全 文 ：30(5)703-712 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2014年 10月

基金项目：国家“863”计划（2011AA10A203）；国家“973”计划（2012CB722301）；国家自然科学基金（31070006）；湖南省 2011协同创
新中心项目（20134486）；湖南省教育厅项目（10CY013）
作者简介：杨燕，女，硕士研究生，E-mail：461375018@qq.com；*通信作者，教授，博士生导师，E-mail：xialq@hunnu.edu.cn。


聚磷酸激酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及
多杀菌素合成的影响
杨 燕，罗林根，唐斯佳，徐 妙，丁学知，胡胜标，孙运军，夏立秋*
（湖南师范大学生命科学学院/微生物分子生物学国家重点实验室培育基地，长沙 410081）
摘要:聚磷酸激酶基因（Polyphosphate kinase gene，ppk）是放线霉菌中的一种影响抗生素合成的全局
性负调控因子，阻断该基因能显著提高其次级代谢产物产量。本文利用 PCR 扩增了刺糖多孢菌中的
ppk基因中间片段，经酶切连接技术将其克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体 pOJ260上，构建阻断型载
体 pOJ260-ppk；通过接合转移将该功能质粒导入刺糖多孢菌中，获得了遗传性能稳定的重组菌株 S.
sp-△ppk。对工程菌株的 PCR检测结果显示，ppk基因片段已整合到刺糖多孢菌染色体上并成功阻断
了该基因的表达。摇瓶发酵结果显示，工程菌株多杀菌素产量较原始菌株提高了 122%。阻断聚磷酸
激酶基因的表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长发育产生了影响，并有效地促进该菌多杀菌素的生
物合成。
关 键 词：刺糖多孢菌；聚磷酸激酶基因；阻断；多杀菌素；接合转移
中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2014)05-0703-010
Disruption of Polyphosphate Kinase Gene Affects Phenotypes and
Spinosyns Production of Saccharopolyspora spinosa
YANG Yan, LUO Lingen, TANG Sijia, XU Miao, DING Xuezhi, HU Shengbiao, SUN Yunjun, XIA Liqiu*
(Hunan Provincial Key Laboratory of Microbial Molecular Biology-State Key Laboratory Breeding Base of Microbial Molecular
Biology/College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)
Abstract：Previous report revealed that polyphosphate kinase of Streptomyces played a negative role in antibiotic
production. Here, we investigated whether polyphosphate kinase of Saccharopolyspora spinosa also negatively
regulates the production of spinosad. Polyphosphate kinase encoding gene (ppk) was disrupted by homologous
recombination. Primer pair used for amplification of ppk gene from Saccharopolyspora spinosa was designed
according to the homologous ppk gene of S. spinosa. PCR product of partial sequence of ppk gene in S. spinosa
was cloned into Escherichia coli-Streptomyces shuttle vector pOJ260 to generate pOJ260-ppk, which was
transformed into S. spinosa by conjugation. Apramycin resistant colonies were picked up and identified by PCR.
Positive transconjugants of which ppk gene was successfully disrupted were chosen for further study. Mycelia in
S. sp-Δppk displayed a much higher degree of fragment and fewer branches when compared with parental strain.
The growth rate of S. sp-Δppk was delayed and its biomass was reduced. Shake flask fermentation demonstrated
that spinosad yield increased by 122% in S. sp-Δppk strain compared to that of parental strain. S. sp-Δppk
exhibited highly genetic stability. Thus, we concluded that the product of ppk gene could negatively regulate the
biosynthesis of spinosad and disruption of ppk gene could affect the mycelial morphology and growth of S.
spinosa.
Key words: Saccharopolyspora spinosa; polyphosphate kinase gene; disruption; spinosyns; conjugational transfer

DOI:10.16409/j.cnki.2095-039x.2014.05.021
704 中 国 生 物 防 治 学 报 第 30卷
多杀菌素具有新颖独特的作用机理，能有效控制鳞翅目 Lepidoptera、双翅目 Diptera 和缨翅目
Thysanoptera等害虫，同时对鞘翅目 Coleoptera、直翅目 Orthoptera、膜翅目 Hymenoptera等某些特定种类
的害虫也有一定的毒杀作用[1]。多杀菌素主要靶标是烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）和 γ-氨基丁酸受体
（GABARs），但其烟碱受体作用机理不同于现有烟碱类杀虫剂诸如吡虫啉等，与 γ-氨基丁酸受体的作用
机理亦不同于现有的阿维菌素类、氟虫腈类杀虫剂[2]。它主要通过激活相关害虫中央神经系统的神经细胞
而引起非功能性的肌肉收缩和震颤，使中央神经系统广泛超活化以致死亡。多杀菌素独特的杀虫机理表现
出生物农药的安全性和化学农药的快速性。野生型刺糖多孢菌的多杀菌素生物合成含量较低、发酵周期很
长、生产成本较高是限制多杀菌素在作物生产应用上的主要原因。
在放线菌中，多种抗生素均在磷饥饿的条件下产生，且受到外源无机磷离子的抑制[3]。聚磷酸激酶基
因（ppk）是单顺反子 mRNA，其表达仅在菌体生长后期，由该基因编码表达的蛋白聚磷酸激酶（ppk）可
催化多聚磷酸合成 ATP及其逆反应。此外，天蓝色链霉菌 ppk基因缺失突变株在 R2YE培养基中抗生素产
量提高，actⅡ-ORF4、RedD、CdaR转录水平提高，且与 ppGpp无关[4]。研究证明，在抗生素合成过程中
ppk 基因作为负调控子起作用，这一功能可能与来源于 ppk 催化多聚磷酸水解产生的无机磷离子（Pi）对
抗生素合成途径中的特定激活子的抑制作用有关[5]。本研究首次从刺糖多孢菌基因组中扩增了 ppk 基因中
间同源序列，亚克隆到大肠杆菌−链霉菌穿梭载体 pOJ260[6]中，再通过单交换同源重组将其整合到刺糖多
孢菌的染色体上，以期通过阻断负调控基因的表达，影响刺糖多孢菌中次级代谢产物的产生，从而促进多
杀菌素的生物合成。
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
本研究所用菌株、质粒与引物见表 1。
表 1 菌株、质粒和引物
Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study
相关特征 Relative description 来源 Source
菌株 Strains
E. coli GB2005 克隆宿主 本实验室
E. coli S17 接合转移供体菌, 对链霉素和三甲氧苄氨嘧啶具有抗性 本实验室
S. spinosa 本室筛选的刺糖多孢菌 本实验室
S. sp–ᇞppk ppk基因被阻断的刺糖多孢菌工程菌株 本研究
质粒 Plasmids
pMD-18T 含氨苄青霉素抗性基因 AmpR，克隆载体 TaKaRa公司
pMD-ppk 含氨苄青霉素抗性基因 AmpR，ppk基因同源片段 本研究
pOJ260 含 reppUC18，oriT，阿伯拉霉素抗性基因 ApraR 本实验室
pOJ260-ppk 含 reppUC18，oriT，ppk基因同源片段， 阿伯拉霉素抗性基因 ApraR 本研究
引物 Primers
Ppk-F 5′-CCAAGCTTGG TTCGATCCGCCGGTCCAGGT-3′ 本研究
Ppk-R 5′-CGGAATTCCG CGGCTGCCACCACCGACCTG-3′
ppk-F/ ppk-R用于扩增 ppk基因同源片段(下画线部分为酶切位点)
本研究
M-F 5′-AGGTCGTCGAGGAAGACCCG-3′ 本研究
M-R 5′-GTGAGCTGATACCGCTCGCC-3′ 本研究
N-F 5′-CCCGATTCCGGAAGTGCTTG-3′ 本研究
N-R 5′-GTGGAGGGGCTGAGCGAGAA-3′
M-F/M-R和 N-F/N-R用于检测 pOJ260-ppk插入位点
本研究
Apra-F 5′-GTCCAATACGAATGGCGAAAAGC-3′ 本研究
Apra-R

5′-ATAACATTCTTCGCATCCCGCC-3′
Apr-F/Apr-R用于扩增阿伯拉霉素抗性基因片段
本研究
第 5期 杨燕等：聚磷酸激酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及多杀菌素合成的影响 705

1.2 培养基成分与菌体培养条件
大肠杆菌培养采用 LB液体或固体培养基（含 Tryptone 1%，Yeast extract 0.5%，NaCl 1%，固体培
养基则加入 1.5%琼脂粉），培养温度为 37 ℃；刺糖多孢菌种子活化培养基采用 CSM培养基（含 TSB
3%，Yeast extract 0.3%，MgSO4·7H2O 0.2%，Glucose 0.5%，Maltose 0.4%），转接采用胰蛋白酶大豆
肉汤培养基（含 TSB 3%）[7]，刺糖多孢菌形态观察采用 BHI（BHI 3.7%，琼脂粉 1.3%）、R6（含蔗
糖 20%，Dextrin 1%，Casamino acids 0.1%，K2SO4 0.01%，FeSO4·7H2O 0.01%，MnCl2·4H2O 0.01‰，
MgSO4·7H2O 0.05‰，ZnSO4·7H2O 0.01‰，BHI 2.6%，MOPS 0.01 mol/L，CaCl2 0.048 mol/L，L-谷氨
酸 0.065 mol/L，琼脂粉 2%）和 spn-2（含 Glucose 0.04%，Maltose 1%，Yeast extract 0.4%，琼脂粉
2%）固体培养基，培养温度为 30 ℃。
1.3 工具酶、试剂、抗生素及使用浓度
LA Taq DNA 聚合酶、Primer Star DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购自大连宝生物工
程有限公司。细菌基因组 DNA 提取试剂盒、DNA 片段和 PCR 产物回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购
自北京 Bioteke公司。PCR引物合成及测序由生工公司完成。抗生素均购自 Sigma公司，工作浓度分别为：
阿伯拉霉素（Apramycin，Apra），用于大肠杆菌的筛选浓度为 20 mg/L，用于刺糖多孢菌的筛选浓度为
50 mg/L；氨苄青霉（ampicillin，Amp）用于固体培养基的浓度为 50 mg/L，用于液体培养基的浓度为 100 mg/L；
萘啶酮酸（nalidixic acid，NA）25 mg/L；链霉素（streptomycin，Str）100 mg/L；三甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim，
TMP）100 mg/L。
1.4 ppk同源基因的确定和重组质粒 pOJ260-ppk的构建
以天蓝色链霉菌中 ppk 基因核苷酸序列为标准，利用 Blast 在线搜索刺糖多孢菌中该基因同源片段，
而后利用 Clustal X比对 2个基因编码蛋白 ppk的相似性[8]。
1.4.1 ppk 基因片段的扩增及回收测序 利用细菌基因组 DNA 提取试剂盒按使用说明书操作提取刺
糖多孢菌基因组，以该基因组为模板，通过 Primer Star DNA聚合酶扩增约 1900 bp的 ppk基因片段。
反应体系 20 μL：DNA模板 1 μL，Primer Star DNA酶 0.1 μL，2×GC buffer 10 μL，dNTP（10 mmol/L
each）2 μL，上、下游引物（10 μmol/L，表 1）各 0.5 μL，最后加灭菌 ddH2O补足；PCR反应程序如
下：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，63 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，30个循环；72 ℃延伸
10 min，20 ℃终止 PCR反应。该 PCR产物经 DNA片段和 PCR产物回收试剂盒按使用说明书操作回
收纯化 ppk基因片段后，与 pMD-18T载体连接；热转大肠杆菌感受态细胞[9]，用 LB固体培养基过夜
培养后，挑取单克隆在 LB 液体培养中扩大培养后利用质粒小量提取试剂盒按使用说明书操作抽提质
粒；所得质粒经 HindⅢ和 EcoRⅠ酶切鉴定后送上海生工测序，测序结果经 NCBI Blast network进行
比对分析。
1.4.2 质粒 pOJ260-ppk的构建 测序正确后的 pMD-ppk质粒经 HindⅢ和 EcoRⅠ酶切后回收 ppk基因片
段，而后用 T4 DNA 连接酶将该回收片段与经过同样双酶切的 pOJ260 载体片段过夜连接[9]，得到功能载
体 pOJ260-ppk（图 1）。
1.5 工程菌株 S. sp-△ppk的构建及 pOJ260-ppk插入位点的鉴定
将重组质粒 pOJ260-ppk电转[9]入供体菌 E. coli S17，经阿伯拉霉素、链霉素、三甲氧苄氨嘧啶三抗筛
选阳性转化子，利用质粒小量提取试剂盒提取质粒并用 HindⅢ和 ClaⅠ进行酶切鉴定，获得转化子
S17/pOJ260-ppk。通过接合转移[10,11]将重组质粒导入野生型刺糖多孢菌中，筛选具有阿伯拉霉素抗性的菌
落，并用引物对 Apra-F/Apra-R（表 1）进行菌落 PCR 扩增 Apra 抗性基因片段以鉴定正确转化子，利用
LA Taq DNA 聚合酶 20 μL 体系（同上）扩增 Apra抗性基因程序如下：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性
30 s，61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30个循环；72 ℃延伸 10 min，20 ℃终止 PCR反应。将基因组
上整合了 pOJ260-ppk的工程菌株命名为 S. sp-△ppk。随后用细菌基因组 DNA提取试剂盒按使用说明书操
作提取工程菌株基因组，用引物M-F/M-R及 N-F/N-R（表 1）扩增插入片段和刺糖多孢菌基因组上下游
片段鉴定插入位点。PCR反应程序如下：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，63 ℃退火 30 s，72 ℃延
伸 45 s，30个循环；72 ℃延伸 10 min，20 ℃终止 PCR反应。
706 中 国 生 物 防 治 学 报 第 30卷
Hind Ⅲ
ppk PCR
1.9 kb
EcoRⅠ
RP4 ori
Hind Ⅲ
EcoRⅠ
Hind Ⅲ/EcoRⅠ酶切连接 Digestion
ppk PCR
连接 Ligation
RP4 ori
AmR
Ac
c(
3)
Ⅳ
pOJ260-ppk
5.4 kb
pOJ260
3.5 kb
A
cc
(3
)Ⅳ
AmR

图 1 功能质粒 pOJ260-ppk的构建流程图
Fig. 1 Construction of pOJ260-ppk
1.6 ppk基因阻断表达对刺糖多孢菌生长及菌株形态的影响
菌体活化：将 200 μL菌种保藏液接种于装量为 20 mL CSM液体培养基的 250 mL摇瓶中，30 ℃、160 r/min
培养 2 d。刺糖多孢菌液体培养基中生长曲线的测定采用光密度法：按 1%接种量接种活化好的菌种于装量
为 20 mL TSB液体培养基的 250 mL摇瓶中，30 ℃、160 r/min培养 5 d，分别定期取样测定光密度值 OD600，
试验重复 3 次，取平均值制作生长曲线。将活化后的 40 μL 原始菌和工程菌菌液分别涂布于 BHI、R6 和
spn-2固体培养基上[12]，30 ℃倒置培养 72 h，观察不同平板上菌落生长情况。接种等量的活化后的原始菌
与工程菌菌液至 20 mL TSB培养基，165 r/min振荡培养 2 d，利用光学显微镜（Olympus BH-2型显微镜，
日本 Olympus公司）观察其菌体形态[11]。
1.7 工程菌株 S. sp-△ppk多杀菌素产量变化检测分析
分别取相同发酵条件下工程菌株 S. sp-△ppk和原始菌株 S. spinosa的发酵液 500 μL，与等体积的丙酮
混匀，室温振荡 1～2 h，避光，9000 r/min离心 10 min，吸取上清，经 0.22 μm滤膜过滤，滤液经安捷伦
1290液相色谱仪检测分析多杀菌素含量，色谱柱为 SB-C18，4.6×150 mmol/L，5-Micron，流动相：甲醇
/乙腈/2%醋酸铵（v/v/v）=45/45/10，流速 0.5 mL/min，紫外检测波长 250 nm，进样体积 5 μL，通过 HPLC
外标法计算发酵液中多杀菌素的含量。
1.8 ppk基因阻断表达对刺糖多孢菌菌体全蛋白的影响
刺糖多孢菌菌体全蛋白的提取采用超生破碎细胞法：按 1%接种量接种活化好的菌种于装量为 20 mL
TSB液体培养基（含 TSB 3%）的 250 mL摇瓶中，30 ℃、160 r/min培养 3 d，分别取不同时期菌体进行
超生破碎（JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技公司），提取菌体全蛋白。得到的菌体全蛋
白利用 Bradford法定量后进行 SDS-PAGE检测其蛋白表达差异[13]。
1.9 重组菌株 S. sp-△ppk遗传稳定性检测
将 S. sp-△ppk 菌株的菌种保藏液用不加抗生素的 CSM液体培养基活化 48 h，梯度稀释后涂布于无抗
生素的 BHI平板，30 ℃培养 5 d；挑取 50个单菌落转接于含 Apra（50 mg/L）的 BHI平板上，30 ℃培养
3～4 d，计数抗性克隆数；并从中随机挑取 20个单菌落，于无抗的 CSM活化 48 h后做菌液 PCR扩增检
测 Apra抗性基因片段。
第 5期 杨燕等：聚磷酸激酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及多杀菌素合成的影响 707

2 结果与分析
2.1 ppk同源基因的确定
以天蓝色链霉菌中 ppk基因（sco4145）核苷酸序列为标准，利用 Blast在线搜索刺糖多孢菌中该基因
同源片段，而后利用 Clustal X比对 2个基因编码蛋白 ppk的相似性（图 2），通过比对可知，两者核苷酸
相似性达 76%，蛋白同源性达 61%。
199
195
259
255
313
315
373
375
433
433
493
493
553
553
613
613
673
673
733
731
782
774

图 2 ppk基因编码蛋白同源性比对
Fig. 2 Homology analysis of amino acid residue sequence coded by ppk gene
2.2 质粒 pOJ260-ppk的构建及鉴定
以刺糖多孢菌基因组为模板，利用引物 ppk-F 和 ppk-R，PCR 扩增 ppk 基因中间片段。PCR 产物经
Hind III/ EcoRⅠ双酶切及 DNA回收试剂盒回收此片段后，与同样经过双酶切及 DNA回收试剂盒回收的
pOJ260 载体片段连接，转化大肠杆菌，抽提转化子质粒，酶切鉴定，得到质粒 pOJ260-ppk（图 3）。该
载体带有大肠杆菌 pUC复制子，接合转移起始位点（oriT），阿伯拉霉素抗性基因（ApraR，可以作为 E. coli
和 S. spinosa的筛选标记）。
2.3 接合转移构建工程菌株 S. sp-△ppk及功能质粒插入位点鉴定
将 R6平板上长出的接合子转接至含阿伯拉霉素（50 mg/L）的 BHI平板上，转接两次，再挑取单菌落
至 TSB 液体培养基，提取基因组为模板进行 PCR 鉴定。以工程菌株 S. sp-△ppk 基因组为模板，分别以
Apra-F/Apra-R 引物对 PCR 扩增 773 bp Apra抗性基因片段，结果表明（图 4B）ppk基因中间片段已成功
的整合至刺糖多孢菌染色体上。另外，以工程菌株 S. sp-△ppk 基因组为模板，用 M-F/M-R 和 N-F/N-R
分别扩增上游片段M（620 bp）、下游片段 N（400 bp），结果表明（图 4C）阻断质粒插入到刺糖多孢菌
染色体上的位置与预想一致。
708 中 国 生 物 防 治 学 报 第 30卷

A：ppk基因中间片段的 PCR扩增 PCR amplification of partial ppk gene (M: DNA Marker; 1: The partial length of ppk gene)；
B：pOJ260-ppk酶切检测 Endonuclease digestion assay of pOJ260-ppk (M: DNA Marker; 1: Digestion of Hind Ⅲ; 2: Digestion of Hind Ⅲ and ClaⅠ)
图 3 质粒 pOJ260-ppk的构建
Fig. 3 Constraction of pOJ260-ppk
M 1
2000
bp
750
B 2 3 4 M 1
2000
bp
750
C 2
Acc(3)Ⅳ AmRppk PCRRP4 oripOJ260-ppk
ppk PCRA B
野生菌株染色 Wild strain chromosome
重组菌株染色 Mutant strain chromosome
ppk PCRA Bppk PCRRP4 oriAmRAcc(3)Ⅳ
M N
A

A：重组示意图 Diagram of the single-crosscover homologous recombination；
B：引物对 Apra-F/Apra-R扩增 Apra基因片段 PCR amplification of partial Apra gene (M: DNA Marker; 1: Negative control, using the chromosome of S.
spinosa as template; 2: Positive control, using pOJ260-ppk as template; 3, 4: Experimental group, using the chromosome of S. sp-△ppk as template)；
C：重组质粒 pOJ260-ppk的整合位点 PCR鉴定 PCR confirmation of integration site (M: DNA Marker; 1: Downstream segment N; 2: Upstream segment M)
图 4 S. sp-△ppk的 PCR鉴定
Fig. 4 Identification of S. sp-△ppk
2.4 ppk基因的阻断表达对刺糖多孢菌生长与多杀菌素生物合成的影响
观察了工程菌株 S. sp-△ppk及原始菌株 S. spinosa在不同培养基中的生长发育变化与形态差异。在BHI
培养基、spn-2培养基和 R6培养基上培养 72 h后，原始菌株已产生较多白色孢子，而工程菌株只产生很
少量的孢子，其孢子萌发及形成速率较原始菌株均明显延迟（图 5）。TSB液体培养基中培养 48 h后，采
用光学显微镜观察两菌株的菌体形态，结果显示原始菌株菌丝粗长且分枝多，而工程菌株菌丝较细短而分
枝少，且原始菌结团较工程菌严重（图 6）。
在 TSB液体培养基中原始菌株 S. spinosa培养 24 h后进入对数生长期，48～60 h间又有一个继续增长
期，生长过程中无明显稳定期存在。工程菌 S. sp-△ppk也是生长 24 h进入对数生长期，72 h进入稳定期，
但工程菌细胞密度一直低于原始菌株（图 7）。
HPLC 检测结果显示，与原始菌株相比，发酵培养基中工程菌株多杀菌素 A＋D 的产量提高了 122%
（图 8），说明 ppk基因的阻断在一定程度上促进了刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成。
第 5期 杨燕等：聚磷酸激酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及多杀菌素合成的影响 709

BHI Spn-2 R6
S. sp- ppk
S. spinosa

图 5 不同培养基上工程菌株 S. sp-△ppk与原始菌株 S. spinosa的培养 72 h菌落形态比较
Fig. 5 Phenotypes of S. sp-△ppk and S. spinosa (72 h) in different media

图 6 光学显微镜观察工程菌株 S. sp-△ppk与原始菌株 S. spinosa培养 48 h的菌丝形态
Fig. 6 Mycelium observation of S. sp-△ppk and S. spinosa (48 h)
O
D
60
0

图 7 工程菌株 S. sp-△ppk与原始菌株 S. spinosa的生长曲线比较
Fig. 7 Growth curve of S. sp-△ppk and S. spinosa
2.5 重组菌株菌体全蛋白分析
通过 SDS-PAGE分析工程菌株与原始菌株菌体全蛋白，发现工程菌株全蛋白条带减少在 66.4～97.2 kDa
区域，推测该区域应该包含 ppk基因编码蛋白（86.4 kDa）；另外，工程菌株中某些蛋白表达较原始菌株
弱但也出现了新蛋白条带 A、B（图 9）。
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100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 8.0 8.5 9.0 9.57.5
保留时间 Retention time (min)
吸
光
值
(m
A
U
)
吸
光
值
(m
A
U
)
5.
46
8
6.
41
6
6.
68
6
6.
79
9
8.
77
6
9.
18
5
9.
36
3
5.
47
4
6.
42
4 6.
69
5
6.
80
7
8.
78
6
9.
19
7
9.
37
4
sp
in
os
ad
A
sp
in
os
ad
D
sp
in
os
ad
A
sp
in
os
ad
D
A
B

A：原始菌发酵上清 HPLC分析 HPLC analysis of S. spinosa fermentation broth；
B：工程菌发酵上清 HPLC分析 HPLC analysis of S. sp-△ppk fermentation broth
图 8 HPLC检测工程菌株 S. sp-△ppk与原始菌株 S. spinosa的多杀菌素产量
Fig. 8 HPLC analysis of spinosyn production by S. sp-△ppk and S. spinosa
200
97.2
66.4
44.3
20.1
14.3
kDa
A
B
M 1 2 3 4

M: Protein marker; 1, 3: Samples from 60 and 72 h S. spinosa cells, respectively; 2, 4: Samples from 60 and 72 h S. sp-△ppk cells, respectively
图 9 工程菌株与原始菌株全蛋白 SDS-PAGE检测
Fig. 9 SDS-PAGE gel analysis of total proteins
2.6 重组菌株的遗传稳定性分析
在无抗性选择压力下，将 S. sp-△ppk连续多次传代培养后，98%以上的单克隆仍能保持阿伯拉霉素抗
性，而且 PCR扩增 Apra抗性基因片段的结果为阳性，这说明在传代的过程中整合的 ppk基因片段没有丢
失，突变菌株遗传稳定性良好。
3 讨论
刺糖多孢菌多杀菌素含量极低促使人们对其进行菌种改良和发酵工艺优化以提高其产量。已有对刺糖
多孢菌利用传统的理化诱变结合高通量筛选[14]，原生质体融合及再生[15]，多杀菌素生物合成相关基因加倍
等方法对其进行菌种改良的研究报道。近年来，利用基因工程技术加倍与过量表达放线菌中与次级代谢相
第 5期 杨燕等：聚磷酸激酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及多杀菌素合成的影响 711

关的正调控功能基因，成为了提高相关抗生素产量的有效途径，但对于阻断刺糖多孢菌负调控因子的表达
以提高多杀菌素产量的相关报道少见。
已有研究报道，在放线菌中抗生素均在磷饥饿的条件下产生，且受到外源无机磷离子的抑制；ppk可催
化多聚磷酸盐生成 ATP及其逆反应。研究表明在抗生素合成过程中，ppk作为负调控基因起作用，可能与来
源于 ppk催化多聚磷酸盐产生的打无机磷离子对抗生素从现在合成中特殊激活子的抑制作用有关[3]。本研究
将刺糖多孢菌中 ppk基因中间片段整合至刺糖多孢菌染色体上以阻断其表达，构建成工程菌株 S. sp-△ppk。
其生物量和产孢子能力明显低于原始菌株 S. spinosa，而且其多杀菌素的产量较原始菌株也显著提高。ppk
是一个全局性负调控因子，控制着链霉菌中 polyP、ATP 和 Pi 的水平[5,6]，从而调节 rpsO、recA、CRP、
KatE 等调控因子的表达水平[16]，其在放线菌中初级代谢与次级代谢的调控作用主要体现在两个方面，一
是影响磷酸盐的水平。细胞内磷的稳态是通过 PhoP和 AfsR共同作用达到的[17]，AfsR调控因子对抗生素产
量的影响是通过激活 afsS获得；受 PhoP和 AfsR共同影响的 24个基因都受菌体中 polyP的影响[18]；二是
影响菌体内 ATP水平。ATP与其衍生物 SAM、cAMP类似，在放线菌中作为调控分子起作用，抗生素的
合成与胞内 ATP 的浓度相关，低浓度的胞内 ATP 可促进抗生素的合成；三是 ppk 基因与 PhoP 调控子间
存在相互作用，ppk能促进 PhoP发挥作用，而阻断 ppk基因在一定程度上减弱了 PhoP的调控作用。在放
线菌中PhoR–PhoP双调控系统与其次级代谢和初级代谢密切相关，而该双调控系统的启动需要磷酸化PhoP
介导[19]。当磷酸化 PhoP含量减少时，处于该系统正调控下的基因如 pstS、phoD、pitH2等的表达受到抑制；
而被该调控系统抑制的基因如 glnA等的表达则会增强[19]，这与研究中通过 SDS-PAGE检测菌体全蛋白发
现蛋白条带明显减少且出现新条带 A、B的现象相符。
值得注意的是，从该文结果中发现多杀菌素工程菌株在整个生长周期中的细胞密度均低于原始菌株。
这可能是因为 ppk被阻断后菌株供能遭到阻遏，而菌体生长和繁殖需要充足的能量供给。在 BHI和 spn-2
培养基上，与原始菌株相比，其工程菌株孢子萌发及孢子形成延迟，但最终仍然能够正常产生孢子，这可
能也与功能菌株功能不足有关；在营养丰富的 R6 培养基上，两者生长速率及菌落形态无明显差异，推测
与培养基组分不同有关。另外，经光学显微镜观察工程菌株菌丝较细短，有利于菌株发酵时的溶氧，可能
对多杀菌素的生物合成起促进作用。
通过序列比对分析发现，刺糖多孢菌基因组上没有 phiC31 attB[20]位点的同源序列，因此利用位点特异
性重组方法对刺糖多孢菌进行基因改造存在困难。目前主要采用同源重组的方法对其进行遗传修饰，但此
方法同源臂长度至少需达到 1 kb以上，否则很难得到重组子，本研究构建的载体 pOJ260-ppk含有 1900 bp
的 ppk基因片段，保证了足够长的同源臂进行同源重组，有效的提高了接合转移及同源重组效率。这为阻
断其他相关负调控基因在刺糖多孢菌的表达来提高多杀菌素的合成提供了研究基础。
参 考 文 献
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