全 文 ：第 33卷 第 4期 水 生 生 物 学 报 Vol.3 3, No.4
2 0 0 9年 7月 ACTAHYDROBIOLOGICASINICA Jul., 2 0 0 9　
收稿日期:2008-10-16;修订日期:2009-04-02
基金项目:国家自然科学基金(20273019, 20573034);河南省高校杰出人才计划(2006KYCX021);河南省科技攻关计划(0624440039)资助
作者简介:马剑敏(1964—),男 ,河南偃师人;博士;主要从事污染与修复生态和环境生物学研究。 E-mail:mjm6495@sina.com
通讯作者:王键吉 , E-mail:jwang@henannu.edu.cn
DOI号:10.3724 /SP.J.0000.2009.40696
溴化 1-己基-3-甲基咪唑对斜生栅藻谷胱甘肽及其代谢酶的影响
马剑敏 1, 2　蔡林林 1　胡灵卫 1　靳同霞 1　李效宇 1　王键吉 2
(1.河南师范大学生命科学学院 ,新乡　453007;2.河南省环境污染控制重点实验室 ,新乡　453007)
摘要:研究了浓度为 0、1、5、10、15、20 mg/L的新兴离子液体溴化 1-己基 -3-甲基咪唑([ C6mim] Br)在 24h、 48h、 72h
和 96h对斜生栅藻还原型谷胱甘肽(GSH)及其代谢酶-谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽转硫酶(GST)和谷胱
甘肽还原酶(GR)的影响。结果表明:GSH含量在 24h、 48h和 72h时 ,在最低处理浓度下不变 , 其他处理浓度下随
胁迫浓度增加而降低 , 96h时则与对照无差异或较小;GPX和 GST的活性在 72h之前明显升高(最高浓度组的 GST
活性有波动), 96h时均降低至对照水平;GR活性在 24h时 , [ C6mim] Br=1 mg/L时升高 , 之后降低 , 在 48h增高至
对照水平 , 72h时 , [ C6mim] Br≥10 mg/L的处理组高于对照水平 , 96h时 , 除最低处理组外 ,均降至对照水平以下。
GR是 GSH系统中的限速酶 , GST则是该系统中活性和灵敏性最高的酶 ,可作为 [ C6mim] Br胁迫时的敏感的生物
标志物。 1 mg/L的 [ C
6
mim] Br可引起藻细胞的氧化胁迫 ,具有环境毒性。
关键词:离子液体;斜生栅藻;还原型谷胱甘肽;谷胱甘肽转硫酶;谷胱甘肽过氧化物酶;谷胱甘肽还原酶
中图分类号:X171.5;Q945.78　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3207(2009)04-0696-06
　　传统的化学反应和分离过程涉及大量的有毒 、
易挥发有机溶剂 ,容易造成严重的环境污染 。一种
新型的 “绿色溶剂 ”-离子液体因具有极低的蒸汽
压 、不挥发 、导电性强 、对许多无机盐和有机物有良
好溶解性等诸多优点使之在分离过程 、电化学和化
学反应等领域显示出了广阔的应用前景 [ 1, 2] 。但人
们也逐渐认识到 ,它对环境并非没有威胁 [ 3— 6] 。
藻类作为水生生态系统的初级生产者 ,是监测
评价水环境质量的重要指标[ 7, 8] 。斜生栅藻
(Scenedesmusobliquus)对毒物敏感 、易获得 、个体小 、
繁殖快 、培养方便 , 是一种常用的测试生物[ 9— 11] 。
另外 ,生物内源还原型谷胱甘肽(GSH)与应激反应
有密切的关系[ 12] ,它是细胞环境中一个重要的非酶
抗氧化剂 ,可以维持受胁迫细胞抗氧化体系的完整
性 。由 GPX和 GST参与 、GSH氧化产生的氧化型
谷胱甘肽(GSSG),在 ATP提供能量的情况下 ,可以
由 GR还原重新产生 GSH,从而维持细胞内 GSH库
的稳定 [ 13] 。在这个循环中活性氧 (ROS)可以由
GPX和 GST在 GSH作为底物的前提下清除 ,因此
GPX、GST和 GR也是抗氧化防御系统的重要成员 。
因此研究 GSH代谢及循环中酶活性变化对于揭示
化学物质的环境毒性很有必要。
目前关于离子液体的环境毒性与毒理的研究仅
有少量报道[ 14— 16] ,对生物体的抗氧化系统的影响 ,
尤其是对 GSH及其代谢酶的研究尚未见报道。咪
唑基离子液体是一类已经实现了较大规模的生产和
应用的新兴绿色溶剂 ,其环境毒性迫切需要研究。
目前 Cho, etal.已证明离子液体对羊角月牙藻的毒
性比传统的有机溶剂甲醇 、N, N-二甲基甲酰胺 、2-
丙醇的毒性大 [ 17] 。本试验以斜生栅藻为受试生物 ,
研究了溴化 1-己基 -3-甲基咪唑([ C6mim] Br)对其
GSH含量以及 GST、GPX和 GR活性变化的影响 ,初
步探讨了谷胱甘肽循环酶对离子液体胁迫作出的反
应 ,以期在生物大分子水平上探讨离子液体对生物
机体的影响及其产生毒害的机制 ,并为评价离子液
体的环境毒性积累科学依据 。
1　材料与方法
1.1　试验材料　斜生栅藻由中国科学院水生生物
研究所淡水藻种库提供 。离子液体:溴化 1-己基-3-
甲基咪唑([ C6mim] Br)由河南师范大学化学与环
境科学学院参照 Bonhôte的方法合成 [ 18] 。其他试剂
4期 马剑敏等:溴化 1-己基-3-甲基咪唑对斜生栅藻谷胱甘肽及其代谢酶的影响 697　
均为分析纯 。
1.2　藻的培养　斜生栅藻在无菌条件下转移至
BG-11人工培养液中 ,于光照培养箱中培养一周 ,至
对数生长期进一步扩大培养。培养条件为:温度
(28±0.5)℃,光暗比 12h∶12h,光强为 4000lx,静置
培养 ,每天定时摇动三次。
1.3　处理方法　用处于对数生长期的斜生栅藻接
种于灭菌的 BG-11培养基中 ,接种浓度为 106个 /
mL,加入离子液体 [ C6 mim] Br,使其最终处理浓度
分别为 0、1、5、10、15和 20 mg/L,该浓度梯度是根
据预试验 、由直线内插法确定 [ 19] ;培养 96h,培养条
件同上;每个处理设四个平行。
1.4　生化指标的测定　样品制备:在 96h的处理期
中 ,每间隔 24h取样一次 ,常温离心 10min(4000 r/
min)收集藻体 ,共取样 4次 。称取藻体 0.2 g,加入
磷酸缓冲液(0.05 mol/L, pH7.8)与适量石英砂充
分研磨(冰浴),样品∶缓冲液为 1∶5。 15000 r/min、
4℃离心 15min,上清液储藏于 -20 ℃备用。
可溶性蛋白用 Bradford法 [ 20] 测定 ,以 μg/mL
表示样品的蛋白含量 。 GST(EC2.5.1.8)、GPX
(EC1.11.1.9)和 GR(EC1.6.4.2)均采用南京建
成生物公司提供的检测试剂盒测定 ,用 U/mg蛋白
表示酶活性;GST和 GPX的酶活力单位定义为:每
毫克蛋白每分钟在 37℃扣除非酶促反应 ,使反应体
系中 GSH浓度降低 1 μmol/L为一个酶活力单位;
GR的酶活力单位定义为:每毫克蛋白每分钟在
37℃扣除非酶促反应后 , 使 NADPH浓度减少
1 μmol/L为一个酶活力单位 。还原型谷胱甘肽
(GSH)参照庞占军等的方法测定[ 21] ,通过标准曲线
计算其含量(单位:μg/100mgFW)。
1.5　统计分析 　所有数据均采用 SPSS11.5 for
Windows软件进行单因素方差分析(ANOVA),多重
比较采用 Tukey法进行 , 其结果以标记字母法表
示[ 22] ,用小写字母表示不同处理之间的差异达到显
著水平(p<0.05),用大写字母表示差异达到极显
著水平(p<0.01),同时标记在柱形图上方 。数据
结果表示为:平均数 ±均数的标准误(用误差线显
示在图上)。
2　结　果
2.1　[ C6mim] Br对斜生栅藻 GSH的影响
GSH含量在 24h、48h和 72h时 ,在最低处理浓
度下不变 ,其他处理浓度下随胁迫浓度增加而降低 ,
但随着时间的延长 ,降低幅度减小 , 96h时则与对照
组无差异或较小(图 1)。
2.2　[ C6mim] Br对斜生栅藻 GPX的影响
GPX活性在 [ C6mim] Br处理 24— 72h时 ,比对
照组明显升高 ,但在 96h时各浓度组的 GPX活性下
降至正常水平 ,除 1和 5 mg/L浓度组之间有差异
外 ,其他浓度组间无显著差异(图 2)。
2.3　[ C6mim] Br对斜生栅藻 GST的影响
经 [ C6mim] Br处理 24h时 ,各浓度组的 GST活
性均显著高于对照组 ,但各组之间无显著差异;48h
和 72h时 ,随处理浓度的提高 , GST活性先升后降;
96h时各浓度处理组 GST活性与前期相比 ,均有大
幅度下降 ,与对照组无差异或较小(图 3)。
图 1　不同时间 [ C6mim] Br处理对斜生栅藻 GSH含量的影响
Fig.1　Efectof[ C6mim] BronthecontentofGSHofS.obliquusafterexposurefordiferenttimes(mean±S.E.)
698　 水　　生　　生　　物　　学　　报 33卷
2.4　[ C6mim] Br对斜生栅藻 GR的影响
[ C6mim] Br处理 24h时 , GR的活性在 1 mg/L
的处理浓度下已显著高于对照组 ,但之后随着处理
浓度的增高波动中下降 ,但在 48h时又升至对照组
水平;72h时 , [ C6mim] Br≥10 mg/L的处理组的 GR
活性开始显著高于对照组;96h时 , GR的活性除在
[ C6mim] Br=1mg/L时显著高于对照组外 ,之后随
着处理浓度的升高而降低(图 4)。
3　讨　论
3.1　[ C6mim] Br胁迫前期 GSH循环系统的作用
机制
GSH循环系统是细胞中重要的抗氧化防御系统
之一 ,作为 GSH系统重要成员之一的 GSH,因含有巯
基而被用作还原剂 ,在维持细胞内环境的氧化还原平
衡中有重要的作用 [ 23, 24] 。本研究表明 , 24h的
4期 马剑敏等:溴化 1-己基-3-甲基咪唑对斜生栅藻谷胱甘肽及其代谢酶的影响 699　
[ C6mim] Br处理 ,引起了斜生栅藻的 GSH含量显著
降低 ,且表现出明显的剂量效应关系 ,说明随着
[ C6mim] Br胁迫强度的增加 ,藻细胞内发生了强烈的
氧化反应。有文献指出在逆境条件下 GSH的氧化产
物 GSSG有显著的升高现象 [ 25] ,这是氧化应激的一个
极为敏感的反应 [ 26] ,可引起 GSH含量的降低 ,这与
本试验的结果吻合。同期的 GPX和 GST活性均显著
高于对照组 ,说明 [ C6mim] Br对斜生栅藻已造成了氧
化胁迫 ,诱导了抗氧化酶 GPX和 GST活性的显著升
高和其底物 GSH含量的降低;该期 GST活性最高 ,对
氧化胁迫的敏感性最大 ,表明它是斜生栅藻抗氧化防
御系统中的重要酶。高的 GSH/GSSG比率是维持最
佳的蛋白质合成条件所必需的 [ 24] 。本试验中 GSH
含量的减少显然对藻细胞不利 ,在一定程度上诱导
GR活性的增加 ,但 24h时的 GR活性总体上是很低
的 ,说明 GR活性的诱导在氧化与抗氧化反应中有一
定的延迟性。
图 4　不同时间 [ C6mim] Br处理对斜生栅藻 GR活性的影响
Fig.4　Efectof[ C6mim] BronGRactivitiesofS.obliquusafterexposurefordifferenttimes(mean±S.E.)
3.2　[ C6mim] Br胁迫中期 GSH循环系统的作用
机制
逆境胁迫可引起 ROS的显著增高[ 27] 。 GPX、
GST和 GR的活性在 [ C6mim] Br处理 48h和 72h时
均明显增大 ,并在 72h时达到最高 。表明此时藻细
胞因胁迫而引起的氧化胁迫已经达到了较高的水
平 ,消耗 GSH的 GST和 GPX与形成 GSH的 GR均
处在高度活跃状态 ,但该期 GSH含量仍处于降低趋
势 ,说明 GR的作用仍不足以弥补藻细胞抗氧化反
应所动员的 GSH总量 ,此时藻细胞中的氧化与抗氧
化系统处于平衡略偏氧化的状态。
3.3　[ C6mim] Br胁迫后期 GSH循环系统的作用
机制
96h时 GPX和 GST活性较前期均显著降低 ,恢
复至正常水平或略低于正常值 ,而 GR在低浓度胁
迫(1 mg/L)时显著高于对照 ,但随胁迫浓度的增高
而显著降低 , GSH水平维持在较高的水平 , 说明
[ C6mim] Br的胁迫已经造成抗氧化防御系统的损
伤 ,产生的大量氧自由基 ,已超出了抗氧化酶的解毒
能力 ,从而改变了细胞内环境的氧化还原电位或者
调节了酶的活性中心 [ 28, 29] ;同时也表明 GR对 [ C6
mim] Br具有较强的耐性。综合酶活性在各个时间
段及各处理浓度下的变化可知:GR是 GSH循环系
统中的限速酶 。
以上说明:面对 [ C6mim] Br的胁迫 , GSH的循
环酶对斜生栅藻的抗氧化防御做出了重要的贡献 ,
但仍未完全阻止实质性损伤的发生 。这与 [ C6mim]
Br对斜生栅藻的急性毒性结果(EC50)(另文发表)
以及对初级生产力 、SOD、CAT、MDA的影响是一
致的 [ 30] 。
本实验从谷胱甘肽循环酶及其动态变化(抗氧
化系统Ⅱ)的角度出发 ,证明了 1 mg/L的 [ C6mim]
Br在 96h内可对斜生栅藻造成一定程度的氧化损
伤 ,显示出其环境毒性。故在使用时应采取有效的
措施 ,尽量避免或减少其在环境中的排放。
700　 水　　生　　生　　物　　学　　报 33卷
4　结　论
综合以上的结果可知:(1)斜生栅藻在受到
[ C6mim] Br的作用时 , 在 72h之前 , GST和 GPX活
性先期均明显升高 ,略后 GR的活性也明显升高 ,
96h时三种酶的活性均下降至对照水平上下 , GSH
含量始终低于对照 ,藻细胞受到氧化胁迫;(2)GST
是斜生栅藻抗氧化系统 Ⅱ中活性和灵敏性最高的
酶 ,在斜生栅藻抵御 [ C6mim] Br引起氧化损伤的初
期发挥重要作用 ,可作为 [ C6mim] Br胁迫时的敏感
的生物标志物;(3)GR是 GSH循环系统中的限速
酶 ,并且对 [ C6 mim] Br胁迫表现出较强的耐性 。
(4)[ C6mim] Br具有一定的环境毒性 。
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RESPONSESOFGLUTATHIONECYCLEENZYMESANDGLUTATHIONE
METABOLISMTO 1-HEXYL-3-METHYLIMIDAZOLIUM
STRESSINSCENEDESMUSOBLIQUUS
MAJian-Min1 , 2 , CAILin-Lin1 , HULing-Wei1 , JINTong-Xia1 , LIXiao-Yu1 andWANGJian-Ji2
(1.SchoolofLifeScience, HenanNormalUniversity, Xinxiang　453007, China;
2.HenanKeyLaboratoryforEnvironmentalPolutionControl, Xinxiang　453007, China)
Abstract:Theefectsofionicliquid1-hexyl-3-methylimidazolium([ C6mim] Br), withtheconcentrationsof0, 1, 5, 10,
15 and20 mg/Landexposedforthe24, 48, 72and96hrespectively, onglutathione(GSH)andtheenzymesinglutathi-
onemetabolismofScenedesmusobliquussuchasglutathioneperoxidase(GPX), glutathioneS-transferases(GST)andglu-
tathionereductase(GR)werestudiedinthepresentstudy.TheresultsindicatedthattheGSHcontentsdecreasedwiththe
concentrationof[ C6mim] Brincreasingatthe24, 48 and72h, butitdidnotchangewhen[ C6mim] Br=1mg/L.The
GSHcontentsweresimilartoorlowerthanthatofthecontrollevelatthe96h.TheactivitiesofGPXandGSTincreased
markedlybefore72hexceptfortheactivityofGSTatthehighestconcentration(20 mg/L), buttheybothdecreasedtothe
controllevelatthe96h.TheactivitiesofGRincreasedattheconcentrationof1mg/Landthendecreasedwiththeconcen-
trationincreasingatthe24h, increasedtothecontrollevelatthe48h, andthenreacheditspeakatthe72h(when[C6
mim] Br≥10 mg/LtheGRactivitiesexceededthecontrollevel), butatthe96h, itdecreasedmarkedlyevenweakerthan
thecontrollevel.GRwastheenzymethatlimitedthereactionvelocityinthesystemofglutathionecycleandtheGSTwas
themostactiveandsensitiveenzyme.Itcouldbeusedassensitivebiomarkersunderthestressinducedby[ C6mim] Br.
[ C6mim] BrinducedoxidativestresofS.obliquusattheconcentrationof1 mg/Landhadenvironmentaltoxicity.
Keywords:Ionicliquid;Scenedesmusobliquus;Glutathione;GlutathioneS-transferases;Glutathioneperoxidase;Gluta-
thionereductase