全 文 ：第 37 卷 第 2 期 河南大学学报(自然科学版) Vol. 37　No. 2
2007 年 3 月 Journal of H enan Univer sity (Natural Science) Mar. 2007
粗山羊草 Y189抗小麦白粉病基因 SSR标记
张海泉
(河北经贸大学 生物科学与工程学院 ,河北 石家庄 050061)
　收稿日期:2006-10-20
　基金项目:河北省科技厅河北省科学技术研究与发展指导计划“微卫星标记小麦野生资源抗病基因及抗病基因的利用”
(05225510);河北省教育厅科学研究计划项目“微卫星标记小麦抗白粉病基因”(Z20006103)
　作者简介:张海泉(1964 -), 男 ,辽宁锦州人 , 博士 ,副研究员 , 从事分子生物学研究. E-mail:hqzhang188@yahoo. com. cn.
摘　要:从粗山羊草[ Aegilops tauschii (Coss.) Schma l] Y189 中鉴定出 1 个显性抗小麦白粉病基因 , 暂定名为
PmAeY2. 应用分离群体分组法(BSA)筛选到 X gwm583-5D、X gwm174-5D、X gwm182-5D和 X g wm271-5D 标记
与该基因之间的遗传距离分别为 25. 7 、16. 7、9. 1 和 7. 0 cM . 根据连锁标记所在小麦微卫星图谱的位置 , PmAeY2
被定位在 5DL染色体上. 分析基因所在染色体的位置 、抗病性特征认为 PmAeY2 是一个新的抗白粉病基因 ,并可
用于分子标记辅助选择.
关键词:粗山羊草;小麦白粉病;抗病基因;SSR标记
中图分类号:Q781 　　　文献标识码:A 文章编号:1003 - 4978(2007)02 - 0177 - 04
SSR Markers Linked to a Powdery Mildew Resistance Gene in
Aegilops tauschii Y189
ZHANG Hai-quan
牗College o f Biological S cience and Engineering牞Hebei University of Economics
and Business牞Shij iaz huang 050061牞China牘
Abstract牶A dominant powdery mildew resistance gene牞temporarily designated a s PmAeY2牞w as identified in an
accession Y189 o f Aegilops tauschii牣By bulk seg rega tion analysis牞fo ur micro sa tellite ma rke rs X gwm583-5D牞
X gwm174-5D牞X gwm182-5D and X gwm271-5D were found to be linked to Pm AeY2 with gene tic distances o f 25牣7牞
16牣7牞9牣1 and 7牣0 cM牞respectively牣According to the locations of the linked markers牞the resistance gene w as
located on chromosome 5DL牣Based on the chromosomal location and the resistance pattern of the gene牞w e propose
tha t PmAeY2 is a nove l pow dery mildew resistance gene牞and can be selected by marker-a ssisted selection牣
Key words牶Aegilops tauschii牷wheat pow dery mildew牷resistance genes牷SSR marke r
　　小麦是河北省第一大粮食作物 ,是我国第二大粮食作物.小麦白粉病是严重影响小麦生产的主要病害之一 ,每
年发生面积超过1 200万hm2 ,成为涉及中国20多个省市主要的常发病害[ 1] .目前 ,虽然有34个小麦白粉病抗病基
因被命名[ 2 ,3] ,但绝大多数已经丧失抗性或与不良性状紧密连锁 ,能够在育种上应用的基因数量有限.积极挖掘新
的小麦白粉病抗病基因 ,拓宽小麦遗传基础 ,对中国小麦育种具有非常重要的意义.
小麦野生近缘属———粗山羊草中蕴含着丰富的遗传资源 ,是小麦抗病和一些优良性状的重要来源.李文才
等[ 4] 发现粗山羊草的 D组染色体对小麦的穗长 、千粒重 、单株穗数和单株产量具有显著影响.杨烈等[ 5] 发现 12份
粗山羊草对中国条锈病新小种 CYR32成株期免疫或高抗 ,Gill等[ 6]评价了 60份粗山羊草对叶锈 、白粉病及蚜虫和
黑森瘿蚊的抗性 , 发现32份粗山羊草抗叶锈、31份粗山羊草抗白粉病 、24份粗山羊草抗蚜虫 、16份粗山羊草抗黑
森瘿蚊. Lutz J S和 Hsam L K等[ 7] 在方穗山羊草中发现了 2个抗白粉基因 Pm2和 Pm19 ,分别定位在 5D和7D
上. Ma H 等[ 8] 将一大批粗山羊草的抗条锈病基因转育至四倍体小麦 -粗山羊草人工合成种中 , 抗性遗传规律尚
待进一步分析.张海泉等[ 9]用抗病粗山羊草与感病粗山羊草杂交 ,成功将抗小麦白粉病菌株 E11的基因定位在2D
染色体上.本文报告的抗病基因 PmAeY2定位在5DL染色体上 ,与 Miranda L M 等[ 3] 从粗山羊草发现的 Pm34基
因进行比较 ,发现2个基因都定位在5DL上 ,但位置相差较远 ,不可能是同一个基因.
DOI牶牨牥牣牨牭牴牴牨牤j牣cnki牣牬牨牨牨牥牥牣牪牥牥牱牣牥牪牣牥牨牰
178　 河南大学学报(自然科学版), 2007年 ,第 37卷第2期
1　材料与方法
1. 1　实验材料
38份粗山羊草材料 ,由中国农科院品资所提供;12个小麦白粉病单孢堆分离菌株和小麦白粉病混合菌株 ,由
中国农科院植保所提供.试验于 2004年11月—2006年8月在石家庄试验地和温室中进行.
1. 2　抗病性鉴定和杂交
采用室内离体叶和田间混合菌种接种鉴定粗山羊草对小麦白粉病的抗性 ,选取抗病的粗山羊草与感病的粗山
羊草杂交 ,鉴定F1代抗病性 ,F1代自交得到F2代 ,鉴定 F2代抗感分离情况.
1. 3　DNA的提取
按CTAB 法[ 10] 提取亲本 DNA和F2代分离群体单株的 DNA.
1. 4　SSR扩增
微卫星引物
Xgwm系列按照 Röder M S 等[ 11] 公布的序列合成 ,WMC 系列引物根据国际小麦微卫星协会(Wheat
Microsatellite Consortium)网上公布的序列合成(http:/ / res2. agr. ca /Winnipeg / index_e. htm).
PCR反应体系
每个 PCR反应体系为25μL ,其中含基因组DNA(20 ng /μL)4μL;引物(2 mmol /μL)3μL;Taq DNA多聚酶
(5 U /μL)0. 2μL;10×PCR缓冲液2. 5μL;MgCl2(25 mmol /L)1. 8μL;dNTPs(25 mmol /L)0. 2μL ,加入超纯水补
足体积.
PCR反应程序
PCR扩增在 MJ research thermocycler上进行. 反应条件为94 ℃预变性5 min ,94 ℃变性1 min ,50 、55或60 ℃
(依据引物退火温度而定)退火1 min ,72 ℃延伸1 min ,循环 35次 ,72 ℃延伸5 min.
PCR产物电泳
(1)扩增 DNA变性:每个扩增产物加 8μL标记缓冲液(98 %甲酰胺;10 mmol /L EDTA ,pH8. 0;0. 25 %溴酚
兰和 0. 25 %二甲苯青),95 ℃变性6 min ,迅速放到冰水中冷却.(2)电泳:50 W恒定功率下 6 %聚丙烯酰胺变性胶
预电泳 20 min(用 1×TBE作为电极缓冲液). 每个点样孔加入变性产物 6～ 8μL ,电泳1 h左右(根据引物的分子
量大小适当调整电泳的时间).
1. 5　银染和显影
变性的聚丙烯酰胺凝胶的银染和显影参照 Tixier的方法[ 12] .
1. 6　SSR标记分析
用分离群体分组分析法(bulked segregation analysis BSA)筛选与抗病基因连锁的微卫星标记[ 13] .
(1)SSR标记筛选
用小麦白粉病混合菌株接种 F2单株苗 ,鉴定抗感性.分单株提取 DNA ,建立 F2代抗感分离群体.将20株抗病
单株的 DNA混合成抗病池 ,20株感病单株的 DNA混合成感病池 ,以抗病亲本 、感病亲本 、抗病池、感病池的 DNA
为模板 ,筛选SSR引物.
(2)连锁分析
用具有多态的SSR引物标记 F2抗感分离群体的单株 ,统计带型. 按照 Mapmaker数据记录方法统计带型数
据 ,采用 Mapmaker /exp 3. 0[ 14]软件进行连锁分析 ,用 Kosambi[ 15] 作图方法将重组率转换成遗传距离(cM),将基因
定位在染色体上.
(3)χ2检验 χ2c =(│A -3a│- 2)2 /3n. A为显性实际观测值;a为隐性实际观测值 ,n=A+a.
2　结果
2. 1　粗山羊草的抗性鉴定及其杂交
38份不同产地的粗山羊草用离体叶段法分别接种12个白粉病菌株 ,鉴定抗性. 结果发现:Y176对12个小麦
白粉病菌株均表现高感 , Y189对12个白粉病菌株均表现高抗. 田间白粉病混合菌株鉴定结果为 , Y176抗病反应
型为 4级 ,高感;Y189抗病反应型为0 ,免疫.
张海泉:粗山羊草 Y189抗小麦白粉病基因 SSR标记 179　
将粗山羊草材料 Y189和 Y176杂交 ,用混合菌种接种 F1和 F2代 ,F1单株全部表现为抗病 ,F2单株出现了抗感
分离. 由表 1可以看到 ,在 455株 F2后代中 ,无论田间病圃还是离体叶鉴定 ,分离比均符合孟德尔单显性基因的分
离比3∶1(P>0. 05),F2分离群体的SSR带型也表明 ,抗病基因只有1个 ,来自于粗山羊草 Y189(表2),感病基因也
有1个 ,来自于感病亲本 Y176 ,证明抗病基因是由1个显性基因控制.
表 1　F2分离群体抗性鉴定结果
Tab. 1　Results of the F2 segregation population resistance to powdery mildew
世代 鉴定方式 总株数 抗病株数 感病株数 观察比例 理论比例 χ2值 卡平方测验
F2
田间病圃 455 358 97 3. 69∶1 3∶1 3. 10 P>0. 05
离体叶 455 349 106 3. 29∶1 3∶1 0. 70 P>0. 05
　注　χ2[ 1] =3. 84时 , P=0. 05
PS:感病亲本 Y176;PR:抗病亲本 Y189;BR:抗病池;BS:感病池;R:抗病单株;S:感病单株
PS:susceptible parent Y176;　PR:resistance parent Y189;　BR:resi stance pool;
BS:susceptible pool;　R:resistance plant;　S:susceptible plant
图1　微卫星引物 Xgwm182在粗山羊草 Y189×Y176 F2群体部分单株中的扩增产物
Fig. 1　PCR bands amplified from the DNA of selected F2 plants derived from a cross of Y189 and
Y176 using primer pair Xgwm182
图 2　抗白粉病新基因 PmAeY2的遗传连锁图
Fig. 2　Genetic linkage map of the PmAeY2
novel powdery mildew resistance gene
2. 2　PmAeY2基因的 SSR标记
用抗感亲本和抗感池筛选 525 对 Xgwm 系列引物 、96 对
WMC 系列引物和 54对 Xbarc系列引物 ,其中 15对引物具有多态
性. 它们分别是 Xgwm4-4A 、X gwm6-4B 、Xgwm18-1B 、Xgwm37-
7D 、Xgwm583-5D 、 Xgwm174-5D 、Xgwm182-5D 、Xgwm271-5D 、
Xbarc044-5D 、 Xbarc143-5D 、 Xbarc144-5D 、 WMC136-5D 、
WMC233-5D 、WMC215-5D和 WMC161-5D. 去除 A 、B 染色体组
上的 3对引物和 D染色体组上引物 Xgwm37-7 D ,其余的引物都
位于 5D染色体上.图 1是引物 Xgwm182在 F 2分离群体部分扩增
的结果 ,表明引物共扩增出 2个片段大小分别是 217 bp和 209 bp
的多态性片段 ,其中 217 bp的片段来自于 Y189 ,与抗病性有关;大
小为 209 bp 的片段来自于 Y176 , 与感病性有关 , 因此标记
Xgwm182为共显性标记. 利用 Mapmaker /exp 3. 0(Lander et
al[ 14] ,)软件计算 ,用 Kosambi [ 15] 作图方法将重组率转换成遗传距
离(cM ), 发现 Xgwm583-5D 、X gwm174-5D 、Xgwm182-5D 和
Xgwm271-5D与抗病基因紧密连锁 ,与抗病基因的遗传距离分别
是 25. 7 、16. 7 、9. 1和 7. 0 cM(图 2),抗病基因暂命名为 PmAeY2.
表 2　X gwm583 、X gwm174 、Xg wm182 和 X gwm271 引物在粗山羊草 Y189 和 Y176的 F2 分离群体上带型
Tab. 2　Marker Xgwm583、Xgwm174、Xgwm182 and Xgwm271 linker to resistance gene in
F2 population derived from Aegilops tauschii Y189 and Y176
表现型
SSR标记 抗病株 R(358)
AA Aa aa
感病株 r(97)
AA Aa aa
X gwm583 243 102 13 12 20 65
X gwm174 268 75 15 22 7 68
X gwm182 235 111 12 8 15 74
X gwm271 229 118 11 15 18 64
注　AA为抗病基因扩增片段;aa为感病基因扩增片段;Aa为杂合带扩增片段;R为抗病表现型植株;r为感病表现型植株.
180　 河南大学学报(自然科学版), 2007年 ,第 37卷第2期
3　讨论
目前小麦白粉病抗病基因已命名 34个[ 2 , 3] ,有 4个抗病基因来自山羊草属 ,其中 Pm19和 Pm34来自于
粗山羊草. Pm19被定位在 7D染色体上 , Pm34定位在 5DL 上. Pm34是 M iranda L M 等[ 3] 从粗山羊草向
普通小麦转入的一个抗白粉病基因 ,通过 SSR标记 ,定位在 5DL 上. Pm34与 Xbarc177-5D 、Xbarc144-5D
和 Xgwm272-5D标记的遗传距离分别为 5. 4 、2. 6 、14. 0 cM , Xbarc144 标记是 Pm34紧密连锁的特异性标
记. 本研究初步筛选引物时虽然 Xbarc144 标记在抗感池出现多态 ,但用 Mapmaker /exp 3. 0(Lander et
al[ 14] ,)软件计算时 , Xbarc144 与 PmAeY2 基因不是连锁关系. Pm34 与着丝点的遗传距离大约为
143. 1 cM ,而 PmAeY2与着丝点间的遗传距离约为 53. 8 cM ,因此可以认定 , PmAeY2是新的小麦白粉病
抗病基因. 经抗病性鉴定和SSR标记 ,发现抗感病单株分离群体的分离比例符合 3∶1的显性单基因孟德尔
分离比率 ,此结果证实新基因为显性单基因.
根据基因所在染色体的位置 、抗病性特征以及连锁标记扩增的特异性 ,可以认为 PmAeY2是个新的抗
白粉病基因并且可以应用于分子标记辅助选择.
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责任编辑:康燕丽