全 文 ：植物遗传资源学报 2015，16(4):823-827
Journal of Plant Genetic Ｒesources DOI:10． 13430 / j． cnki． jpgr． 2015． 04． 020
赖草(Leymus secalinus(Georgi)Tzvel．)
中一个染色体标记的克隆与鉴定
李 媛1，2，喻 凤1，2，赵闫闫1，2，窦全文1
(1中国科学院西北高原生物研究所 /高原生物适应与进化重点实验室，西宁 810001;2中国科学院大学，北京 100049)
摘要:通过构建 Cot-1 DNA文库以及利用荧光原位杂交技术，从赖草(Leymus secalinus(Georgi)Tzvel．)中克隆获得一个在
染色体多个部位具有点状杂交信号的重复序列。进一步对该序列在赖草基因组进行克隆和分析表明该序列为一个具有 90 bp
的重复单元(pLs-90)，并在基因组中呈串联状排列。利用 pLs-90 对赖草进行分子核型分析，结果表明:pLs-90 在染色体的着
丝粒、近着丝粒、臂间以及近端粒区均有分布，而且在每对染色体上信号分布模式不尽相同，结合染色体臂比可以清楚地对赖
草的 14 对(28 条)染色体进行识别。pLs-90 不仅可作为赖草种质鉴定和利用中染色体识别的理想标记，也可作为研究小麦族
不同物种染色体组进化的有力工具。
关键词:赖草;Cot-1 DNA;荧光原位杂交;重复序列;染色体标记
收稿日期:2014-08-11 修回日期:2014-12-01 网络出版日期:2015-06-11
UＲL:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 4996． S． 20150611． 0955． 015． html
基金项目:青海省科技厅科技促进新农村建设计划项目(2013-N-515);中科院“西部之光”联合学者人才培养计划项目
第一作者主要从事赖草属植物重复序列的研究及小麦族植物的远缘杂交育种的研究。E-mail:liyuan0601@ 126． com
通信作者:窦全文，主要从事植物遗传与育种研究。E-mail:douqw@ nwipb． cas． cn
Isolation and Characterization of a Chromosome
Maker in Leymus secalinus (Georgi)Tzvel．
LI Yuan1，2，YU Feng1，2，ZHAO Yan-yan1，2，DOU Quan-wen1
(1Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota /Northwest Plateau Institute of Biology，
Chinese Academy of Sciences，Xining 810008;2University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049)
Abstract:A repeat sequence producing multiple hybridization signals on chromosomes was obtained by con-
structing a Cot-1 DNA library and screening with a technique of fluorescence in situ hybridization(FISH)in Leymus
secalinus(Georgi)Tzvel． ． Further cloning and sequence analysis revealed that the sequence was tandem arranged in
the genome with a repeated motif of 90 bp． The repetitive sequence was named as pLs-90． Karyotyping with pLs-90
revealed that each chromosome of L． secalinus could be well identified by the different FISH patterns with multiple
hybridizations on centromeric，subcentromeric，interstitial，or subtelomericregions． pLs-90 not only could be an ide-
al chromosome maker for Leymus germplasm identification and utilization but also a powerful tool for studying the
genome evolution of different species in Triticeae．
Key words:Leymus secalinus;Cot-1 DNA;FISH(fluorescence in situ hybridization);repeat sequence;chromo-
some marker
赖草属(Leymus Hochst．)是禾本科(Poaceae)小
麦族(Triticeae)的一个重要多年生属;全世界的赖
草属约有 53 个种，主要分布于欧亚大陆和北美地
区;赖草属植物的生存环境非常广泛，并且具有极强
的耐寒、耐旱、抗虫、抗病等适应性［1-3］。赖草属植
物多数种类为草原优良牧草，如羊草(L． chinensis
(Trin．)Tzve1．) ，作为畜牧业上的优良牧草，在我国
内蒙古和黑龙江作为奶牛场重要的粗饲料资源;赖
草属植物的一些物种根系较发达，可作为保土固沙
的备选植物［4］;同时赖草属物种为小麦近缘种，是
植 物 遗 传 资 源 学 报 16 卷
进行麦类改良的重要基因资源，如迄今研究者通过
染色体工程手段，已经成功将大赖草(L． racemousus
(Lam．)Tzve1．)、滨麦(L． mollis (Trin．)Hara)等赖
草属物种的优良性状导入到小麦中［5-6］。
对赖草属物种基因组组成及进化的深刻认识，对
于有效发掘和利用赖草属物种基因资源具有重要意
义。赖草属基因组的组成为 NsXm，为异源多倍体，细
胞遗传学研究资料表明其染色体倍性从四倍体(2n =
4x =28)到十二倍体(2n =12x =84)变化不等，但以四
倍体居多［3，7］。已有大量细胞学和分子生物学数据表
明 Ns基因组来源于新麦草属(Psathyrostachys Nevs-
ki) ，但 Xm基因组的来源依旧不清楚［8-9］。
染色体标记是进行染色体识别的重要工具，在
麦类与近缘物种杂交后代中，染色体的识别和跟踪
是进行染色体工程育种的重要步骤。比较染色体标
记在不同基因组间的分布，可以推断物种基因组来
源以及不同物种间基因组分化关系［10］。植物染色
体标记通常由一些重复序列组成，而由串联重复序
列组成、荧光原位杂交呈点状信号的染色体标记在
染色体识别中具有较高价值。多个染色体标记已经
在赖草属物种中得到克隆和鉴定，但是多数标记在
染色体上杂交信号呈散布分布［11］，以及杂交信号集
中分布在端部和近端部区［12］，在对单个染色体识别
中利用价值不高。
植物 Cot-1 DNA富集了基因组中度和高度重复
序列［13-14］，利用染色体荧光原位杂交技术(FISH，
fluorescence in situ hybridization)对 Cot-1 DNA 文库
进行筛选和鉴定，被证明是一种开发染色体标记快
速有效的手段［15-16］。
本研究以赖草(L． secalinus (Georgi)Tzvel．)为材
料，建立 Cot-1 DNA文库，通过 FISH技术从中筛选出
了一个杂交信号在不同染色体间具有较高多态性的染
色体标记 pLs-90。该染色体标记可以作为赖草遗传资
源鉴定和利用以及赖草属基因组研究的有效工具。
1 材料与方法
1. 1 材料
赖草(L． secalinus (Georgi)Tzvel．) (2n = 4x =
28，NsNsXmXm)种子采集于青海西宁。
1. 2 方法
1. 2. 1 Cot-1 DNA 的制备 Cot-1 DNA 的制备主
要按照 M． S． Zwick 等［1 4］的方法。先根据 G． C． Al-
len等［1 7］的 CTAB 法提取赖草的基因组 DNA。用
5 mol /L NaCl溶液和 ddH2O 将基因组 DNA 稀释至
300 ng /μL，NaCl 终浓度为 0. 3 mol /L。高压灭菌锅
中将基因组 DNA 灭菌打断于 100 ～ 1000 bp 之间。
DNA 片断在沸水浴中变性 10 min，立即置冰上
2 min，65 ℃水浴复性，按照 Cot-1 DNA 动力公式计
算时间复性。用 S1 核酸酶消化，条件为 37 ℃下水
浴 8 min，即得 Cot-1 DNA。
1. 2. 2 Cot-1 DNA 文库构建 Cot-1 DNA 末端加
“A”，反应体系为 10 × Taq buffer 1 μL、dNTP mix
(2. 5 mmol /L)1 μL、Taq 聚合酶(5 U /μL)0. 5 μL、
50 ～ 300 ng纯化产物，最后加 ddH2O至 10 μL，PCＲ
仪中 72 ℃延伸 30 min。用 T4 DNA 连接酶将末端
加“A”后的 Cot-1 DNA 连接到 T 载体上，将连接产
物转化入 Escherichia coli DH5α，在添加 X-gal、
IPTG、Ampicillin的 LB培养基上筛选阳性克隆。
1. 2. 3 探针制备所用 DNA 的扩增 利用通用引
物 M13 以菌落 DNA为模板，进行 PCＲ扩增获得。
1. 2. 4 探针的制备 纯化 PCＲ 产物，通过随机引
物法，用 Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP(Ｒoche Diag-
nostics)进行标记。
1. 2. 5 染色体制片 将赖草的种子放在有湿润滤
纸的培养皿中，常温下发芽。待根尖长至 1. 5 ～
2 cm时，取出根，冰水处理 24 h，用卡诺氏液固定
30 min以上，取根尖分生区部分，45%醋酸火焰干
燥压片，相差显微镜观察，选取中期分裂良好的制
片，－ 80 ℃冰冻。
1. 2. 6 染色体荧光原位杂交 将冰冻的制片揭片，
待脱水干燥后放入 0. 2 mol /L 溶于 70% 酒精的
NaOH溶液变性 10 min，之后立即放入 － 20 ℃预冷
的无水乙醇中，5 min后取出气干。将含有 10 μL杂
交液和 1 μL探针溶液的混合液沸水浴 5 min，杂交
液中含有 50%甲酰胺、50%硫酸葡聚糖、1 mg 鲑鱼
精 DNA、1 μL 20 × SSC 和 10 ng 探针 DNA，取出后
立即放入冰水中冷却。将上述混合液加在制片上，
盖上盖玻片，放在垫有湿滤纸的密闭盒子中，37 ℃
避光杂交过夜。次日取掉盖玻片，用蒸馏水冲洗片
子上的杂交液。气干后在制片上滴加 10 μL DAPI
抗荧光衰减封片剂，封片后荧光显微镜(Leica
DMＲ)观察拍照。
1. 2. 7 染色体臂比分析方法 染色体的相对长度、
臂比及类型参照 A． Levan等［18］的命名系统，核型类
型参照 G． L． Stebbins［19］标准。相关公式为:臂比 =
长臂 /短臂;相对长度(%)=单个染色体长度 /单套
染色体组全长 × 100。
428
4 期 李 媛等:赖草(Leymus secalinus(Georgi)Tzvel．)中一个染色体标记的克隆与鉴定
2 结果与分析
2. 1 利用 FISH技术对Cot-1 DNA文库的快速筛选
随机挑选 40 个克隆，对每个克隆中插入片段进
行探针标记，对赖草根尖有丝分裂细胞进行 FISH筛
选，结果表明，40个克隆中 33 个没有杂交信号。7 个
信号标记比较强的克隆中，2 个表现为端部信号，4 个
表现为弥散状信号，1 个克隆(克隆 40)在多个染色
体、且在染色体不同部位呈现杂交信号，表明克隆 40
可以作为一个细胞学标记在染色体鉴定中加以利用。
2. 2 目标克隆的序列分析
进一步进行测序分析表明，克隆 40 含有 70 bp
长度的插入序列，将该序列与 NCBI 数据库中的核
酸序列进行比对，表明该序列与 GenBank 中公布的
小麦 pTa-885 基因序列(KC290902. 1)同源性达
97%;与 小 麦 pTa-779 (KC290901. 1)、pTa-713
(KC290900. 1)、pTa-551(KC290899. 1)基因序列同
源性达 94%。
2. 3 重复单元的获得
由于 Cot-1 DNA文库中克隆所含的 DNA 片段
为随机打断所得，利用克隆 DNA 进行染色体 FISH
分析时，当克隆所含某重复序列中的一段序列时，就
有可能在染色体产生信号，克隆 40 仅含有 70 bp 的
长度，序列分析没能寻找出重复单元，因此表明克隆
40 中仅含有一个重复序列中的部分序列。为进一
步获得完整重复单元，利用克隆 40 序列设计 1 对引
物 5-CATCGCGGTAGCGACGGC-3 和 5-CGT-
GCTCGTCTCGGCG TC-3，以基因组 DNA 为模板进
行 PCＲ扩增，扩增结果为大小不等的弥散条带。对
弥散条带回收，建立 DNA 文库。菌落 PCＲ 扩增筛
选，选取长度约 1000 bp的克隆进行测序，结果得到
了长度为 690 bp的 DNA序列，利用 DNAMAN 软件
对该序列进行重复单元寻找，发现该序列包含了 6
个完整的重复单元及 3 个含部分重复单元的片段，
重复单元长度约为 90 bp，重复单元之间呈首尾相接
状排列，表明该序列为一典型的串联重复序列(图
1)。由于该重复序列在赖草属物种中首次克隆获
得，命名为 pLs-90。
2. 4 基于 pLs-90 杂交的赖草分子核型分析
利用 ImageJ 1. 48u 软件(imagej． nih． gov / ij /
idex． html)测量赖草核型分析图中的染色体长臂、
短臂的长度，并计算每条染色体的臂比值(长臂 /短
臂)，确定着丝粒位置类型以及计算出染色体的相
对长度(表 1) ，结合 pLs-90 在染色体上不同的信号
分布特征，得到赖草分子核型(图 2)。每对染色体
具体特征如下。
图 1 pLs-90 序列的重复单元(b，d，e，f，g，h)和 3 个部分
重复单元(a，c，i)之间的比对信息
Fig． 1 Alignment between the six complete repeating
units(b，d，e，f，g，h)and three patial repeating
units(a，c，i)of pLs-90 sequence
A:赖草荧光原位杂交图;B:赖草核型分析图。
红色信号为 pLs-90，蓝色为 DAPI染色的中期染色体
A:Fluorescent in situ hybridization(FISH)mapping of L． secalinus，
B:Karyotyping of L． secalinus．
The signals of pLs-90 are red and chromosomes are blue in FISH pictures
图 2 pLs-90探针在赖草中期染色体上的 FISH定位及基于
pLs-90 探针的赖草核型分析图
Fig． 2 Physical mapping and FISH-aimed karyotyping of
pLs-90 on metaphase chromosomes of L． secalinus
528
植 物 遗 传 资 源 学 报 16 卷
表 1 赖草染色体核型参数
Table 1 The chromosome karyotype parameters of L． seca-
linus
染色体编号
Chromosomes codes
相对长度(%)
Ｒelative length
臂比
Arm ratios
类型
Type
1 a 9. 17 1. 55 m
b 1. 54
2 a 8. 57 1. 40 m
b 1. 39
3 a 8. 29 1. 37 m
b 1. 48
4 a 7. 66 1. 30 m(sat)
b 1. 28
5 a 7. 26 1. 17 m
b 1. 17
6 a 6. 7 1. 36 m
b 1. 37
7 a 6. 35 1. 59 m
b 1. 53
8 a 6. 32 1. 20 m
9 a 6. 08 1. 27 m(sat)
b 1. 30
10 a 6. 02 1. 22 m
b 1. 28
11 a 5. 61 1. 31 m
b 1. 31
12 a 7. 39 2. 64 sm
b 2. 54
13 a 7. 32 1. 92 sm
b 1. 87
14 a 7. 27 2. 19 sm
b 2. 05
中部着丝粒染色体(1 ～ 11 号) :1 号染色体在
其短臂的间区、端部、近着丝粒区和长臂间区有点状
信号分布从而与其他的染色体有明显的区别，b 染
色体信号比 a 弱;2 号染色体在其短臂间区有 2 个
强的点状信号与其他染色体具有明显的区分，此外
b的整个染色体均有弱的点状信号分布;3 号染色
体在除了 a长臂端部的其他部位外均有散布的点状
信号分布;4 号染色体在其短臂间区有强的点状信
号分布从而与其他的染色体有明显的区分，在其长
臂上也有散布的点状信号分布;5、6、7 号染色体因
分别在其短臂的端部、短臂的近端部和长臂的端部
有强的点状信号分布从而和其他染色体具有明显的
区分;8 号染色体因在其着丝粒、端部和近端部有强
的信号从而与其他的染色体相区分，此外在其短臂
间区有弱的信号分布;9 号的 a 染色体在其近着丝
粒区和长臂的次缢痕部位有强的点状信号，b 染色
体没有明显的信号分布;10 号 a 染色体在其短臂间
区有强的点状信号，b 染色体在除了长臂间区外的
其他部位有弱的点状信号分布;11 号染色体因具有
强的着丝粒信号很容易与该组其他的染色体区分
开，另外在 a 的端部及 a 和 b 短臂的间区有弱的信
号分布。
亚中着丝粒染色体(12 ～ 14 号):12 号染色体
因在长臂间区有强的点状信号与其他的染色体明显
的区分，在 b 的短臂端部有弱的点状信号分布;13
号染色体因具有除了短臂和长臂端部外的其他部位
有微弱的信号分布从而与其他的染色体相区分;14
号染色体 a 的短臂端部和长臂间区有强的点状信
号，此外 a长臂的间区还有些弱的信号，b 染色体和
a有相同的信号分布，但信号都比 a弱。
3 讨论
染色体荧光原位杂交技术(FISH)结合现代分
子生物学和传统细胞学技术，是当前进行染色体识
别和鉴定最为有效的手段［20-21］，而具有可供利用的
染色体标记是染色体 FISH 鉴定的必备工具。染色
体标记可以通过对重复序列的克隆和鉴定获得，多
种方法可以获得染色体标记，如基因组 DNA酶切条
带的鉴定［22］、基因组 DNA 文库的筛选鉴定等［23］
方法，本研究中利用赖草基因组 Cot-1 DNA 文库进
行染色体标记的筛选，阳性率达 18%。因此可见利
用 Cot-1 DNA文库是快速、经济获得染色体标记的
一种有效手段。
对多个赖草属物种染色体进行 C-带分析以及
DAPI分带分析表明，在染色体近端部显现较强的
C-带和 DAPI带［2 4 -2 6］，而在染色体着丝粒区和染色
体臂中间区缺少明显的带纹，利用染色体分带技术
很难将赖草属所有的染色体进行识别。植物染色体
分带分析中，带纹分布区往往是 DNA重复序列富集
区，赖草染色体带纹多分布在近端部表明，通过重复
序列克隆和鉴定获得近端粒区的染色体标记相对容
易，前人从赖草属物种中获得多个串联重复序列，如
350-bp家族和 Tail 家族重复序列［22］以及 Lt1 重复
序列［26］等均位于染色体近端部。多个散布重复序
列从赖草属物种中得到［11］，但是由于重复序列在染
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4 期 李 媛等:赖草(Leymus secalinus(Georgi)Tzvel．)中一个染色体标记的克隆与鉴定
色体上散布分布，不具备作为染色体标记的价值。
本研究从赖草中克隆和鉴定得到的串联序列 pLs-
90，杂交信号位于染色体端部、近着丝粒区以及染色
体臂的中间区域，而且在不同染色体上分布模式具
有多态性，因此该重复序列可作为赖草染色体鉴定
的一个理想标记。
通过 NCBI数据库中的 DNA 序列比对，表明重
复序列 pLs-90 与来自普通小麦 DNA 序列 pTa-885
(KC290902. 1 )同 源 性 达 97%，与 pTa-779
(KC290901. 1)、pTa-713(KC290900. 1)和 pTa-551
(KC290899. 1)同源性达 94%。FISH结果表明上述
4 个普通小麦中的重复序列在普通小麦染色体上以
点状形式分布于小麦 A、B 和 D 基因组的多个染色
体上［23］。小麦和赖草同属小麦族植物，小麦族包
含有 Ns、H、P、St、Y、W、E 等 20 多个基本基因组，其
中普通小麦中的 A、B和 D基因组，与赖草属物种中
的 Ns和 Xm基因亲缘关系相对较远。pLs-90 与小
麦中重复序列 94%以上的同源性表明，pLs-90 是一
个很保守的重复序列，推测在起源上可能为一个古
老的序列，并且有可能存在于小麦族其他基因组中。
pLs-90 有可能作为研究小麦族不同属间以及属内
不同种间染色体组进化的有效工具。
赖草分子核型分析表明，部分同源染色体间
pLs-90 杂交信号分布具有多态性。自然界中赖草
是以根茎繁殖为主的物种，有性生殖系统相对退
化，天然结实率较低。部分同源染色体间多态性
显示，赖草结实率低可能是由于这些同源染色体
异质导致减数分裂不正常，从而导致花粉败育。
因此，从后代种子中选择纯合的细胞型有可能提
高赖草的结实率，从而解决赖草资源利用中种子
产量低的问题。
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