全 文 ：１３２０－１３２５
０７／２０１１
草　业　科　学
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ
２８卷０７期
Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．０７
干旱胁迫下赖草抑制性消减文库的
构建与分析
杨满业１，王丽焕１，叶煜辉２，江明锋２，肖冰雪１
（１．四川省草原科学研究院，四川 成都６１１７３１；２．西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都６１００４１）
摘要：用根际水分胁迫对赖草（Ｌｅｙｍｕｓ　ｓｅｃａｌｉｎｕｓ）植株进行干旱胁迫，利用抑制消减技术，以干旱胁迫处理为ｔｅｓｔ－
ｅｒ，正常生长对照组为ｄｒｉｖｅｒ，构建了包含５７６个克隆的赖草消减ｃＤＮＡ文库。通过斑点杂交筛选，得到１６个
ＥＳＴ序列，大小居于１００～３１０ｂｐ。Ｂｌａｓｔ比较发现，这些序列与大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）和小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉ－
ｖｕｍ）干旱诱导下表达的序列、甜菜碱醛脱氢酶核酸序列、植物热激蛋白ｈｓｐ７０核酸序列、１，５－二磷酸核酮糖羧化
酶氨基酸序列、植物遍在蛋白缀合酶氨基酸序列、植物５０Ｓ核糖体蛋白Ｌ２０基因序列等相关抗旱基因具有较高的
同源性。以上结果说明，本研究得到了部分赖草抗旱相关基因片段，可为赖草抗旱机理的研究以及抗逆基因的克
隆奠定一定的基础。
关键词：赖草；抑制性消减杂交；干旱胁迫；ＥＳＴ
中图分类号：Ｓ５４３＋．９０３．４；Ｑ９４５．７８　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００１－０６２９（２０１１）０７－１３２０－０６
　
＊?
　赖草属 （Ｌｅｙｍｕｓ）在国内又称滨麦属，是禾本
科早熟禾亚科（Ｐｏａｃｅａｅ）小麦族，也称大麦族大麦亚
族多年生植物类群，全世界约有３０余种，分布于北
半球温寒地带，多数产于亚洲中部，少数分布于欧洲
和北美。中国区域有赖草属植物约２０种，２个变
种，划分为３个组，即多穗组、少穗组和单穗组，主要
分布于新疆、甘肃、宁夏、内蒙古、东北三省、四川、陕
西、河北、山西［１］。赖草（Ｌ．ｓｅｃａｌｉｎｕｓ）作为禾本科优
质牧草、生态草、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）等农作物
新品种选育的种质具有无性繁殖能力强、品质优良、
营养丰富、抗旱、抗寒、抗病虫害、适应性强等优良特
性［２－４］。本研究利用抑制性消减杂交技术研究赖草
干旱诱导下的基因表达差异，揭示赖草属植物的抗
旱分子机理，对加快我国抗逆新品种的开发，提高我
国干旱和半干旱地区的植被盖度、改良退化及沙化
草地、改善西部生态环境、促进我国干旱地区草地畜
牧业的发展具有重要意义。
１　材料与方法
１．１试验材料　赖草样品植株采自四川省西北部
高原沙地，地理位置３１°５１′Ｎ，１０１°５１′Ｅ，海拔约
３　５００ｍ，采集后的赖草培养于人工气候培养箱内，
模拟高原气侯特点并采用原产地的沙土进行培养。
选择生长旺盛的赖草植株并分成两份，一份正常生
长，一份进行干旱胁迫。在空气相对湿度保持在
４０％～６０％的情况下采用根际水分胁迫，连续胁迫
５ｄ后，迅速剪取处理和对照组赖草的叶片，蒸馏水
洗净后装入塑料袋中，并置于－７０℃保存备用。
１．２抑制性消减杂交
１．２．１叶片组织ＲＮＡ的提取　采用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公
司的Ｔｒｉｚｏｌ试剂分别抽提处理和对照组赖草叶片
组织的总ＲＮＡ。
称取赖草叶组织约０．６ｇ，将其剪碎后置于
－２０℃预冷的研钵中，倒入液氮并按１００ｍｇ／ｍＬ
的量加入６ｍＬＴｒｉｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ，研磨至粉状，于室温
下静置５ｍｉｎ待其完全融化，将液体移入１．５ｍＬ
ＥＰ管中，加入１／５Ｔｒｉｚｏｌ体积的氯仿，混匀，室温下
静置５ｍｉｎ，１２　０００ｒ／ｍｉｎ　４℃离心１０ｍｉｎ，将上清
液转移至新的ＥＰ管中，并加入与上清液等体积的
异丙醇，室温静置１０ｍｉｎ，１２　０００ｒ／ｍｉｎ　４℃离心１０
ｍｉｎ，弃上清液，向沉淀中加入１ｍＬ的７５％乙醇，混
匀，１２　０００ｒ／ｍｉｎ　４℃离心５ｍｉｎ，弃上清液保留沉
淀，干燥２～３ｍｉｎ，加入５０～１００μＬ　ＲＮＡ－Ｆｒｅｅ水
进行溶解。储存于－７０℃备用［５－６］。
１．２．２赖草叶组织ｃＤＮＡ的合成　采用ＳＭＡＲＴ－
＊ 收稿日期：２０１０－０９－１０　　接受日期：２０１０－１１－２０
基金项目：四川省科技厅应用基础研究项目（２００６－Ｊ１３－１３４）
作者简介：杨满业（１９６３－），男，四川梓潼人，副研究员，博士，
主要从事草地生态研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｍａｎｙｅ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
通信作者：王丽焕　Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｌｈ９６０７７６＠１６３．ｃｏｍ
０７／２０１１ 草　业　科　学 （第２８卷０７期）
ｃＤＮＡ合成技术合成赖草ｃＤＮＡ。所用ＳＭＡＲＴ试
剂盒购自ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ公司。按照试剂盒说明书操作。
１．２．３ 抑制性消减杂交　用 ＰＣＲ－Ｓｅｌｅｃｔ　ｃＤＮＡ
Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ公司）进行消减杂交。
取处理和对照组样品ｃＤＮＡ　２μｇ，分别用Ｒｓａ　Ｉ
酶进行消化。处理组作ｔｅｓｔｅｒ，对照组作ｄｒｉｖｅｒ。取适
量的ｔｅｓｔｅｒ，稀释后分成两份，分别与接头Ａｄａｐｔｏｒ　１
和Ａｄａｐｔｏｒ　２Ｒ连接，连接体积２０μＬ，１６℃连接４８ｈ。
Ａｄａｐｔｏｒ　１和Ａｄａｐｔｏｒ　２Ｒ与ｔｅｓｔｅｒ　ｃＤＮＡ（２００
ｎｇ／μＬ）连接产物分别取１．５μＬ，分别加入１．５μＬ
ｄｒｉｖｅｒ　ｃＤＮＡ（６００ｎｇ／μＬ）和１ｍＬ杂交缓冲液，加
入３０μＬ矿物油覆盖，进行第１轮杂交：９８℃变性
１．５ｍｉｎ，６８℃孵育８ｈ。混合两份杂交液，并加入
新鲜变性的１．５μＬ　ｄｒｉｖｅｒ　ｃＤＮＡ（６００ｎｇ／μＬ）和１
μＬ杂交缓冲液，进行第２轮杂交：６８℃反应１２ｈ，
将溶液稀释于２００μＬ稀释缓冲液中，７２℃保温７
ｍｉｎ，－２０℃保存。
１．２．４巢式ＰＣＲ扩增消减杂交产物
第１轮抑制性ＰＣＲ：１μＬ两轮杂交后得到的
ｃＤＮＡ作为模板，加入２μＬ　ＳＳＨ　ＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒ，４μＬ
ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ，４μＬ　ＭｇＣｌ２，５μＬ　１０×ＥＸ　Ｔａｑ反应缓
冲液，０．５μＬ　ＥＸ　Ｔａｑ酶，３３．５μＬ无菌水，总体积
５０μＬ。反应参数：７５℃６ｍｉｎ；（９４℃４０ｓ；６８℃
４０ｓ；７２℃１．５ｍｉｎ）×２０循环。采用热启动，７５℃
预热１ｍｉｎ后加酶。
第２轮抑制性ＰＣＲ：上述产物取３μＬ，加去离
子水２７μＬ，稀释１０倍；取１μＬ稀释液作为第２次
ＰＣＲ反应模板；引物改为 Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒ　１和
Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　Ｐｒｉｍｅｒ　２Ｒ，其余成分同第１轮ＰＣＲ。
反应参数：（９４℃３０ｓ；６８℃３０ｓ；７２℃１．５ｍｉｎ）×
１５循环。２％琼脂糖凝胶电泳检测。
１．３消减文库的构建
１．３．１与ＰＭＤ１８－Ｔ载体连接，筛选阳性克隆　将第
２次抑制性ＰＣＲ扩增产物直接连接到ＰＭＤ１８－Ｔ载
体中。连接产物转化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９感受态细胞。
３７℃培养过夜，菌落ＰＣＲ筛选阳性克隆，并保藏菌
种。以Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　１和Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍ－
ｅｒ　２Ｒ为引物，用ＰＣＲ法检测阳性克隆，反应体系
７０μＬ，ＰＣＲ反应程序：９６℃４ｍｉｎ；（９４℃３０ｓ；６８
℃３０ｓ；７２℃１．５ｍｉｎ）×３２循环，８℃保存。取
ＰＣＲ反应产物５μＬ，０．８％琼脂糖凝胶电泳检测。
１．３．２斑点杂交筛选差异克隆　依据 Ｒｏｃｈｅ公司
ＤＩＧ　Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－
Ｓｔａｒｔｅｒ　Ｋｉｔ　ＩＩ的使用说明，以约１μＬ的ＤＮＡ量标
记，共标记２个探针：以干旱诱导样品的第１轮抑制
性ＰＣＲ产物作模板标记ＤＮＡ探针；以对照样品的
第１轮抑制性ＰＣＲ产物作模板标记 ＤＮＡ 探针。
将两张同样大小的尼龙膜在 ｄｄＨ２Ｏ 中浸润 １０
ｍｉｎ，再在１０×ＳＳＣ中浸润１０ｍｉｎ，滤纸上自然晾
干。取２μＬ　１．３．１中制备的菌落ＰＣＲ产物与２μＬ
０．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ混匀，在预处理的２张尼龙膜上
各点２μＬ混合液，６０℃烘干，至少１０ｍｉｎ，取出放
入紫外交联仪中交联３０ｓ。将固定有ＤＮＡ的尼龙
膜置于预杂交液中，于３７℃杂交箱中预杂交３０
ｍｉｎ。将地高辛标记的两种ＤＮＡ探针于１００℃变
性５ｍｉｎ，立即置于冰上，微离心，分别加入到杂交
管中（终浓度５０ｎｇ／ｍＬ），于３７℃杂交箱中继续杂
交１６ｈ。取出尼龙膜用２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ于室温
洗膜２次，每次５ｍｉｎ；用预热至６５～６８℃的０．５×
ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ于５５℃洗膜２次，每次１５ｍｉｎ；最
后以２×ＳＳＣ于室温洗膜２次，每次５ｍｉｎ，以去除
残留的ＳＤＳ。将尼龙膜放入平板，用２０ｍＬ　ｍａｌｅｉｃ
ａｃｉｄ　ｂｕｆｆｅｒ完全浸泡２ｍｉｎ（１５～２５℃）再浸入１×
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ中孵育３０ｍｉｎ。再浸入１×Ａｎｔｉ－
ｂｏｄｙ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ继续孵育２０ｍｉｎ。将膜放入 Ｗａｓｈ－
ｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ静置平衡２～５ｍｉｎ。再将膜置于显色液
中１ｍｉｎ。暗室中显色１０～１６ｈ。次日观测结果。
１．４差异表达ｃＤＮＡ克隆序列的测定和分析
　对斑点杂交阳性结果进行测序（北京三博远志），
将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中的序列比较，序列分析用
ＤＮＡＭＡＮ软件。
２　结果
２．１总ＲＮＡ的电泳检测　提取的赖草叶组织
ＲＮＡ，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像
系统下紫外照相。结果发现，２８Ｓ、１８Ｓ条带清晰可
见（图１）。经核酸蛋白浓度测定仪测定，对照赖草
叶组织总 ＲＮＡ的 Ａ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ＝２．２９；干旱诱导赖
草叶组织总ＲＮＡ的Ａ２６０ｎｍ／２８０ｎｍ＝２．１９。以上结果
表明，所提取的ＲＮＡ可以满足试验要求。
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图１　赖草叶组织总ＲＮＡ的
电泳图谱
　注：１和２分别为对照和干旱胁迫后赖草叶组织总ＲＮＡ。
２．２　ｃＤＮＡ的合成、酶切　 合成的赖草ｃＤＮＡ
经琼脂糖凝胶电泳检测（图２），整个条带呈弥散分
布，分布范围为１　０００～３　０００ｂｐ，表明可以进行下
面的试验。将经过Ｒｓａ　Ｉ酶切的ｃＤＮＡ条带与未进
行酶切的条带比较发现，干旱诱导组和对照组酶切
后的ｃＤＮＡ条带均下移（图３），片段变小，说明酶切
效果良好可以满足下面的试验要求。
图２　赖草叶组织ｃＤＮＡ电泳图谱
　注：１，２为对照赖草叶组织ｃＤＮＡ；３，４为干旱胁迫后赖草
叶组织ｃＤＮＡ；Ｍ为 Ｍａｒｋｅｒ。
２．３抑制性消减杂交　消减杂交后经两轮ＰＣＲ
富集（图４），可以看出，经两轮ＰＣＲ后差异表达的
ｃＤＮＡ得到了充分的富集。
２．４消减文库的构建　将ＳＳＨ方法得到的片段
与ＰＭＤ１８－Ｔ载体连接、转化，得到５７６个克隆。用
巢式ＰＣＲ引物进行菌落ＰＣＲ，检测阳性克隆。结
果得到４４０个ＰＣＲ片段（部分差异片段见图５），其
插入比率为７６．３９％，其中２５０ｂｐ及２５０ｂｐ以上片
图３　赖草叶组织ｃＤＮＡ及ＲｓａＩ
酶切后电泳图谱
　注：１和２分别为对照赖草叶组织ｃＤＮＡ和ｃＤＮＡ经Ｒｓａ
Ｉ酶切后；３和４分别为干旱胁迫后赖草叶组织ｃＤＮＡ和ｃＤ－
ＮＡ经Ｒｓａ　Ｉ酶切后；Ｍ为 Ｍａｒｋｅｒ。
图４　干旱诱导条件下的赖草
叶片消减产物
　注：１和２分别为ＳＳＨ　１轮和２轮ＰＣＲ产物；Ｍ为 Ｍａｒｋｅｒ。
图５　赖草干旱诱导后差异表达ｃＤＮＡ文库部分克隆的
菌落ＰＣＲ筛选电泳图谱
段总数为３０４个，插入率为５２．７８％，表明消减文库
构建比较成功。
２．５斑点杂交筛选差异表达克隆　将包含５７６
个克隆在内的赖草干旱诱导前后差异表达ｃＤＮＡ
２２３１
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文库进行斑点杂交，比较同一位置的点的颜色深浅，
按照试剂盒提供的方法确定差异表达片段。用对照
组探针和干旱处理组探针与文库杂交得到了５３９个
杂交斑点（图６）。
图６　部分的斑点杂交结果
２．６差异表达ｃＤＮＡ克隆的测序、Ｂｌａｓｔ对比
分析　从５３９个杂交斑点中选择２０个杂交信号强
弱差异明显的克隆进行测序，去除测序结果相同的
４个序列，将所测得的１６个 ＥＳＴ 序列均提交到
ＧｅｎＢａｎｋ 数 据 库 中，其 接 受 号 分 布 范 围 在
ＧＯ５８１２６５－ＧＯ５８１２８１（表１）。１６个ＥＳＴ序列与
ＧｅｎＢａｎｋ中的序列进行ＢＬＡＳＴ比对分析，结果发
现，有３个片段与其他植物干旱诱导条件下表达的
序列具有较高的同源性，主要是大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ
ｖｕｌｇａｒｅ）和小麦，同源性在９４％以上；１个片段与已
知抗旱基因的甜菜碱醛脱氢酶部分核酸序列（Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ登录号：ＡＢ１８３７１６）有较高同源性；１个片段
与植物热激蛋白 ＨＳＰ７０的核酸序列（ＧｅｎＢａｎｋ登
录号：Ｘ６７７１１．２）具有较高同源性，达８６．６７％；３个
片段与植物光合作用的关键酶１，５－二磷酸核酮糖
羧化酶的部分氨基酸序列 （ＧｅｎＢａｎｋ 登录号：
ＡＡＡ６２７０３）具有较高的同源性，达９５％；１个片段
与植物遍在蛋白缀合酶的部分氨基酸序列（Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ登录号：ＡＣＧ４１７２０）具有较高的同源性，同源
性达９９．５％；１个与植物５０Ｓ核糖体蛋白Ｌ２０基因
片段（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：Ｑ６Ｌ３７８．２）有较高的同源
性，达９０％；３个为赖草属内羊草（Ｌ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）ｃＤ－
ＮＡ文库中所包含的基因片段；还有３个基因片段
与其他植物如水稻（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、小麦和拟鹅观
草属（Ｐｓｅｕｄｏｒｏｅｇｎｅｒｉａ）的基因有较高的同源性。
２．７部分差异表达基因片段的序列分析　将
Ｔ１－４Ｇ２序列在 ＮＣＢＩ中进行 ＢＬＡＳＴ－Ｎ 比对发
现，该序列共１２６ｂｐ，与属内另一个种———羊草的
甜菜碱醛脱氢酶（ＢＡＤＨ）基因 ＬｃＢＡＤＨ２（Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ登录号：ＡＢ１８３７１６）的部分序列同源性较高，
利用 ＤＮＡＭＡＮ 软 件 进 行 分 析，相 似 性 达 到
９０．４８％。
Ｔ１－１Ｆ８序列在 ＮＣＢＩ中进行ＢＬＡＳＴ－Ｘ比对
发现，该序列中有６６ｂｐ所编码的２２个ＡＡ与大麦
１，５－二磷酸核酮糖羧化酶（ＲｕｂｉｓＣＯ）基因（Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ登录号：ＡＡＡ６２７０３）的部分 ＡＡ序列的相似
性达到９５％（２１／２２）。
Ｔ１－３Ｄ５ 的反向互补序列在 ＮＣＢＩ中进行
ＢＬＡＳＴ－Ｘ比对发现，该序列中有６６ｂｐ所编码的
２２个ＡＡ与水稻遍在蛋白缀合酶（ＧｅｎＢａｎｋ登录
号：ＡＣＧ４１７２０）的部分 ＡＡ 序列的相似性达到
１００％（２２／２２）。
将Ｔ１－２Ｄ１１序列在 ＮＣＢＩ中进行ＢＬＡＳＴ－Ｎ
比对发现，该序列共１７３ｂｐ，与编码水稻ｈｓｐ７０蛋白
的基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：Ｘ６７７１１．２）的部分序列同
源性较高，利用 ＤＮＡＭＡＮ软件分析，相似性达到
８６．６７％。
３　讨论
Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ等［５］于１９９６年提出的抑制性消减
杂交技术，在比较同一类细胞在不同生理状态或不
同发育阶段的基因表达方面已得到广泛的应用，是
一项较为成熟的技术。该技术能选择性地扩增差异
表达的ｃＤＮＡ片段，在富集目的基因的同时抑制非
特异片段的扩增［７］。
　　本研究用抑制消减杂交与ＳＭＡＲＴ等技术构
建了包含５７６个克隆的赖草干旱诱导后差异表达
ｃＤＮＡ文库。将差异表达ｃＤＮＡ 克隆进行斑点杂
交，得到５３９个杂交斑点，通过对差异表达克隆的筛
３２３１
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．０７） ０７／２０１１
表１　赖草干旱诱导前后叶组织差异表达的ＥＳＴ
序
号 ｃＤＮＡ克隆 登记号 Ｂｌａｓｔ比较
长度
（ｂｐ）
同源性 ｅ－值
１ Ｔ１－１Ａ７ ＧＯ５８１２７４ Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ（ｊａｐｏｎｉｃａ　ｃｕｌｔｉｖａｒ－ｇｒｏｕｐ）（ＢＬＡＳＴ－Ｘ） ２３０　 ２１／５０（４２％） ５ｅ－０５
２ Ｔ１－１Ｂ５ ＧＯ５８１２７５
ＷＨＥ１７８３＿Ｂ０７＿Ｃ１３ＺＴ　Ｗｈｅａｔ　ｐｒｅ－ａｎｔｈｅｓｉｓ　ｓｐｉｋｅ　ｃＤ－
ＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ
ＷＨＥ１７８３＿Ｂ０７＿Ｃ１３（ＢＬＡＳＴ－Ｎ）
２００　 １２６／１６５（７６％） ７ｅ－２５
３ Ｔ１－１Ｆ８ ＧＯ５８１２７８
Ｒｉｂｕｌｏｓｅ　１，５－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ａｃｔｉｖａｓｅ［Ｈｏｒ－
ｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅ］（ＢＬＡＳＴ－Ｘ）
３０２　 ２１／２２（９５％） ０．００２
４ Ｔ１－１Ｇ１０ ＧＯ５８１２７９
ＢＧ０１０２４Ａ２Ｈ１１．ｒ１ＢＧ０１－ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｌｉｂｒａｒｙ　Ｌｅｙｍｕｓ
ｃｉｎｅｒｅｕｓ×Ｌｅｙｍｕｓ　ｔｒｉｔｉｃｏｉｄｅｓ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ．ＢＧ０１０２４Ａ２Ｈ１１．ｒ１
（ＢＬＡＳＴ－Ｎ）
１３３　 １１２／１２４（９０％） １ｅ－３８
５ Ｔ１－２Ｂ４ ＧＯ５８１２７１
ＷＨＥ６１９＿Ｃ１１＿Ｆ２１ＺＡ　Ｗｈｅａｔ　ＡＢＡ－ｔｒｅａｔｅｄ　ｅｍｂｒｙｏ
ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ．
ＷＨＥ６１９＿Ｃ１１＿Ｆ２１（ＢＬＡＳＴ－Ｎ）
２０７　 ８２／９５（８６％） ４ｅ－２２
６ Ｔ１－２Ｃ１２ ＧＯ５８１２７０
ＧＨ２１２０１１．１，ＨＶＳＭＥｂ０００４Ｈ２４ｆ２Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ
ｓｅｅｄｌｉｎｇ　ｓｈｏｏｔ （ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｓｔｒｅｓｓ）ｃＤＮＡ　ｌｉｂｒａｒｙ
ＨＶＳＭＥｂ（ＨＶｃＤＮＡ０００２）２Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｕｂ－
ｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ　ＨＶ＿Ｅａ００１０Ｎ１６ｒ，ｍＲＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ，（ＢＬＡＳＴ－Ｎ）
１７３　 １５７／１８９（８３％） １ｅ－４６
７ Ｔ１－２Ｄ２ ＧＯ５８１２８１
ｒｉｂｕｌｏｓｅ　１，５－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ａｃｔｉｖａｓｅ［Ｈｏｒ－
ｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　ｓｕｂｓｐ．Ｖｕｌｇａｒｅ］（ＢＬＡＳＴ－Ｘ）
１９３　 ２１／２２（９５％） ０．００５
８ Ｔ１－２Ｄ９ ＧＯ５８１２７３
ＢＧ０２００７Ａ２Ｆ０６．ｒ１ＢＧ０２－ｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｌｉ－
ｂｒａｒｉｅｓ． Ｐｓｅｕｄｏｒｏｅｇｎｅｒｉａ　ｓｐｉｃａｔａ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ．
ＢＧ０２００７Ａ２Ｆ０６．ｒ１（ＢＬＡＳＴ－Ｎ）
２２５　 ２０６／２３２（８８％） ６ｅ－７７
９ Ｔ１－２Ｄ１１ ＧＯ５８１２６８
Ｘ６７７１１，Ｏ．ｓａｔｉｖａ　ｈｓｐ７０ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ
７０，（ＢＬＡＳＴ－Ｎ）
１７３　 ９１／１０５（８６％） ５ｅ－２６
１０ Ｔ１－２Ｅ６ ＧＯ５８１２６７
Ｘ６７７１１，Ｏ．ｓａｔｉｖａ　ｈｓｐ７０ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ
７０，（ＢＬＡＳＴ－Ｎ）
１７３　 ９１／１０５（８６％） ８ｅ－２７
１１ Ｔ１－２Ｅ８ ＧＯ５８１２６５
ＢＧ０１０１８Ａ２Ｆ０２．ｆ１ＢＧ０１ －ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｌｉｂｒａｒｙ　Ｌｅｙｍｕｓ
ｃｉｎｅｒｅｕｓ　ｘ　Ｌｅｙｍｕｓ　ｔｒｉｔｉｃｏｉｄｅｓ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ
１２６　 １２２／１２６（９６％） ４ｅ－５１
１２ Ｔ１－２Ｆ９ ＧＯ５８１２６６
ＢＱ７６１３４４．１，ＥＢｒｏ０６＿ＳＱ００１＿Ｅ０５＿Ｒ　ｒｏｏｔ，３ｗｅｅｋ，
ｄｒｏｕｇｈｔ－ｓｔｒｅｓｓｅｄ，ｃｖ　Ｏｐｔｉｃ，ＥＢｒｏ０６Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ
ｓｕｂｓｐ．ｖｕｌｇａｒｅ　ｃＤＮＡ　ｃｌｏｎｅ　ＥＢｒｏ０６＿ＳＱ００１＿Ｅ０５　５′，
ｍＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，（ＢＬＡＳＴ－Ｎ）
２６８　 １８９／２１８（８６％） ５ｅ－６０
１３ Ｔ１－３Ａ６ ＧＯ５８１２７６
ｒｉｂｕｌｏｓｅ　ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ａｃｔｉｖａｓｅ　Ｂ［Ｔｒｉｔｉｃｕｍ
ａｅｓｔｉｖｕｍ］（ＢＬＡＳＴ－Ｘ）
１２９　 ３９／４２（９２％） １ｅ－１５
１４ Ｔ１－３Ｄ５ ＧＯ５８１２７７
ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　Ｅ２－１７ｋＤａ［Ｚｅａ　ｍａｙｓ］
（ＢＬＡＳＴ－Ｘ）
１３４　 ２２／２２（１００％） ２ｅ－０４
１５ Ｔ１－４Ｄ２ ＧＯ５８１２６９　 ５０Ｓｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ２０，ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ（ＢＬＡＳＴ－Ｘ） １１０　 ２５／２６（９６％） ２ｅ－０５
１６ Ｔ１－４Ｇ２ ＧＯ５８１２７２
Ｌｅｙｍｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ＬｃＢＡＤＨ２ｍＲＮＡ　ｆｏｒ　ｂｅｔａｉｎｅ　ａｌｄｅ－
ｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＢＬＡＳＴ－Ｎ）
１２６　 １１４／１２６（９０％） ２ｅ－４１
选、测序及序列比对，得到了３个与其他植物干旱诱
导条件下表达的序列具有较高的同源性的序列，１
个与已知抗旱基因的甜菜碱醛脱氢酶部分核酸序列
有较高同源性序列。赖草经过干旱胁迫后，出现了
与其他植物干旱胁迫后表达的类似基因［８－１１］，说明
本研究的诱导方法可靠。更重要的是获得了赖草中
甜菜碱醛脱氢酶的部分序列，而这个基因是目前广
泛研究的抗旱基因，所以这与预期研究结果吻合。
另外测出的序列中包括１，５－二磷酸核酮糖羧化／加
氧酶基因片段、遍在蛋白结合酶基因片段等都是植
物在遭受干旱胁迫后会差异表达的基因，这也说明
了植物在遭受干旱胁迫后发生的是一系列复杂的生
理生化变化，而不仅仅是单一的水分代谢方面的变
化［１２－１４］。
４２３１
０７／２０１１ 草　业　科　学 （第２８卷０７期）
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｒｏｏｔ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｗａｔｅｒ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｔｈｅ　ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ　ｃＤＮＡ　ｌｉ－
ｂｒａｒｙ　ｏｆ　Ｌｅｙｍｕｓ　ｓｅｃａｌｉｎｕｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　５７６ｃｌｏｎｅ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｎ
ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ　ａｓ　ａ　ｔｅｓｔｅｒ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｅａｖｅｓ　ｕｎｄｅｒ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｄｉ－
ｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ　ａｓ　ａ　ｄｒｉｖｅｒ．Ｔｈｅ　ｄｏｔ　ｂｌｏｔ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｄｉｓｃｏｖｅｒ　ｔｈｅ　１６
ＥＳＴ　ｗｉｔｈ　ｌｅｎｇｔｈ　１００－３１０ｂｐ．Ｔｈｅ　ｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ａｇａｉｎｓｔ　ＧｅｎＢａｎｋ　ｗｉｔｈ　ｂｌａｓｔ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｓｅ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ａｎｄ　ｂａｒｌｅｙ　ｕｎｄｅｒ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ，ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＬｃＢＡＤＨ２，ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｓｐ７０ｏｆ　Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ，ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＲｕｂｉｓＣＯ　ｏｆ　Ｈｏｒ－
ｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ，ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｏｆ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ，ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｌ２０ｏｆ　５０ＳＲｉｂｏｓｏｍａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｓｅ　ｋｎｏｗｎ　ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎｓ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇ　ｐｌａｎｔ　ｏｓｍｏｔｉｃ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ，ｈｅａｔ　ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ，ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｈｙ－
ｄｒｏｌｙｓｉｓ，ａｎｄ　ｈａｄ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｄｉｓｃｌｏｓｅ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｔｒｅｓｓ－ｒｅ－
ｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　Ｌｅｙｍｕｓ　ｓｅｃａｌｉｎｕｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌｅｙｍｕｓ　ｓｅｃａｌｉｎｕｓ；ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｄｒｏｕｇｈｔ　ｓｔｒｅｓｓ；ＥＳＴ
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