全 文 ：第 27卷　第 3期 西北农业大学学报 Vol. 27 No. 3
1999年 6月 Ac ta Univ . Ag ric. Bo reali-occidentalis Jun. 1999
大赖草和新麦草物种专化
DNA重复序列研究
Ⅰ . 分离和鉴定
柴守诚　刘大钧　陈佩度　齐莉莉　李万隆　曹明树
(南京农业大学农业部作物细胞遗传重点开放实验室 ,江苏南京 210095)
　　摘　要　从本研究建立的 Leymus racemosus ( Lam. ) T zvelev (大赖草 )和 Psathy-
rostachys juncea ( Fisch) Nev ski(新麦草 )的 DNA文库中分别挑出 550和 348个重组克隆提
取质粒 DNA,用普通小麦、 L . racemosus和 Psa. juncea等物种的总 DN A作探针 ,通过两轮点
渍杂交 ,发现有 15个克隆稳定地与 L . racemosus和 (或 )Psa. juncea有强杂交信号 ,与中国春
无或基本无杂交信号 ,初步认定这些克隆为物种专化 DN A重复序列克隆。 其中 5个又被选
取作交互杂交以测定彼此间的同源性 ,结果表明 , p Pj605与 pPj205有同源性 ,而 p Lr344,
pL r426和 pL r647相互间以及与 pPj205和 p Pj605之间均无序列同源性。
关键词　 大赖草 , 新麦草 ,小麦族 ,物种专化 DN A重复序列
分类号　 S512. 103. 2
真核生物核基因组区别于原核生物的一个显著标志是含有大量的 DNA重复序列 ,
高等植物尤其如此 ,小麦族植物更甚 [1 ]。 一些 DNA重复序列具有物种专化性 ,即仅在某
个或某些亲缘更近的物种中大量存在 ,而在其他亲缘更远的物种中很少甚至缺乏 [2 ]。物种
专化 DNA重复序列作为分子标记已被用于基因组进化研究 [3, 4 ]、栽培种中外源种质的检
测 [5～ 8 ]和体细胞原生质体隔合杂种的鉴定 [ 9 ]等方面。 小麦族的一些种属中也已分离到一
些物种专化 DNA重复序列 [2, 5, 6, 8 ] ,但赖草属中尚未见到报道。为此 ,本研究试图从大赖草
和赖草属的二倍体亲缘种 Psathyrostachys juncea中分离一些物种专化 DNA重复序列 ,
研究用其检测导入小麦的外源染色质的可能性 ,并用这些重复序列作为分子标记对赖草
属及小麦族其他有关种属的染色体组进化关系进行探讨。本文仅报道大赖草及新麦草物
种专化 DNA重复序列分离和鉴定的有关结果。
1　材料与方法
植物材料及 DNA提取　所用植物材料 Leymus racemousus ( 2n= 28, NX) , Psathy-
rostachys juncea ( 2n= 14, N) , Pseudoroegneria spicata ( 2n= 28, S) ,Critesion v iolaceum
( 2n= 14, H) , Haynaldia villosa ( 2n= 14, V ) , Thinopyrum bessarabicum-Trit icum aes-
t ivum 双 二 倍体 ( 2n = 56, ABDJ) , Trit icum aest ivum cv. Chinese spring ( 2n =
　　　　　　　　收稿日期　 1998-12-21
课题来源　高等学校博士点基金资助项目 , 970205
作者简介　柴守诚 ,男 , 1960年生 ,副教授 ,博士 ,现在西北农业大学农学系工作 ,陕西杨陵 712100
42, ABD)均为南京农大细胞遗传研究所保存。 植物 DNA的提取采用 Gill等 [ 10]描述的
CT AB法。
DNA克隆　大赖草和新麦草 DNA用 Sau 3AⅠ 酶切 ,载体质粒 pGEM-7Zf (+ )
DN A用 Bam HI酶切 ,然后用 T4连接酶将两者连接 ,转化大肠杆菌 JM103菌株 ,转化细
菌培养物接种至含氨苄青霉素、X-gal和 IPT G的 LB培养基上 , 37℃培养 14 h左右 ,挑取
白色菌落定格接种于含氨苄青霉素的 LB培养基上 , 37℃培养 8～ 12 h,置 4℃冰箱保存备
用。
质粒 DNA提取　参照 Sambrook等 [11 ]描述的碱裂法进行。
DNA探针标记　采用随机引物法标记试剂盒 ( Promega公司的 Prime-a-gene label-
ing system )在 30μL总体积下用α-32p-dCTP进行标记。
点渍杂交　将质粒 DNA浓度调整至 70 mg /L,作阳性对照的植物 DNA浓度调整至
10 mg /L. DN A样品经变性后每份取 5μL依次定格点于 Hybond N+ 膜 , 80℃烘烤 0. 5 h.
相同杂交膜依次与不同植物总 DNA探针杂交 ,杂交及洗膜按 Sharp等 [12 ]描述的方法进
行。
重复序列交互杂交　取 5个 DNA重复序列和空白载体质粒 pGEM-7Zf (+ ) DN A
各 10μg用 Sau 3AⅠ酶切以释放插入重组质粒的 DNA重复序列片段 , 2%琼脂糖凝胶电
泳后切除多余凝胶按碱转移法 [ 11]进行 Southern转移。依次用不同的 DNA重复序列作探
针进行 Souther n杂交。杂交程序与 Sharp等 [12 ]所述相似 ,但在预杂交时每毫升预杂交液
中另加入 0. 1 mg的空白载体质粒 DNA作封闭 DNA.
2　结果与讨论
2. 1　通过点渍杂交筛选重复序列克隆
　　从 L . racemosus DNA文库中取出 550个菌落提取质粒 DNA,经点渍吸印后分别用
L . racemosus , Psa. juncea和普通小麦中国春总 DNA作探针进行点渍杂交。对照 3次杂交
结果 ,初步选出与 L . racemosus和 Psa. juncea有强弱程度不同的杂交信号而与中国春无
或基本无杂交信号的 26个阳性克隆。
从 Psa. juncea文库中挑取出 348个重组质粒提取 DNA,用 Psa. juncea和中国春总
DNA作探针进行点渍杂交 ,差异筛选 ,筛选到 13个与 Psa. juncea有强或较强杂交信号 ,
而与中国春无或基本无杂交信号的克隆。
为求可靠 ,将第一轮点渍杂交筛选到的 39个克隆再转接平板 ,并提取 DNA,经逐一
定量后进行第二轮点渍杂交筛选 ,筛选时除继续用上述 3种植物的总 DNA作探针外 ,还
选用了 Pse. spicata ( S) , C. v iolaceum ( H) , H. vi llosa ( V )和普通小麦-Th. bessarabicum
的双二倍体 ( ABDJ)的 DNA作探针。增加 DNA探针种类旨在明确所选得的重复序列克
隆同时满足下列用途的可能性: ①用于检测导入小麦的 Leymus属、 Psathyrostchys属和
其他种属的染色质 ;②用于研究 Leymus属及其他属的染色体组进化。
39个克隆与不同物种植物总 DNA探针点渍杂交的结果如图 1.参照两轮点渍杂交
结果 ,发现 31个克隆在两轮点渍杂交中与 L . racemosus和 Psa. juncea有或强或弱的杂交
信号 ,而与中国春无或基本无杂交信号。其中 15个为强阳性克隆 (图 1中的序号为 6, 8,
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9, 12, 13, 15, 19, 26, 27, 28, 31, 32, 36, 38, 39)。
图 1　 DNA重复序列重组质粒与不同物种
总 DN A探针的点渍杂交
图 3　 DNA重复序列相互杂交
测定同源性
1～ 26克隆自大赖草 ; 27～ 39克隆自新麦草 ; 40为空白对照质粒 ,作阴性对照 ; 41～ 44为植物 DN A,作阳性对照 ,
依次为 T . aestivum ( ABD) ,L . racemosus ( NX) , Psa. juncea ( N)和 Th .bessarabicum -T . aestivum ( ABDJ) ;
→依次示 pLr344, pLr426, pLr647, pPj205和 pPj605
综合考虑本研究目的、各供选阳性克隆与不同物种点渍杂交的特点及试验所能承受
的规模 ,确定对其中 5个克隆 ( pLr 344, pLr426和 pLr647选自大赖草文库 , p Pj205和
pPj605选自新麦草文库 )作进一步研究。这 5个克隆中 pLr 344(序号为 12)的特点是在两
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轮点渍杂交中都同时与 L . racemosus和 Psa. juncea有很强的杂交信号。 pLr647(序号为
26)的主要特点是专化性强 ,两轮杂交中都与中国春无杂交信号 ,而与 L . racemosus有强
杂交信号 ,与 Psa. juncea也有较强杂交信号。选这两个重复序列试图检测 Leymus属和
Psathyrostochys属的染色质。
p Lr426, p Pj205和 pPj605(序号分别是 15, 28, 36)有某些共同的特点。 它们除与 L .
racemosus ( NX)和 Psa. juncea( N )有强杂交信号外 ,还与普通小麦 Th .bessarabicum的双
二倍体 ( ABDJ)、 Pse. spicata ( S)、C. violaceum ( H)都有强度不同的杂交信号。选取这 3个
克隆有双重目的 ,既期望这几个重复序列能作为上述几个种属有关染色体组的共同分子
标记 ,检测其导入小麦后的踪迹 ,又试图用其研究小麦族有关种属的染色体组进化。
图 2　 5个重复序列 PCR扩增产物
2. 2　 5个 DNA重复序列间同源性研究
重复序列在核基因组中的拷贝数很多 ,
因此克隆到的重复序列彼此间有可能重复。
为此 ,首先对 5个 DNA重复序列进行了
PCR扩增 ,从扩增产物的电泳结果 (图 2)看 ,
它们之间的分子量不完全相同 ,这至少排除
了它们之间完全重复的可能性。但分子量的
不同并不能排除它们之间有部分片段同源的
可能性。而同源性测定最简便有效的办法便
是交互杂交。由交互杂交的结果 (图 3)可见 ,
用 pLr344, pLr426和 pLr 647作探针时它们
分别只与自身有特征性杂交带 ,而与其他几
个重复序列克隆的杂交带相同于与空白载体
质粒的杂交带 ,说明这 3个重复序列相互间及与另外两个重复序列 ( pPj205和 p Pj605)间
均无序列的同源性。比较以 p Pj205和 p Pj605为探针的杂交带型 (图 3)不难看出 ,两者间
有同源性。
参 考 文 献
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A Study on Species-Specific DN A Repeats from
Leymus racemosus and Psathyrostachys juncea
Ⅰ Isola tion and Identi fication
Chai Shoucheng　 Liu Dajun　 Chen Peidu　Qi Lili　 Li Wanlong　Cao Mingshu
( Key Laboratory of Crop Cytogenet ics of Minist ry of Ag ricu lture,
N anj ing Agr icul tural Un iversity, Nanj in g 210095)
Abstract　 550 and 348 recombinant clones w ere picked out f rom L . racemosus and
Psa. juncea libraries and pla smid DN A was isolated f rom each of them. The dot blots of
recombinant plasmid DN A were hybridized w ith the　 32 P labelled to tal DN A of Triticum
aestivum , L . racemosus , Psa. juncea and o ther 4 species o f Triticea. 15 recombinant plas-
mids gave st rong hybridiza tion signals wi th DN A of L . racemosus and Psa. juncea but no
o r almost no hybridization signals wi th that o f T . aestivum , w hich indicated that they
could contain species-speci fic DN A repeats. Fiv e of them were cho sen fo r further cha rac-
terization. pLr 344, pLr426 and pLr647 were cloned from L . racemosus whi le p Pj205 and
pPj605 from Psa. juncea. Cro ss-hybridization of the 5 DN A repeats indicated tha t pPj605
show ed homology to pPj205. How ever, pLr344, p Lr426 and pLr647 did no t show homo l-
ogy, if any, to others.
Key words　 Leymus racemosus , Psathyrostachys juncea, T ri ticeae, species-speci fic
repea ted DN A sequence
37第 3期 柴守诚等:大赖草和新麦草物种专化 DNA重复序列研究 Ⅰ