全 文 ：第 43 卷 第 2期
2 0 0 6年 2月
西北农林科技大学学报 ( 自然科学版 )
J
o u r
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o f N o r t h w e s t S e i
一
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e e h U n iv
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o f A g r i
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.
3 4 N o
.
2
F e b
.
2 0 0 6
多枝赖草谷眯甘肤还原酶基因的克隆及分析
史仁玖 ’ , 赵茂林 2 , 杨 清 “
(1 泰山医学院 生物化学与分子生物学 教研室 . 山东 泰安 , 27 1 0 0。 ;
2 北京农业生物技术研究中心 , 北京 1。。 0 89 ;
3 南京农业大学 生命科学学院 ,江苏 南 京 2 10 0 9 5)
〔摘 要 〕 以盐胁迫处理的多枝赖草 ( L ey m “ 、 m ul t ica ul i、 )植株新鲜 叶片为材料 , 根据其他植物谷胧甘肚还原
酶 ( G R )氨基 酸保守区序列设计简并引物 , 通 过 R T 一 P C R 扩增到 1 个 40 8 b p 的 。 D N A 片段 ( G en b a n k 注册号为
A Y 7 s l 7 s 6 ) ;利用 D N A M A N 软件将 5 `和 s ` R A C E 获得 的 s ` 和 3 `端序列 , 拼接成 l 个全长 1 5 5 0 b p 的 c D N A 序
列 ,其包含 1 个 1 140 b p 的开放 阅读框架 , 该阅读框架编码 3 80 个氨基酸 ; 多枝赖草谷胧甘肤还 原酶氨基酸序列与
其他植物的同源性为 7 % ~ 92 % ,定量 P C R 结果表明 , G R 基因的表达随着盐胁迫时间和盐浓度 的增加 而加强 。
〔关健词」 多枝赖草 ;谷胧甘肤还原酶 ;盐胁迫 ; G R 基因的表达
[中图分类号〕 Q 7 85 仁文献标识码 ] A [文章编号 ] 1 6 7 1一 9 3 5 7 ( 2 0 0 6 ) 0 2 一 0 0 6 1一 0 7
谷肤甘肤存在于大多数植物 中 , 是一种 由谷氨
酸 、 半胧氨酸和甘氨酸 3 种氨基酸组成的小肤 , 有还
原 型 和 氧 化 型 之 分 。 在 减 缓 和 清 除 由 活 性 氧
( R ( )S )
、 生物异源物质及重金属造成的环境氧化胁
迫 中 , 还原型谷胧甘肤 ( G S H ) 起重要作用 ,并且其
还可有效还原 一S 一S 键 、 稳定 一 S H 族蛋白和膜蛋 白结
构 、 保护酶结构蛋白上的琉基 、 抵抗过氧化作用 、 充
当 自 由基 的 清 除 剂 等 。 谷 胧 甘 肤 还 原 酶 ( G l u -
t a t h io n e R e d u e t a
s e , G R ; E C I
.
6
.
4
.
2 )是植物细胞抗
氧化酶系统中的一个关键酶 ,催化氧化型谷胧甘肤
( G S S G )还原生成还原型谷胧甘肤 ( G S H ) , 保持高
的 G S H / G S S G 比值 。 此外 , G R 还和超氧化物歧化
酶 (S ( ) D ) 、 过氧化氢酶 ( C A T ) 、 过氧化物酶 ( P ( ) D ) 、
还原型抗坏血酸过氧化物酶 ( A S P ) 、 谷胧甘肤过氧
化物酶 ( G P ) 等组成植物体内酶促活性 氧 自由基清
除系统川 。
多枝赖草 ( L卿m u : m u l t i c a u z i , ( K a r . e t K i r . ) )
是我国新疆特有 的一种重要优良牧草 , 近年又被开
发成优 良的草坪草资源 ,其一般分布于盐渍荒漠 ,具
有突出的耐干旱 、耐盐碱 、 耐黄矮病 、 耐蚜虫 、 耐疮薄
和耐污染等优异抗逆特性 。 这些特性均是 目前种植
的大多数农作物 、牧草与草坪草栽培品种缺乏且急
需改 良的特性 ,所 以应尽快分离克隆这些控制优异
抗逆特性 的功能基因 。到 目前为止 , 谷胧甘肤还原酶
e D N A 基因已从豌豆 ( P i s u m : a t i v u m L . ) 〔2 〕 、 拟南芥
( 八ar 占i己OP s i: t h a zi a n a ) [3 〕 、 大 豆 ( G ly e i n e m a x
L
.
)〔` 〕 、 水 稻 ( o 勺 z a 、 a t i v a I J . )〔5〕 、 芥 菜 (召ar s s i c a
z u n c e a I
J .
) 〔6 〕 、 烟草 ( N i c o t i a n a z a b a c u m L . ) [ , ] 、 蓝细
菌 ( A n a ba e n a s p . P C C 7 1 2 0 ) [8 〕 、 白 菜 ( B ar s s i c a
。 mP se itr 、户〕等生物中得到克隆和鉴定 , 但在多枝
赖草中还未见报道 。 本研究根据其他植物 G R 基因
的同源保守区设计简并引物 ,采用 R T 一 P C R 方法从
耐盐植物多枝赖草中克隆到 1个 G R 基因 c D N A 片
段 , 再次设计引物进行 5`和 3 ` R A C E P C R , 获得 G R
c D N A 全长序列 , 旨在为该基 因的功能验证和物种
改 良提供理论依据 。
材料与方法
1
.
1 材 料
多枝赖草根分孽芽在温室内用淘洗干净的蛙石
进行盆栽 , 1 2/ H oa g la n d 营养液浇灌 。 当长至两叶
一心时用含 N a CI (浓度每天提高 50 m m ol / L )的 1 2/
H oa gl an d 营养液进行盐处理 : 一部分材料用 含 0 ,
5 0
,
1 5 0 和 3 0 0 m m o l / L N a C I 的营养液处理 1 2 h ,另
2 0 0 5
一 0 6
一
13
国家自然科 学基金项 目 ( 3 0 3 70 90 5 ) ;北京市 自然科学基金项 目 ( 5 0 3 2 0 0 9 )
史仁玖 ( 19 70 一 ) ,男 , 山东阳谷人 , 博士 , 主要从事植物生物化学与分子生物学研究 。 E 一m ial : s h `r en jin @ 1 6 3 . co m
赵茂林 ( 19 6 5一 )谓 , 山西原平人 . 研究 员 ,博士生导师 , 主要从事小麦遗传育种及分子生物学研究 。
E
一
m a i l
:
Z h a o m a o li n Z o 0 0@ y a h o o
.
e o m
.
e n
杨 清 ( 1 9 5 9一 ) ,男 , 江苏淮安人 , 教授 ,博士生导师 , 主要从 事植物生物化学与分子生物学研究 。 E 一m ial : Q y an gl g@ nj au .
e d u
.
e n
西北农林科技大学学报( 自然科学版 )第4 3卷
一部分用 15 0m m l o/ L NaI C的营养液连续处理 。 ,
12
,
2 4 和 7 2 h ; 各处 理 均 以 不 含 N a C I 的 1 / 2
H o a g al n d 营养液浇灌为对照 ,分别取样液氮速冻后
贮存于一 70 C 超低温冰箱备用 。
1
.
2 方 法
1
.
2
.
1 总 R N A 的制备及反转录 采用 In v i t r o g e n
公司生产的 T ir oz l 和反转录试剂 ,提取总 R N A 时
参照试剂盒 说明书 , 稍有修改 , 向 T ir oz l 试剂中加
人体积分数 1%聚乙烯毗咯烷酮 ( P V P 40 ) ; 在提取
过程 中增加 2 次饱和酚 /抓仿 /异戊 醉 ( 体积 比为
25
:
24
: ” 抽提 。 反转录第一链的合成 ,按使用说明
书操作 。
1
.
2
.
2 引物设计和合成 与已报道仁2一叼的谷胧甘肤
还原酶氨基酸序列进行比较分析发现 , 该酶在不同
植 物 中 有 2 个 高度 保 守 序 列 : T P V A L M E 和
A E E F V T M
。 以编码保守区的核昔酸序列设计扩增
上下游引物 P , 和 P Z , 由于氨基酸对应密码子 的简
并性 , 所设计的引物为简并引物 。 P , 的序列为 5` -
A C N C C N G T N G C N ( C / T ) T N A T G G A
一
3`
,
P Z
的序列 为 5` 一C A T N G T N A C ( A / G ) A A ( C / T )
T C (C / T ) T C N G C
一
3
, , 均由上海生物工程公 司合
成 。
1
.
2
.
3 G R 基 因 。 D N A 片段的克隆和测序 以 多
枝赖草总 R N A 的反转 录产物为模板进行 P C R 扩
增 。 反应总体积为 2 0 川 J , 内含 l 倍反应缓冲液 , 1 . 5
mm o l / L M g C I
: , 0
.
2 m m o l / L d N T P s
,
3 产m o l / L P , ,
3 拌m o l / L P Z , 1 . 0 U aT q D N A 聚合酶 ,模板 。 D N A
I 户I J 。 反应条件为 : 9 4 C 预变性 4 m i n ; 9 4 C变性 l
m i n
,
5 5 C 1 m i n
,
7 2 C延伸 1 m i n , 3 5 个循环 ; 7 2 C
延伸 10 m in 。 P C R 产物经 15 9八 J 琼脂糖凝胶电泳
检查后 , 切下 目的条带 ,用 P C R 产物纯化试剂盒 回
收 D N A 。 回收的 P C R 产物与 p M D 1 8一T 载体连接 ,
转化 E . 。01 1 D H a5 , 测序 由北京农业生物技术研究
中心完成 。 将 D N A 序列及其对应的氨基酸序列与
G e n b a n k 中已有的相应序列进行 比较分析 , 同时用
D N A M A N 软件对结果进行比较分析 。
1
.
2
.
4 5 , R A C E 和 3 , R A C E 根据测序结果 ,设
计 5 ` R A C E ( r a p id a m p l i f ie a t i o n o f 。 D N A e n d )特
异下游引物 P 3 和 3` R A C E 特异上游引物 P ; 。 引物
P
3 序列 为 5` 一T G G G T G G T T G G G A G A A A A
C A G C A G C
一
3` ; P
; 序 列 为 5` 一 T C G G C G A T G
A A C C T A C C A A A C C A G A
一
3
` 。 按 S m a r t T M R a e e
e D N A A m p l i f ie a t i o n K i t 所提供的试剂和说明书要
求 ,取 1 拜L 总 R N A ,合成第 1 条 c D N A ; 并用其所
提供的扩增体系和 U n i v e r s a l P r im e r A M i x ( U PM )
进行 5’ R A C E 和 3 ` R A C E 末端的扩增 , 扩增的反
应条件为 9 4 C 3 0 5 , 7 2 C 3 m i n n , 5 个循环 ; 9 4 C
30 5
,
7 0 C 3 0 5
,
7 2 C 3 m i n
,
5 个循环 ; 9 4 C 30 5 ,
6 8 C 3 0 5
,
7 2 C 3 m i n
,
2 5 个循环 ; 7 2 C 7 m i n 。 对
扩增产物进行筛选 、鉴定和测序 , 测序由上海生物工
程技术服务公司和华大基因公司完成 。
1
.
2
.
5 表达产物检浏 用 T ir oz l 试剂盒分离不同
盐处理 的总 R N A , D N A 酶除去 D N A 杂质 。 测定
R N A 在 26 0 n m 紫外光下的吸光值 ,计算获得的各
种 R N A 浓度 , 以等量的总 R N A 为模板 ,分别进行
反转录 ,合成单链 e D N A ;用引物 P S 和 P 。 进行 P C R
扩增 以检测谷脱甘肤还原酶基 因表达产物 , 同时用
引物 P , 和 P : 扩增 A ct in 基因的表达产物作为内参 ,
用来校正单链 c D N A 模板的用量 。 R T 一P C R 程序
为 : 9 5 C 变性 3 m i n ; 9 4 C 3 0 5 , 5 4 C 3 0 5 , 7 2 C 3 0
s , 2 5 个循环 ; 7 2 C 1 0 m i n 。 取全部 P C R 产物进行
凝胶电泳 ,拍照 。 引物序列如下 :
P
、 为 5 , 一 A C C C C G G T T G C G T T A A T G G A 一 3 , ,
P
。 为 5` 一 C A T G G T C A CG A A C T C T T C T G C 一 3 ` ,
P
7 为 5` 一G G A A C T G G T A T G G T C A A G G C 一 3` ,
P
。 为 5` 一 A G T C T C A T G G A T A A C C G C A G 一 3 , 。
2 结果与分析
2
.
1 总 R N A 的质 , 检测
检 测 提 取的 总 R N A 质 量 可知 , 总 R N A 的
A 2 6。 / A
2 8。为 1 . 8 4 5 , A 2 6。 / A 2 3。为 2 . 0 9 1 。 一般认为纯
R N A 溶液的 A Z。。 / A 2 8。为 1 . 7~ 2 . 0 , A Z。 (、 / A 2 3。应大于
2
.
0
, 而 本研 究 中提 取 的总 R N A 的 A Z。汀A 28 。和
A 2 6。 / A ” 。均在此范围 , 表明采用此法得到的总 R N A
具有相当高的纯度 。
2 8 5 r RN A 一卜
1 8 5 t R N A 一」卜
5 5 t R N A es 卜
图 1 提取的总 R N A 电泳图
F ig
.
1 A g
a
or
s e e
l
e e t r o p h o r e s is o f t o t a l R N A
从图 1 可以看出 ,采用 T ir oz l 试剂快速提取法
提取 的总 R N A 有 3 条清晰 的电泳条 带 , 分 别是
2 8 5 r R N A
、
18 5 r R N A 和 5 5 r R N A , 其 中 2 8 5
第 2期 史仁玖等 :多枝赖草谷胧甘肤还原酶基因的克隆及分析
r R N A 条带的亮度为 18 5 r R N A 条带的 2倍 以上 ,
表明所提取的总 R N A 比较完整 ,符合试验要求 。
2
.
2 多枝赖草 G R 基因片段大小分析
以多枝赖草叶片总 R N A 逆转录的 。 D N A 为模
板 , 进 行 R T 一 P C R 扩 增 , 得 到 1 条 约 4 0 b p 的
。 D N A带 ,与预测片段大小基本一致 ( 图 2 ) 。
1 0 0 0 b P -争
7 5 0 b P es 知
5 0 0 b P 一卜
心- 4 0 8 b P
2 5 0 b P一卜
图 2 R T 一 PC R 扩增多枝赖草 G R 基因的电泳图
1
. 分子量标记 m ar k er ; 2 . 多枝赖草 G R 基 因 。 D N A
F ig
.
2 A g
a r o s e e
l
e e t r o p h
o r e s is o f
a
m p li
e a t io n
e D N A f r a g m e n t o f L勺m u s m u l t io a z t l i* G R
D I
J
2 0 0 0 m a r k e r ; 2
.
e D N A o f 乙。 , , , u s m u l t ; f u u l i s G R
P c R 产物纯化后 , T A 克隆到 p M D 1 8一 T 载体
上 , 经蓝 白斑筛选和菌斑 P C R 获得了阳性克隆 ,序
列测定结果表明 ,所扩增片段实际长 40 8 b p ,经 E x -
P A S y 在线程序推测其编码 1 36 个氨基酸 。 在 G e n -
b a n k 中与 G R 基因 的核昔酸及其编码氨基酸序列
对 比显示 ,所扩增多枝赖草 。 D N A 片段确实为 G R
基 因 片 段 , 并 在 G e n ba n k 中 登 录 , 注 册 号 为
A Y 78 1 7 8 6
。
2
.
3 总 R N A S` R A C E 与 3` R A C E
多枝赖草总 R N A 经 3 , R A C E P C R 扩增得到 1
条 8 0 0 b p 左右的片段 (图 3 ) 。 对该片段测序后可知 ,
其确切长度为 8 19 b p ,与 R T 一 P C R 扩增到的片段序
列重叠 了 3 62 b p , 其终止 子密 码是 T A A ( 二 ) , 在
P ol y ( A ) 的前面包含真核生物 m R N A 特有的加尾
信号 A A T A A A ( 图 4 ) , 3’ 端 是 p ol y ( A ) , 说 明 3 `
R A C E P C R 的产 物 就 是 G R 基 因 的 3 ,端 。 经 51
R A C E P C R 扩增后 得到 1 条 8 0 0 b p 左右 的片段
(图 3 ) ,测序后其确切长度为 79 5 b p 。
2 0 0 0 b P一补
2 0 0 0 b P
.一卜
1 0 0 0 b P一扣
7 5 0 b P es 扭
5 0 0 b P se 卜
礴一 7 9 5 b P 呀- 8 1 9 b P
2 5 0 b P一扮
5 0 0 b P se 争
2 5 0 b P一补
图 3 多枝赖草 G R 基因 5 , 和 3 , R A C E 的电泳 图
1
. 分子量标记 m a r k e r ; 2 . 5 , R A C E ; 3 . 分子量标记 m a r k e r ; 4 . 3 , R A C E
F i g
.
3 5
,
R A C E
a n d 3
尹
R A C E
o
f L即功 u s n : u l t i c a u l i s G R
1
.
D l 2 0 0 0 m a k e r ; 2
.
5 , R A C E o f L州矛n u s m u l z i c a ￡` 115 G R ;
3
.
D I 2 0 0 0 m a k e r ; 4
.
3 , R A C E o f L州切 以 ` 协 u l之i c a u l护5 G R
利用 D N A M A N 软件将 所得序列拼接成一个
c D N A 序列 ,结果如图 4 所示 。 由图 4 可知 ,多枝赖
草 G R 基因 。 D N A 全长 1 5 8 0 b p ,包含 l 个长 1 1 4 0
饰 的可阅读框 , 其编码 3 80 个氨基酸 , 起始于本序
列 3 4 b p , 终止于 1 1 7 4 b p ; 5`端非编码 区的长度为
3 3 b p
,
3`端非编码区的长度为 4 0 6 b p ;在 p o l y ( A )上
游 ” b p 处有典型的真核生物基因 p ol y ( A )的信号
序列 A A T A A A , 起始密码子 A T G 附近 的序 列为
5`
一
C A A A G C A T T G G
一
3`
,该序列与其他真核生物
中普 遍存在 的高效 转录起始 序列 5’ 一 C A / G N N A
T G G
一
3
’非常相似 。
多枝赖草的 G R 核昔酸和氨基酸序列与来 自不
同植物的 G R 基因相应序列 的同源性 比较 见表 1 。
由表 1 可知 , 多枝赖草 G R 与水稻的相似性最高 , 核
昔 酸序列 一致 性达 89 % , 氨 基 酸序列 一 致性 达
92 % ; 与玉米 的相似性也分别高达 85 %和 8 % ,
这说明在植物进化上它们之间有着较近的关系 , 可
推测其为 G R 基因家族新成员 。
6 4 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 43 卷
1
1
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7 0
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9 0
3 6 1
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4 2 1
1 3 0
4 8 1
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5 4 1
1 7 0
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2 1 0
7 2 1
2 3 0
7 8 1
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9 6 1
3 1 0
1 0 2 1
3 3 0
1 0 8 1
3 5 0
1 1 4 1
3 7 0
1 2 0 1
1 2 6 1
1 3 2 1
1 3 8 1
1 4 4 1
1 5 0 1
1 5 6 1
A T A T G A T A C T G A T C C A A A G CA T GA T T G G A G C A C T A T G A T A G C C A A C AA A A A T A C A G A G C T
M 1 A N K N T E L
G C G A C G C C T A G T T G G C A T T T A C A A A A A T A T T T T A A A C A A C G C A A A C G T C G A T C T A A T T G A
R R L V G 1 Y K N 1 L N N A N V D L I E
A G G C C G T G G A AA G G T G G T T G A T C C A C A T A C T G T T A G T G T G G A T G G C A A G C T C T A C A C T G C
G R G K V V D P H T V 5 V D G K L Y T A
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K N 1 L 1 A V G G R P 5 M P N 1 P G I E
G C A T G T T A T A G A T T C C G A T G C T G C A C T A G A T C T G C C T T C A A A A C C T G A G A A A A T T G C AA T
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·
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T 5 V D 5 1 W A V G D V T D R 1 N L T P
G G T T G C G T T A AT GG A AG GT G G GG C A T T T G C AA A A A C T T T A T T C G G C G A T G AA C C T A C C A A
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A C C A G A T T A C A G A G C T G T A C C A G C T G C T G T T T T C T C C C AA C C AC C C A T T G G GC A A GT T G G
P D Y R A V P A A V F 5 Q P P 1 G Q V G
C C T T A C T G A G G A G C A G G C T A T T G A A G A G T A T G G A G A宁 C T T G A T G T C T A C T丁A T C A A A C T T
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R P L R A T L 5 G L P D R V L M K L I V
G T G T G C T A C T A C G A A C A A A G T T G T A G G A G T G C A T A T G T G T G G T G A T G A T G C T C C T G A G A T
C A T T N K V V G V H M C G D D A P E l
A A T C C A G G G A AT T G C AA T T G GT G T T A A AG C C G G G T T A A C A A A G C A A G A T T T T G A T G C C A C
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T G T T G G C G T T C A C C C A A C A T C T G C A G A A G A G T T C G T G A C C A T G A G G A A T C C A A C T A G A A A
V G V H P T 5 A E E F V T H R N P T R K
A G T C C G A A G A A A A A C T G C G G C T G A G GT A G A G T C T A A G GA T G A G G T C G T C A C T CA G A A G T
V R R K T A A E V E S
*
A G A T A A T G C C G T T G A C C G T G T T G T A C A T A G A A G T C A T T C T C G A G G A T G C C A C T G G C C A A A
A C C T G A C T G G A A A T A C A C A G C T A A A C A G T G C A C C G T T G C C T G A G A A A T C T G T G A C A A T G A
A A C G C T G AA G A T T G T A T C A T A A C G A T G A G T G G C T G C C T C T G T T T T T T G C C C C T C C C A T T T
G C A C A T T T C T T T C C T G C T T G A G G C T T G A G C A C G C T G G T C G T T G A G T T T C T T T T C C C A T C T
G C T A T T C A T G T G勺 ’ G G T A C A A T G T G G T T G T G T G G G T G G GT A T C T C A A C C T G G A A
A C A T CG C T C C G G A A T A C T AG A A A A C C A GT G AA G A G T A T A T C T A G T A T T G AT C C A A A AA A A A
AA A AA A A AA A A A AA A A AA A A
图 4 多枝赖草的 G R核昔酸序列及其推导的氨基酸序列
F ig
.
4 N
u e l e o t id e s e q u e n e e a n d a m in o s e q u e n e e d e d u e e d fr o m G R o f 乙卿 n Z u s m u ir i` · a u l i s
2
.
4 推断的 G R 班白的功能及进化分析 合域中的 1个 N A D H 结合域 ; 2 5 ~ 3 64 氮基酸序
多枝赖草 谷胧甘肤还原酶 的分子量为 41 . 09 列是 毗吮二硫 酸核酸 氧化 还原酶 二聚 化结构域
k u
, 理论等电点 为 6 . 1 , 其包 含以下功 能结构域 : ( p y r id i n e n u e le o t i d e 一 d i s u lp h id e o x id o r e d u c t a s e ,
1 8~ 2 3 0 氨基酸序列是毗陡二硫酸核酸氧化还原酶 d im e r is a t i o n d o m a i n ) , 同样存在于 I 型和 I 型氧化
( P y r id i n e n u e l e o t id e
一
d is u lp h id e o x id o r e d u e t a s e ) 的 还原酶和 N A D H 氧化酶及过氧化酶 中 ; l ~ 3 6 4 氨
组分 ,它通常存在于 I 和 I 型氧化还原酶和 N A D H 基酸序列是丙酮酸 2/ 一草酞戊二酸脱氢酶复合体和
氧化酶及过氧化物酶中 , 是较大黄素蛋 白 ( F A D )结 二 氢硫辛酞胺脱氢 酶的组分 ( P yr u va t e/ 2一。 x o gl u -
第 2期 史仁玖等 :多枝赖草谷胧甘肤还原酶基因的克隆及分析
t a r a t e d e h y d r o g e n a s e e o m p l e x
,
d ih y d r o l i p o a m id e
d e h y d r o g e n a s e e o m p o n e n t ) ; 1 6 ~ 2 5 1 氨基酸序 flJ 是
N A D H 脱氢酶 ( N A D H d e h y d r o g e n a s e ) 的组 分 , 包
含 F A D 脱氢酶的 l 个亚基 。 这些功能保守区的存在
与谷胧甘肤还原酶的还原作用密切相关 。
衰 1 多枝翰草 G R 序列与其他植物 G R 序列的同派性比较
T
a
b l
e 1 C
o m p a r is o n o f L即m u s m u l t ic a u l i s G R s e q u e n e e w i t h t h e s e q u e n e e o f G R f r o m 0 1: h e r p l a n t s %
植物来源 核昔酸序列一致性 氨基酸序列一致性 基因登录号
S o u r e e N u e l e i e a e i d id
e n t i t y A m in o a e id id e n t i r y A e e e
s s i o n N o
.
水稻 口弓 z a sa r i v a 8 9 9 2 X M 一 47 0 2 7 1
玉米 Z e a , a 夕5 8 5 8 8 A J o o 6o 5 5
葡萄 V i t i , 二 i: lfe ar 8 1 8 1 A F 0 1 9 9 o 7
百 日草 Z i n n i a , l明。 n s 8 1 8 0 A B 1 5 8 5 1 4
烟草 N ic)t t i a , a t a ba ` u功 8 1 8 3 A F 4 4 3 ] 8 1
大豆 G ly c i n o m “ 二 8 0 7 7 I J l l 6 3 2
大豆 G ly f i n o m a 二 79 7 7 A F l o 5 1 9 9
芥菜 召ar , s l’a j “ n c二 78 8 1 A A K 2 7 15 7
从 G e n B a n k 上选取水稻 ( A A N o 6 8 5 5 . 1 ) 、 玉米
( C A A 0 6 8 3 5
.
1 )
、 拟 南 芥 ( A r a bi d oP s i s t h a l i a n a ,
巳A A 1 9 6 5 3 . 1 ) 、 烟 草 ( C A A 5 3 9 2 5 . l ) 、 葡 萄
( A A B 7 0 8 3 7
.
l )
、 芥 菜 ( A A K 2 7 1 5 7 . 1 ) 、 百 日 草
( B A D 2 7 3 9 4
.
l )
、 大豆 ( A A F 2 6 1 7 5 . l ) 、 豌豆 ( P i s u 。
s a 一i v u m , C A A 6 2 4 8 2 . 1 )和一粒小麦 ( 7 ’ r i t i e u m m 0 0 0 -
。 o c e u m , A A Q 6 4 6 3 2
.
1 ) 1 0 种不 同植 物 G R 蛋 白序
列 , 与本研究 中推断出的多枝赖草 G R 蛋白序列一
起进行进化上的分析 。 通过 D N A M A N 软件进行系
统进化分析 ,结果见图 5 。
.
0 0 5 . — 多枝赖草 L即 m u s m u z r ic a u z is— 玉米 eZ a 川 ay s水稻 O娜 a s a r i v a一 烟草 iN c o ri a n a t a b a e u m
葡萄 iy t i s v j n诉r a
一 芥菜 B r a s s i c a i u n c e a似阐介 A r a D ` a o P s . s r九 a ￡皿a 几 a
— 豌豆 P i s u m s a r i v u 从— 大豆 ` ly e i n 。 m a x— 百 日草 z i n n sa e l啥 a n s— 一粒小麦 rT i n c u m 用 o n o e o c c u m
图 5
F i g
.
5 P h y lo g e n e t ie
不同植物 G R 推导氨基酸序列的系统进化分析图
t r e e o f t h
e in f
e r r e
d
a m i n o a e id s e q u e n e e s o f G R i n d i f fe r e n t p la n t s
由图 5 可知 , 多枝赖草首先 与水稻 、 玉米 聚类 ,
在进化上亲缘关系较近 ;其次与烟草聚类 , 再与其他
双子叶植物类群聚合 , 基本符合按照形态特征进行
判定的系统进化关系 ;最后与一粒小麦聚合 ,与传统
的形态分类有较大差异 。 这可能反映了不同植物材
料适应逆境能力的差异 ,还有待今后深人研究 。
2
.
5 多枝赖草 G R 基因在逆境胁迫下的表达
定量 P C R 分析多枝赖草 G R 基因在对照 和胁
迫处理下的表达情况 , 产物量 的多少显示 G尺 基因
的表达水平 。
多枝赖草 G R 基因在逆境胁迫下的表达结果如
图 6 所示 。 由图 6 可 以看出 ,用 1 5 0 m m o l / L N a C I
对多枝赖草进行不同时间的胁迫处理表明 , 随时间
的增加 G R 基因表达逐渐加强 , 且处理 24 h 的表达
水平最高 。 由图 6 还可以看 出 ,随着盐胁迫浓度的增
加 , G R 基 因表 达 也 逐 渐 加 强 , 1 5 0 , 3 0 0 m m o l / I碑
西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 43 卷
N a CI处理时增加明显 。
图 6 不同盐胁迫下多枝赖草 GR 基因的表达
l ~ 4
.
1 5 0 m m o l / 1 N a CI胁迫的时间 : 1 . o h ; 2 . 1 2 h ; 3. 2 4 h ; 4 . 72 h ; 5 ~ 8. 用不同浓度 N a CI胁迫 一Z h : 5 . o m m o l / L
6
.
5 0 m m o l / l ; 7
.
1 5 0 m m o l /I
J
; 8
.
3 () 0 m m o l/ l
F i g
.
6 Di f f e r e n t e x p r e s s i o n 、 o f G lu t a t h i o n e R e d u e t a s e ( GR ) g e n e i n d u e e d b y N a C I s t r e s s e s
l一 4 . 1 5 () m m o l /1 N a CI t r e a r e d f o r d if fe r e n t l ti m e : l . o h` 2 . 1 2 h ; 3. 2 4 h ; 4 . 72 h ;5一 8 . di ff e r e n ta l e o n e e n t r a 之i o n
o f N a C I t r e a t e d 1 2 h
: 5
.
0 n飞m o l八 : 6 . 5 0 m m o l八 ; 7 . 1 5 0 m m o l /I ; 8 30 0 m m o l八
3 讨 论
分离纯净 、 完整 的 R N A 对于分子克隆试验是
很重要的 ,而且是进行基因表达分析的基础 ,极微量
的内源或外源 R N A 酶就会降解 R N A ,而且细胞水
溶性次生代谢物如多糖 、 多酚 , 在 R N A 提取过程中
易与 R N A 结合 , 形 成粘 稠难溶 的胶状 物而 导致
R N A 的大量损失 ,或与 R N A 形成褐色复合物导致
R N A 完 全 丧 失 生 物 活 性 。 本 研 究 添 加 鳌 合 剂
P V P 4 0 可防止酚类化合物氧化 ,有效的降低 了酚类
物质的影 响 ; 增加饱和酚 /氯仿 /异戊醇 (体积 比为
25
,
24
,
1) 抽提 2 次 ,则去除了多糖 ,减少了多糖的
干扰 ; 同时除蛋白较彻底 , 可以提高 R N A 的质量 。
环境胁迫作用于植物导致其损伤的一个重要原
因 ,可能是由于胁迫所产生活性氧的缘故 三` o 一川 。谷胧
甘肤还原酶在氧化胁迫反应中通过活性的升高对清
除活性氧起积极作用川 。 在用 N a CI 处理玉米幼苗
过程中 , G R 活性在处理初期上升 , 而在处理后期下
降〔` ,二。 B . c a m P e s t r i s 在 2 5 0 m m o l / L N a e l 处理下 ,
随着处理时间的增加 , 2 4 h 时的 G R 表达最强 ,然后
下降 ;采用 A B A l( m m ol / L )处理 , G R 表达先增加 ,
4 h 达到最高值 ,然后下降 ,但均较对照表达强川 ,这
与本研究 的结果一致 。 这 可能是因为逆境胁迫使
G R 活性发生变化 , 即在胁迫初期活性氧浓度增加 ,
抗氧化酶系统积极参与 , G R 活性增加 ,但随着胁迫
时间的延长 ,酶受到了逆境伤害 ,使 G R 活性在胁迫
后期迅速降低 。 多枝赖草谷胧甘肤还原酶在盐胁迫
下表达加强 ,说明其表达可能与渗透胁迫密切相关 ,
进一步的作用机理还需深人研究 。 除此以外 , G R 基
因的表达在高温 、 低温 、 A B A 、 H ZO Z 、 重金属 、 百草枯
灭草剂等的影响下也会发生改变际 ’ 3〕 。
到 目前 为止 , 一些植物的 G R 已被纯化鉴定 ,
G R 同工酶存在于不同的亚细胞器中 ,如叶绿体 、 细
胞质 、 线粒体和过氧化酶体〔 ’ ` 3 。 G R 。 D N A 和基因已
经在多种植物中得到克隆 , G R 基因可以分为两类 :
一类是编码叶绿体 /线粒体的 G R 基因 [’. ’ 5一旧 , 另一
类是编码细胞质的 G R 基因比 3 · ” 〕。 将本研究获得的
多枝赖草 G R 序列在 G e n b a n k 比较发现 , 其与水
稻 、 玉米 、 百 日草 、 葡萄 、 烟草大豆等的 G R 相应序列
具有较高同源性 (表 1 ) , 而这些植物的 G尺 序列均
为细胞质 G R 基因 , 因此推测所得 的多枝赖草 G R
序列可能是细胞质 G R 基因 。
至今已有些植物的 G R 基 因被克隆阁 ,并进一
步进行转化试验 。 1 9 9 6 年日本有关报告指出 ,把来
自大肠杆菌的谷胧甘肚还原酶基因导人杂种杨 , 己
培育出抗活性氧的转化体 L’ 8 ] ; R e b e e e a 等〔, , j将菜豆
细胞质 G尺 基因转人烟草 , G R 的总活性提高了 3 ~
7 倍 ; B a r r y 等 [ , o」将 G R 基因转人棉花 ,冷处理由 2 8
C降到 14 C ,转基因棉花的 G R 活性 比野生型棉花
高 3 0~ 4。 倍 ,这在一定程度上提高了植物抗活性氧
胁迫的能力 。 本研究获得盐胁迫处理下的多枝赖草
谷胧甘肤还原酶 ( G R )基 因的 c D N A 全长 , 为今后
该基因的筛选和功能验证 , 揭开 G R 的具体作用机
制 , 以及利用 G R 基因改 良小麦族乃至其他植物提
供了理论依据 。
〔参考文献习
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h t t p
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/ / w w w
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t a rw e e d
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P la n t C e l l P h y s i o l
, 1 9 9 8
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: 1 2 6 9
一
1 28 0
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P C C 7 12 0〔J〕. J B i o l C h e m , 1 9 95 , 2 7 0 : 2 2 8 8 2一 2 2 8 8 9 .
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5 15 〔J〕 . M o l C e l l s , 2 0 0 2 , 1 3 ( 2 ) : 2 4 5一 2 5 1 .
[ l o j H a s e g a w a p M
,
B r e
s s a n R A
,
Z h u J K
, e t a l
.
p l a n t e e l lu l a r a n d m o l e e u l a r r
e s p o n s e s t o h ig h s a l i n i t y [ j〕. A n n u R e v p l a n t p h y s i o l p l a n t
M
o l B i o l
,
2 0 0 0
.
5 1
: 4 6 3
一 4 99
.
[ 1 1〕 B o w le r C , S l o o t e n l , V a n d e n b r a n d e n S , e t a l . M a n四 n e s e s u p e r o x id e d i s m u t a s e e a n r e d u e e e e l l u l a r d a m a g e m e d i a t e d b y o x y g e n r a d i c a l s in
t r a n s g e n i e p la n t
s
[ J〕. E M B ( ) J , 19 9 1 . 1 0 : 1 7 2 3一 1 73 2 .
[ 12〕 G u o I H , e h e n s N , G o n g M . E ff e e t o f e a l i u m o n g lu t a t h io n e r e d u e t a s e o f m a i z e s e e d i n g [ J」. P l a n t P h y s i o l C o m m u n , 2 0 0 2 , 3 5 ( 2 ) : l x5 -
11 7
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[ 1 3〕 J o h n I F , M i e h a e l W P , K e n N , e t a l . In e r e a s e d g lu t a t h i o n e b i o s y n t h e s i s p l a y s a r o le i n n i e k e l t o l e r a n e e i n t h l a s p i n i e k e l h y p e r a e e u m u -
la t o r s [ J〕 . T h e P la n t C e l l , 2 0 0 4 , 1 6 : 2 1 7 6一 2 1 9 1 .
[ 24 〕 J im e n e z A , H e r n a n d e z J A , D e l R io , e t a l . E v id e n e e f o r t h e p r e s e n e e o f t h e a s e o r b a t e 一 g lu t a t h i o n e e y e l e i n m i t o e h o n d r ia a n d p e r o x i s o n e s o f
p e a l e a v e
s
[ J〕 . p l a n t P h y s i o l , 2 9 9 7 , 1 14 : 2 7 5一 2 5 4 .
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P h y s i o l
, 19 9 3 , 3 4 : 1 2 5 9
一 1 2 6 6
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〔17」 IJ e e H , J o J , s o n 0 . M o le e u la r c lo n in g a n d 。 h a r a e t e r i z a t i o n o f t h e g e n e e n e o d in g g lu t a t h i o n e r e d u e t a s e in 五ar s s i c a ,a 。 p e st lr’ [ J〕. Bi o e h i m
B i o p h y
s
A e l a
, 19 9 8
,
1 3 9 5
:
3 0 9
一
3 14
.
〔15 〕 C h a n g X D . C u r r e n t s t a t u s a n d p r o 、 p e e t o f f o r e s t g e n e t i e m a n i p u l a t i o n [ J〕 . S t u d y o n W o r ld F o r e s t , 1 9 9 7 , 4 : 8 0一 s 一2 .
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2 00 0
,
2 1 1
:
5 3 7
一
5 4 5
.
[ 20 〕 B a r r y A , L o g a , , , G a r y M , e t a l . T r a n s g e n i e o v e r p r o d u e 飞i o n o f g lu t a t h i o n e r e d u e t a s e d o e s n o t P r o 一e e t e o t t o n , G o s勺沪 i u , h i sr u t u m ( M a l -
v a e e a e )
,
f r o m p h o t o i n h ib i r i o n d u r i n g g r o w t h u n d e ; 。 h i l l i n g 。 o n d i t i o n s [ J〕. A m J 勘 t , 20 0 3 , 9 0 : 1 4 0 0一 1 4 0 3 .
C l o n i n g a n d a n a l y s is o f g l u t a t h i o n e r e d u e t a s e g e n e f r o m L 卿m u s m u l t i c a u l i s
S H I R e n
一
j i u
’ , Z H A O M a o
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l i n Z
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Y A N G Q i n g
3
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P a rt m刃: r of B i、 h e 脚 i 、 t勺 ,了,a i s ha n 肠d抢 a l C o le 苦。 , 7 ,a aI , , S h a n d’) n g 27 100 0 , Ch i o a ;
2 B o ij i
n g A g or
一
b i ot ec h n ltJ’) 舒 R es ea cr h 价 n t e r . eB ij i n g 10 00 8 9 .以 i n a ;
3 C
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c i e n c尸 , N a nl i n g Ag ir c u l t u ar l U n i : 。 sr 勿 , N a叮 i , g , ·j 山 n岁 u 2 100 95 ,以 i n a )
A b s t r a e t : A e e o r d i n g t o a m i n o a e i d s e q u e n e e f r o m g l u t a t h i o n e r e d u e t a s e i n o t h e r p l a n t s
, a p a i r o f d e g e n
-
e r a t e p r im e r s w e r e d e s i g n e d a n d a 4 0 8 b p ( G e n e b a n k A e e e s s i o n n u m b e r
:
A Y 7 8 1 7 8 6 ) e D N A f r a g m e n t w a s
o b t a i n e d b y R T
一
P C R f r o m L卿m u s m u l t i c a u l i s u n d e r s a l t s t r e s s , 5` e D N A e n d a n d 3` e D N A e n d w a s o b -
t a i n e d b y R A C E
.
T h e t o t a l e D N A o f g e n e w a s 1 5 8 0 b p i n l e n g t h
,
i n e l u d i n g a n o p e n r e a d i n g
, e n e o d i n g 3 8 0
a m i n o a e id s
.
I t s s e q u e n e e s s h a r e d h i g h s im il a r it y a t P o l y P e P t id e l e v e l w i t h t h e s e q u e n e e s f r o m t h e P l a n t s o f
O卿 z a s a t iv a , Z e a m卿 s , V i t i s v i n ife ar , Z i n n i a e l e邵 n s , N ic o t i a n a t a b a c u m , S o y b e a n a n d G ly c i n e m a x . R T -
P C R a n a l y s i s i n d i e a t e d t h a t t h e g e n e w a s u 。 一 r e g u l a t e d u n d e r s a l t s t r e s s e s
.
K e y w o r d s : L卿从 u s m u l t i c a u l i s ; g l u t a t h io n e r e d u e t a s e ; s a l t s t r e s s ; G R g e n e e x p r e s s io n