全 文 ：　2008年 7月
　第 31卷　第 4期
四川师范大学学报(自然科学版)
JournalofSichuanNormalUniversity(NaturalScience)
July, 2008
Vol.31, No.4
　　收稿日期:2007-06-12
基金项目:国家自然科学基金(30370905)资助项目
作者简介:史仁玖(1970-),男,博士 ,主要从事植物生物化学与分子生物学的研究
多枝赖草 GlutathioneReductase基因克隆
及胁迫表达分析
史仁玖 1 , 　郝岗平 1 , 　赵茂林2 , 　杨　清3
(1.泰山医学院 生物科学系 , 山东 泰安 271000;　 2.北京农业生物技术研究中心 , 北京 100089;
3.南京农业大学 生命科学学院 , 江苏南京 210095)
　　摘要:为了获得完整的谷胱甘肽还原酶基因序列 , 根据已克隆到的谷胱甘肽还原酶 cDNA片段设计引
物 ,利用 RACE扩增获得了基因全长序列 ,应用 Southern印迹杂交法分析基因存在状态 , Northern印迹杂交
法研究基因表达情况.结果表明 , 该基因全长 1 580 bp,含一个 1 140 bp的开放阅读框架 , 编码 380个氨基
酸 ,与其它植物谷胱甘肽还原酶氨基酸序列的同源性在 77%-92%之间;Southern杂交表明该基因有一个拷
贝;Northern杂交表明在逆境胁迫下 GR基因表达加强.
关键词:多枝赖草;谷胱甘肽还原酶;盐胁迫;表达
中图分类号:Q945　　文献标识码:A　　文章编号:1001-8395(2008)04-0471-05
0　引言
多枝赖草(Leymusmulticaulis
Tzvel1, 2n=4X=28, XmXmNsNs)系小麦近缘属赖
草属的一个种 ,分布于平原绿洲之盐渍化荒漠草
甸 ,多年生.该种分布于欧亚地区不同的生态环境
下 ,在我国产于新疆 ,拥有多种多样的变异类型 ,它
具有十分发达的根状茎和极强的分蘖能力 ,具有突
出的耐瘠薄 、耐盐碱性和耐寒性[ 1] ,同时还对大麦
黄矮病毒(BYDV)麦长管蚜(PAV)株系 、麦二叉蚜
株系(SGV)株系免疫或高抗 [ 2] .目前 ,对多枝赖草
的耐盐研究多集中于抗逆性杂交育种方面 [ 3] ,有关
其耐盐分子机理的研究尚未见报道.
谷胱甘肽还原酶(GlutathioneReductase, GR)
是植物细胞抗氧化酶系统中的一个关键酶 ,催化氧
化型谷胱甘肽(GSSG)还原生成还原型谷胱甘肽
(GSH), GSH在减缓和清除由活性氧(ROS)、生物
异源物质及重金属造成的环境氧化胁迫中起重要
作用 , GSH可有效还原— S—S键 , 稳定 —SH族蛋
白 ,使膜蛋白结构稳定 ,保护酶结构蛋白上的巯基 ,
抵抗过氧化作用 ,充当自由基的清除剂 [ 4] .到目前
为止 ,谷胱甘肽还原酶 cDNA基因已从豌豆(Pisum
sativumL.)[ 5] 、拟南芥(Arabidopsisthaliana)[ 6] 、水
稻(OryzasativaL.)[ 7]等中得到克隆和鉴定.为了
获得抗逆基因和探讨多枝赖草的耐盐机理 ,本研究
根据已有的研究 [ 8]设计简并引物 ,克隆得到基因全
长 ,并对该基因的组成和逆境表达进行分析.
1　材料和方法
1.1　材料 　多枝赖草一部分材料用 150 mmol/L
NaCl的营养液处理 0、12、24和 72 h;一部分用含
0、50、150和 300 mmol/LNaCl的营养液处理 12 h;
正常生长的材料为对照 ,分别取样液氮速冻后存于
-70 ℃备用.
1.2　方法　
1.2.1　总 RNA的制备　采用 Invitrogen公司的 Tr-
izol试剂提取总 RNA,参照说明书 ,稍有修改.
1.2.2　5′RACE和 3′RACE　设计 5′RACE下游引
物 P1:5′-TGGGTGGTTGGGAGAAAACAGCAGC-3′;
3′RACE上游引物 P2:5′-TCGGCGATGAACCTAC-
CAAACCAGA-3′.扩增程序:94 ℃ 30 s, 72 ℃ 3
min, 5个循环;94℃ 30 s, 70 ℃ 30s, 72℃ 3min, 5
个循环;94℃ 30s, 68℃ 30s, 72℃ 3min, 25个循环;
72℃ 7min.测序由上海生物工程技术服务公司完成.
1.2.3　DNA提取和 Southern印迹杂交　多枝赖草
叶片 DNA采用 CTAB法提取[ 9] .地高辛标记 800
bp的 GRcDNA片段作为探针 , Southern印迹杂交
参照试剂盒使用说明书和 《分子克隆 》[ 10] .
1.2.4　Northern印迹杂交　操作参照试剂盒说明
书和《分子克隆》[ 10] ,探针为约 800bp的 GRcDNA.
2　结果和分析
2.1　GR基因克隆　3′RACEPCR得到一条约 800
bp片段(图 1左).序列测定后 , PCR产物的确切长
度为 819 bp,在 Poly(A)的前面包含真核生物 mR-
NA特有的加尾信号 AATAAA, 3′端是 poly(A),说
明 3′RACEPCR的产物就是 GR基因的 3′端.5′
RACEPCR,得到一条 800 bp左右片段(图 1右),
测序 PCR产物的确切长度为 795 bp.
　　如图 2所示 , 将所得序列拼接成一个完整的
cDNA序列 , 多枝赖草 GR基因 cDNA全长 1 580
bp,包含一个长 1 140 bp的可阅读框(openreading
frame, ORF), 编码 380个氨基酸 , 起始于序列 34
bp,终止于 1 174bp, 5′端非编码区的长度为 33bp,
3′端非编码区的长度为 406bp,在 poly(A)上游 99
bp处有典型的真核生物基因 poly(A)的信号序列
AATAAA,起始密码子 ATG附近有 5′-CAAAGCAT-
TGG-3′序列 ,与其它真核生物中普遍存在的高效转
录起始序列 5′-CA/GNNATGG-3′非常相似.其核苷
酸和氨基酸序列与来自不同植物的 GR基因相应序
列的同源性见表 1,推测其为 GR基因家族新成员.
2.2　推断的 GR蛋白的进化分析　从 GenBank上
查取不同植物 GR蛋白序列 ,连同本研究中推断出
的多枝赖草 GR蛋白序列一起进行进化上的分析.
通过 DNAMAN进行系统进化分析(图 3),发现多
枝赖草和水稻 、玉米最先聚类合并 ,在进化上显示
靠得最近 ,接着与烟草聚类 ,再与其它双子叶植物
类群聚合 ,基本符合按照形态特征进行判定的系统
进化关系.只是最后与一粒小麦聚合 ,与传统的形
态分类有较大差异.推测其原因为:获得植物基因
的植物材料分布范围不同 ,生存环境差异较大 ,长
期对不同环境条件的适应导致了谷胱甘肽还原酶
基因的多样性.
图 3中序列来源植物:水稻 (Oryzasativa,
AAN06855.1)、玉米 (Zeamays, CAA06835.1)、拟
南芥(Arabidopsisthaliana, BAA19653.1)、烟草(Nic-
otianatabacum, CAA53925.1)、葡萄 (Vitisvinifera,
AAB70837.1)、芥菜 (Brassicajuncea, AAK27157.
1)、百日草 (Zinniaelegans, BAD27394.1)、大豆
(Glycinemax, AAF26175.1)、豌豆(Pisumsativum,
CAA62482.1)和(Triticummonococcum, AAQ64632.
1)、多枝赖草(Leymusmulticaulis, AY781786).
表 1　多枝赖草 GR序列与其它植物 GR
相应序列的同源性比较
Table1　ComparisonofLeymusmulticaulisGRsequence
withthesequenceofGRfromotherplants
序列来源 核酸 /% 氨基酸 /% 注册号
Oryzasativa 87 89 XM-470271
Zeamays 85 85 AJ006055
Nicotianatabacum 83 84 AF443181
Vitisvinifera 81 79 AF019907
Zinniaelegans 85 77 AB158514
Soybean 85 77 L11632
Glycinemax 85 77 AF105199
2.3　多枝赖草 GR基因的拷贝数　多枝赖草 800
多 bp的 5′端片段作为探针 ,与完全酶切的多枝赖
草基因组 DNA进行 Southern印迹杂交 ,限制性内
切酶 EcorI、HindII在探针序列内都没有限制性酶
切位点.如图 4,杂交暴光发现在 HindII酶切的基
因组 DNA6.5kb左右有一条清晰的杂交条带 ,在
EcorI酶切的基因组 DNA2.8 kb左右有一条清晰
的杂交条带.结果表明多枝赖草 GR基因在基因组
中仅一个拷贝.
2.4　NaCl胁迫下 GR基因的表达　Northern杂交
用来分析多枝赖草 GR基因在对照和胁迫下的表
达情况 ,暴光信号的强弱显示 GR基因的表达水
平.如图 5A,随着 NaCl胁迫浓度的增加 , GR基因
表达加强 , 150 mmol/L、300 mmol/L处理时增加明
显 , 300 mmol/L处理时基因表达最强.150 mmol/L
472 　　 四川师范大学学报(自然科学版)　　　　　 31卷　　　 　
NaCl不同时间的胁迫处理表明 , GR基因随时
间的增加表达加强 , 24h时处理时的表达水平最高
(图 5B).
3　讨论
谷胱甘肽还原酶在氧化胁迫反应中通过活性
的升高对清除活性氧起积极作用.Northern杂交证
473　第 4期 史仁玖等:多枝赖草 GlutathioneReductase基因克隆及胁迫表达分析 　　
实多枝赖草盐胁迫 12 h,谷胱甘肽还原酶基因 mR-
NA随盐胁迫浓度的升高而增加 , 300 mmol/LNaCl
处理时基因表达最强 ,这是因为盐胁迫浓度的增加
使植物产生了更多的过氧化物 ,为了消除过氧化伤
害 ,植物诱导谷胱甘肽还原酶的表达增加.150mmol/L
NaCl处理 ,在 24 h前谷胱甘肽还原酶 mRNA随胁迫
时间延长增加 ,胁迫时间长 ,过氧化伤害加剧 ,诱导植
物谷胱甘肽还原酶的表达增加.研究表明在 NaCl处理
玉米幼苗过程中 GR活性发生变化 , GR活性在处理初
期上升 ,而后期下降[ 11] .B.campestris在 250 mMNaCI
处理下 ,随着处理时间的增加 , 24 h时 GR的表达最
强 ,然后下降;但比对照表达强[ 12] .这些研究中谷胱甘
肽还原酶的表达变化趋势与我们的研究结果一致.逆
境胁迫使 GR活性发生变化 ,即在胁迫初期活性氧
浓度增加 ,抗氧化酶系统积极参与 , GR活性增加 ,但胁
迫时间延长 ,使酶受到逆境伤害 ,以致 GR活性在胁迫
后期迅速降低.谷胱甘肽还原酶在干旱和盐胁迫下
表达加强说明它的表达可能与渗透胁迫密切相关.
　　植物 GR同工酶存在于不同的亚细胞器中 ,如
叶绿体 、细胞质 、线粒体和过氧化酶体 [ 13] .GRcD-
NA和基因已经在多种植物中克隆 ,可以分为两类:
一类是编码叶绿体 /线粒体的 GR[ 14-17] ,另一类是细
胞质 GR[ 5, 7, 18] .我们获得的 GR序列在 Genbank比
较发现 ,与水稻 、玉米 、百日草 、葡萄 、烟草大豆等的
GR相应序列具有较高同源性(表 1),这些序列为
细胞质 GR,推测所得序列可能是细胞质 GR.
Southern杂交表明多枝赖草 GR在基因组中以
单拷贝存在.不同的植物 GR基因拷贝数不同 ,细
胞质 GR在 P.sativum[ 5] , O.sativa[ 7] , Brassica
campestris[ 12]是单拷贝 , 线粒体 /叶绿体 GR在 A.
thaliana[ 16]和 P.sativum[ 17]中都是单拷贝存在.而
Nicotianatabacum[ 6] , Glycinemax根瘤 [ 14] 和 Vitis
viniferaL.[ 19]中 GR则以多拷贝存在.
有些 GR基因被克隆并转化 ,来自大肠杆菌的
谷胱甘肽还原酶基因导入杂种杨 ,已培育出抗活性
氧的转化体 [ 20] ;R.G.Stevens等[ 21]将菜豆细胞质
GR基因转入烟草 , GR的总活性提高 3-7倍.通过
多方面的研究 ,不仅有助于揭开 GR的具体作用机
制 ,同时给利用 GR基因改造植物带来了希望.
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CloningandStressExpressionAnalysisofGlutathione
ReductaseGeneinLeymusmulticaulis
SHIRen-jiu1 , 　HAOGang-ping1 , 　ZHAOMao-lin2 , 　YANGQing3
(1.DepartmentofBiologicalSciences, TaishanMedicalColege, Taian271000, Shandong;
2.BeijingAgro-biotechnologyResearchCenter, Beijing100089;
3.ColegeofLifeScience, NanjingAgriculturalUniversity, Nanjing210095, Jiangsu)
Abstract:Inordertoobtainacompleteglutathionereductase(GR)genesequence, accordingtotheprimersdesignedbythe
clonedcDNAfragmentofglutathionereductaseinLeymusmulticaulis, 5′cDNAand3′cDNAwereobtainedbyRACE.Thispaperuses
southernbolthybridizationmethodtoanalyzethegeneexistencestate, andusesnorthernbolthybridizationmethodtostudythegeneex-
pression.Theresultsshowthatthegeneis1 580 bpinlength, includinganopenreading, encoding380 aminoacids.Itssequences
sharedhighsimilarityatpolypeptidelevelwiththesequencesfromtheglutathionereductaseofotherplants.Southernblotanalysis
showsthatGRgenemayhaveasingle-copyinLeymusmulticaulis.NorthernblotanalysisindicatesthattheGRgeneexpressionwillbe
stronginbadconditionstress.
Keywords:Leymusmulticaulis;Glutathionereductase;Saltstress;Expression
(编辑　李德华)
475　第 4期 史仁玖等:多枝赖草 GlutathioneReductase基因克隆及胁迫表达分析