用适当限
制性内切酶切割后进行琼脂糖凝胶电泳 , 以鉴定噬
菌体的基因组是否保持完整和框架是否正确。在此
基础上 , 取 ssDN A进行序列分析 , 从而获得目标
突变噬菌体。以野生型噬菌体为对照 , 利用体外
NM T抑制活性分析系统确定相应突变对抑制活性
的影响 , 结果见图 2, 表 1。
232 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷
Fig . 1　 Designs o f the mutagenic primer s
Th e amino acid s equence in the random region is u nderlined , and th e base( s ) u nderlined repres en t( s ) the mutan t posi tion.
Fig. 2　 In vitro NM T inhibition a ssay of muta ted phage
Mutated ph ages w ere sub jected to in vit ro inhibi tion as say as d es-
crib ed in Materials and Meth ods. Af ter running SDS-PAGE, th e g el
was performed au toradiograph y to id ent ify th eir effect on inhibi tion
of NM T act ivi ty. Th e num bers of th e samples are correspon-
　 　　　　 dent to th ose in Tab le 1.
　　实验结果表明 P3和 H6对抑制活性是重要的 ,
而 C9、 H12、 H14和 C15则基本不起作用 , 提示 N
端的肽段在功能上比 C端重要。需指出的是 , 由于
肽链在 Ala残基处也可能形成转角结构 , 因此 P3A
突变对抑制活性的影响程度相对较小 , 因此该处是
否形成转角还需进一步实验证明。
Table 1　 The inhibition activities o f mutated phages
No. Sample Inhibi ti on activity /% a Relative activity
1 fd-tet 0 0
2 P3A 78 86
3 H6N 52 57
4 C9S 84 92
5 H12N 88 97
6 H14N 92 101
7 C15S 93 102
8 Pinh 91 100
　　 a Inhibi tion activi ty (% ) = ( 1 - the sample band blackness /
th at of con t rol band) × 100.
　　在分析 NMT的抑制肽噬菌体所展示的抑制肽
序列时 , 我们认为存在一个特征性的 PX( 0～ 3) H/R
序列 , 且 X倾向于带较大侧链基团的氨基酸残基 ,
如有 PWW R, PVVR等结构模式存在。另外 , 结构
生物学认为转角两边的残基对其方向有影响 , 如果
本肽中的 Pro处形成转角 , 那么它左侧的 Trp也应
该对抑制活性有影响 , 因为肽的结构与活性是直接
相关的。为了验证以上分析 , 我们又设计突变引
物 , 将 Pinh抑制肽序列中的 W突变为 A, 将 PVV H
结构分别突变为 PWWH、 PVVR和 PAAH(图 1)。
突变噬菌体的抑制活性见图 3和表 2。
Table 2　 The inhibition activ ities of muta ted phages
No. Sample Inhibi tion activi ty /% a Relativ e activi ty
1 fd-tet 0 0
2 V 3V 4→W3W4 92 102
3 V3V4→ A3A4 80 89
4 H6R 60 67
5 W2A 30 33
6 Pinh 90 100
　　 a Inhibiti on activi ty (% ) = ( 1 - the sample band blackn ess /
that of cont rol band) × 100.
Fig. 3　 In v itro NM T inhibition assay o f mutated phage
M utated phages w ere subjected to in vitro inhibi ti on assay as des-
cribed in Materials and Methods. Af ter run ning SDS-PAGE, the gel
w as perfo rm ed autoradiog raphy to identify thei r ef fect on inhibi ti on
of NM T activi ty. The numbers of the samples are correspon-
　　　 　　　　 den t to thos e in Table 2.
233第 3期 许正平等:噬菌体展示的豆蔻酰转移酶抑制肽序列结构和功能研究
Fig. 4　 Designs of dele ted primers
---------, repres ents the deleted sequ ences.
　　图 3结果说明: ( 1) X残基确实倾向于带较大
侧链基团的氨基酸。如 PWW H也具强抑制活性 ,
而 PA AH则抑制活性有所降低。另外 , PVV R虽
然也满足 PX( 0～ 3) H/R的特征 , 但突变噬菌体的抑
制活性不高 , 说明这种搭配形成的肽结构不是非常
适合与 NM T作用。事实上 , 我们确实筛选到抑制
活性不是很高的 GLDLLGAVRK PVVRR抑制肽
序列。 ( 2) Pro残基处很可能形成一个转角。因为
W2A的突变抑制活性明显降低 , 而这可能是由于
转角方向的改变引起的。当然 , 这有待于构象方面
的实验进一步确证。
2. 2　抑制肽序列的部分缺失突变
上述结果提示抑制肽的 C端 ( C9～ C15)在抑制
肽与 NMT的结合作用中不重要。那么 , 它们对维
持抑制肽的构象有无贡献? 这需要以缺失突变来验
证。为此 , 我们设计了突变引物进行缺失突变 (图
4)。
　　缺失突变噬菌体的抑制分析结果见图 5及表
3。结果表明缺失并不影响噬菌体的抑制能力 , 有
力说明 C端 ( C9～ C15)不仅在与 NM T的结合中不
重要 , 而且在维持抑制肽的构象上也无明显贡献。
Fig. 5　 In v itro NM T inhibition a ssay of dele ted phage
Deleted ph ag es w ere subjected to in vit ro inhibi tion assay as d es-
crib ed in Materials and Meth ods. Af ter running SDS-PAGE, th e g el
was performed au toradiograph y to id ent ify th eir effect on inhibi tion
of NM T act ivi ty. Th e num bers of th e samples are correspon-
　　　 　　　　 dent to th ose in Table 3.
　　综上所述 , 通过寡核苷酸介导的定点突变 , 证
明 PX( 0～ 3) H/R确实为抑制肽序列的特征性结构 ,
同时 , 将 Pinh的抑制肽功能区域缩小到 N端 8个氨
基酸残基 , 为人工合成肽的研究打下了基础。我们
认为 , 在利用噬菌体展示随机多肽库研究生物分子
的配体工作中 , 本方法体系有广泛的应用价值。通
过这种 DNA水平上的快速而简便的研究 , 可以排
除非必需氨基酸 , 框定功能区域 , 为人工合成多肽
水平的研究奠定基础。
Table 3　 The inhibition activ ities of dele ted phages
No. Sample Inhibi tion activi ty /% a Relativ e activi ty
1 fd-tet 0 0
2 ΔC15 93 100
3 Δ H14C15 90 97
4 ΔC9— C15 89 96
5 Pinh 93 100
　　 a Inhibiti on activi ty(% ) = ( 1 - th e sample band blackn ess /
that of cont rol band) × 100.
参 考 文 献
1　 Fels ted R L, Glover C J, Hartman K. Pro tein N-myris toylation
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In: Glazer R I et al . ed s. Developments in Cancer Chemotherapy ,
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3　许正平 , 段治军 , 陈　虎 , 陈长征 , 李伯良 ( Xu Z P, Duan Z J,
Ch en H, Ch en C Z, Li B L): 豆蔻酰转移酶的噬菌体展示抑制
肽筛选研究。生物化学与生物物理学报 ( Acta B ioch imica et Bio-
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t ion sequence of p rotein kinas e w i th ferric chelation af finity ch ro-
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5　段治军 , 陈长征 ,李伯良 ( Duan Z J, Ch en C Z, Li B L): 酵母豆
蔻酰辅酶 A∶蛋白质 N端转酰基酶基因的克隆与表达。生物化
学与生物物理学报 ( Acta B ioch imica et B iop hysica Sinica ) ,
1996, 28: 115— 123
234 　　生 物 化 学 与 生 物 物 理 学 报 第 30卷
Studies on Structure and Function of the Myristoyltransferase
Inhibitor Peptide Displayed on Phage Surface
XU Zheng-Ping , CHEN Hu, DU AN Zhi-Jun and LI Bo-Liang
( Shanghai Insti tute of B ioch emistr y, the Ch inese Acad emy of Sciences , Shanghai 200031, China )
ABSTRACT　　 Si te-directed mutagenesis w as used to identify the critical residues and functional se-
quences o f a potent N MT inhibi to r peptide display ed on phage surface. W2A, H6N and H6R la rg ely low-
ered the inhibi to ry activi ties o f the mutated phages, and the activi ty of P3A and V4V 5→ A4A5 was also
slight ly reduced. However, V4V 5→W4W5, H12N, H14N, C9S, C15S, ΔC15, ΔH14C15 andΔC9— C15
had no obvious ef fect on the inhibi tion. These resul ts suggest that W2, P3 and H6 are impo rtant in the
peptide st ructure and /o r the interaction wi th NM T, that amino acids wi th larger side chain a re the mo re
fav o rable residues betw een P3 and H6, and also that the sequences betw een C9 and C15 have no clear con-
tribution to the inhibi to ry activity. In summary, the functional peptide directly related to the ro le o f inhibi-
tion has been loca ted betw een the N terminal T1 and A8 of the inhibitor peptide.
KEY WORDS　　 Myristoy lt ransferase; inhibitor phage; si te-directed mutagenesis; st ructure-function re-
lationship
Receiv ed: September 12, 1997　　 Accep ted: October 27, 1997
235第 3期 许正平等:噬菌体展示的豆蔻酰转移酶抑制肽序列结构和功能研究