全 文 ：　[ 收稿日期] 　2011-03-17;2011-04-13修回
　[ 基金项目] 　国家林业局 948项目“铁线莲优良品种与繁育技术引进”(2008-4-11);云南省教育厅科研基金项目“两个铁线莲品种的引种与
快速繁殖研究”(09Y0308);西南林业大学面上科研基金项目“观赏铁线莲品种组织培养中褐变问题的研究”(2009M 28)
　[ 作者简介] 　吴　荣(1980-),女 ,讲师 ,硕士 ,从事园林植物与观赏园艺植物研究。 E-mail:bassie.rong@gmail.com
　＊通讯作者:樊国盛(1963-),男 ,教授 ,博士 ,从事园林植物研究。 E-m ail:274955551@qq.com
　　　　　　　林　萍(1958-),女 ,教授 ,学士 ,从事园林植物与观赏园艺植物研究。 E-mail:LP2418@sw fu.edu.cn
[ 文章编号] 1001-3601(2011)05-0283-032-02
铁线莲品种Warszawska Nike的愈伤组织及不定芽诱导
吴 荣 , 樊国盛＊ , 林 萍＊ , 王 锦 , 李宗艳 , 陈泽英
(西南林业大学 园林学院 , 云南 昆明 650224)
　　[摘　要] 为加快引种铁线莲工厂化生产 ,以铁线莲品种 Warszaw ska Nike 的顶芽 、茎节和茎段为外植
体 ,在 MS 基本培养基中添加 0 、1.0 、2.0mg/L 6-BA 和0 、0.01 、0.05mg/L N AA ,对其进行初代诱导和继代增殖培养。结果表明:最适诱导培养基为 MS+1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA ,诱导率可达 81%;增殖
培养基为 MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA ,增殖倍数达 2.72 。[关键词] 铁线莲;Warszaw ska Nike;愈伤组织;不定芽;组织培养[中图分类号] S687.3 [文献标识码] A
Induction of Callus and Adventit ions Buds of a Clematis
Variety Warszawska Nike
WU Rong , FAN G uo-sheng ＊ , LIN Ping＊ , WANG Jin , LI Zong-yan , CHEN Ze-ying
(Faculty of Landscape Architecture , Southwest Forestry Universit y , Kunming , Yunnan 650224 , China)
　　Abstract:In o rder to accelerate the indust rialized production of Warszaw ska Nike , a Clemat is va riety ,
the expe riment took terminal bud and stem as explants , which w as cul tured on the M S nutrient medium
added w ith 6-BA (0mg/ L , 1.0mg/L and 2.0mg/ L)and N AA(0mg/ L , 0.01mg/L and 0.05mg/ L)
respect ively to select the best tissue culture medium through the induction of early generat ion and the
mul tiplication t raining of following generation.The resul ts show ed that the best induced medium was
M S+6-BA 1.0mg/L +NAA 0.05mg/ L , the induction rate w as 81%, multiplied medium was MS+6-BA
2.0mg/ L+NAA 0.05mg/L , and the proliferat ion t imes w as up to 2.72.
Key words:Clematis;Warszaw ska Nike;callus;adventitio ns bud;tissue culture
　　毛茛科铁线莲属(Clemat is)植物是世界著名的
观赏植物 ,为多年生木质藤本 ,花朵艳丽 ,花型多 ,栽
培品种丰富且花期长 ,观赏性强 ,有“攀援植物皇后”
的美称 ,不仅应用于园林领域 ,还有较高的药用价
值 ,国内外对其研究较早。国内的研究虽多 ,但大部
分是对国内铁线莲属一些资源的分布或药用价值的
研究[ 1-7] ,对于从国外引进的铁线莲的繁殖及其在园
林上的应用研究较少。
目前我国铁线莲主要以扦插繁殖为主 ,但因母
穗量少 、繁殖系数低 、繁殖速度慢 ,且受价格限制 ,国
外引种的也不适宜大量扦插 ,阻滞了新品种的快速
繁殖和大面积推广应用。近年来 ,在铁线莲属植物
的组织培养方面国内外学者也进行了一些研究 ,主
要集中在我国原产或本地品种方面[ 8-11] ,仅有张启
香等对国外引种的栽培品种 Multi-Blue 进行了不
定芽及体细胞胚发生的初步研究[ 12] ;Mandegara 和
Sieber以 C.integri f olia×C.v it icel la 的节间进行
培养 ,获得了体细胞胚 ,但周期长达 18个月[ 13] ;Le-
ifer t等使用 1/2MS 培养基对 C.montana`Rubens
进行培养 ,获得了丛生芽[ 14] 。
研究以铁线莲品种 Warszaw ska Nike为材料 ,
对 6-BA 和 NAA 不同浓度配比的效果进行分析比
较 ,以确定铁线莲品种 Warszaw ska Nike 组织培养
中初代和继代的最佳配方 ,为加快引种铁线莲工厂
化生产提供参考 ,进而推进在城市园林绿化中的推
广和应用 。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以引自欧洲 3年生铁线莲栽培品种 Warszaw-
ska Nike 当年生枝条的顶芽 、茎节和茎段为外植体。
1.2 试验方法
剪取当年生嫩茎 10 cm 左右 ,用自来水冲去表
面尘垢后 ,去除所有叶片 ,只留叶柄基部 0.5 cm 左
右 ,用洗衣粉水浸泡 30min 后用自来水冲洗 ,并经
流水漂洗 1 h以上 。在无菌操作台上用 0.1%升汞
浸泡消毒 3min ,用无菌水冲洗 3 ～ 5 遍后切成 1cm
左右小段 ,接种于培养基上进行培养。
1.3 培养基及培养条件
分别将Warszaw skaNike的顶芽 、茎节 、茎段
　贵州农业科学　2011 , 39(5):32～ 33　Guizhou Ag ricultural Sciences
表 1 试验材料所接种的培养基配方
Table 1　The formula of medium used in the test
处理
T reatment
6-BA/
(mg/ L)
NAA/
(mg/ L)
1(CK) 0 0
2 1.0 0.01
3 1.0 0.05
4 2.0 0.01
5 2.0 0.05
接种到添加了不同浓度 6-BA(0 , 1.0 , 2.0mg/ L)和
NAA(0 ,0.01 ,0.05mg/L)的 MS 培养基中(表 1),
并附加 0.3%蔗糖和 0.6%卡拉胶 ,pH 5.8。培养室
温度为(25±2)℃,光照时间为 12 h/d ,光照强度为
1 500 ～ 2000 lx 。
2 结果与分析
2.1 不同激素配比对外植体诱导的影响
铁线莲品种 Warszaw ska Nike 外植体接种 5d
后 ,切口处逐渐呈现局部膨大 ,同时开始出现丛生芽
的启动生长 , 6 d后形成幼叶 , 10 d 后丛生芽生长迅
速且健壮 ,部分茎节和茎段基部形成黄色至黄绿色
颗粒状愈伤组织 , 15 d后丛生芽长出 3个茎节 ,愈伤
组织继续膨大 , 20 d后丛生芽不再伸长生长而进行
增粗生长。从第 30 天统计的全部诱导率及生长状
况(表 2)看出 ,将外植体接种在没有添加任何激素
的培养基上培养 30 d ,诱导率仅为 33%,远低于其
他 4组添加了激素的培养基 ,说明激素对Warszaw-
ska Nike 的诱导有促进作用。当 6-BA 浓度不变
时 ,随着 NAA 浓度的提高 ,诱导率也随之提高;当
NAA浓度为 0.01mg/ L 时 , 随着 6-BA 浓度的提
高 ,诱导率增大 ,但当 NAA 浓度为 0.05mg/ L 时 ,
诱导率随 6-BA 浓度升高而降低。当细胞分裂素和
生长素比值低时不仅能形成侧芽 ,还能形成较多的
愈伤组织;比值高时形成的侧芽较多 ,愈伤较少;若
比值介于两者之间只形成侧芽而且量多 。表明 ,可
以通过激素浓度配比来控制所形成的诱导类型。在
5个处理中 ,以处理 3的诱导效果最好 ,不仅形成的
侧芽和愈伤组织量多 ,诱导率达 81%,而且形成的
愈伤组织为疏松型 ,有利于进一步分化诱导形成完
整植株。
2.2 不同激素配比对丛生芽增殖的影响
将初代培养 20 d后各培养基中的无菌材料转
接到与初代培养基一一对应的继代培养基中进一步
培养 。6 d后开始出现新芽萌动 , 12 d时长出幼叶 ,
15 d后增殖效果无明显变化 ,新生嫩叶开始有变黄
趋势 ,部分叶片出现黑色斑点 ,各处理均无愈伤组织
产生 。从第 30 天统计的增殖倍数和生长表现(表
3)看出 ,增殖倍数随着 6-BA 与 NAA 比值的增高呈
先上升后下降的趋势 ,说明对丛生芽的增殖而言 ,两
者之间的比值并非越高越好 ,两者比值合适时才能
达到最大增殖倍数。5个处理的增殖倍数依次是处
理 2>处理 5>处理 4>处理 1>处理 3 。从生长表
现看 ,处理 4和处理 5明显优于其他 3 个处理 。综
合分析比较得出 ,处理 5产生的丛生芽不仅数量较
多 ,而且丛生芽较大 、生长健壮 , 是铁线莲品种
Warszaw ska Nike增殖的适宜配方 。
表 2 不同激素配比的外植体诱导情况
Table 2　Effects of different hormone ratio on induction o f explants
处理
T rea tment
接种数/瓶
Inoculated
number
诱导数/瓶
Induced
number
诱导率/ %
I nduc tion
ra te
诱导数量及类型
Induction quantity
and type
愈伤组织生长表现
Callus g rowth
perfo rmance
1(CK) 30 10 33 10 瓶侧芽 无愈伤组织
2 27 15 56 15 瓶侧芽 黄白色 , 突起少 ,疏松
3 21 17 81 10 瓶侧芽 , 7 瓶愈伤 黄色 , 突起多 ,较疏松
4 23 15 65 13 瓶侧芽 , 2 瓶愈伤 黄绿色 , 突起多 ,致密
5 24 16 67 12 瓶侧芽 , 4 瓶愈伤 淡黄绿色 , 突起少 ,致密
表 3 不同激素配比的丛生芽增殖情况
Table 3　Effects of different hormone ratio on cluste r buds prolifera tion
处理
T rea tment
接前数/瓶
Quantity befo re
inoculation
接后数/瓶
Quantity after
inocula tion
增殖数/倍
P ro life ration
times
生长及增殖表现
Growth and pro life ration
perfo rmance
1(CK) 33 64 1.94 生长不良:量少且生长缓慢 , 叶发黄 ,叶尖枯萎
2 29 80 2.76 生长一般:数量及生长都一般 , 叶黄绿色 ,有黑色斑点
3 24 42 1.75 生长一般:数量及生长都一般 , 叶黄绿色 ,有黑色斑点
4 25 64 2.56 生长较好:量多且生长健壮
5 25 68 2.72 生长较好:量多且生长健壮
3 结论与讨论
3.1 结论
1)铁线莲品种 Warszaw ska Nike 初代诱导的
最适培养基为 MS +1.0mg/ L 6-BA +0.05mg/L
NAA ,诱导率可达 81%。各处理诱导出的愈伤组织
呈疏松型和致密型两类 ,致密型的愈伤组织不利于
进一步分化诱导形成完整植株 。
2)铁线莲品种 Warszaw ska Nike 继代增殖的
最适培养基为 MS +2.0mg/L 6-BA +0.05mg/ L
NAA ,增殖倍数达2.72 。丛生芽不仅数量较多 ,而
(下转第 36 页)
·33·　第 5 期 吴　荣 等　铁线莲品种Warszaw ska N ike的愈伤组织及不定芽诱导
3 讨论
1)酶切质量好坏主要取决于 DNA 质量与浓
度 、酶切时间和酶浓度。试验中 , DNA 质量通过电
泳检测并未发现 RNA 或蛋白污染 ,通过分光光度
计检测 , OD 260/OD280比值为 1.8 ～ 2.0。表明 ,DNA
质量符合要求 。在 DNA 质量满足要求的前提下 ,
DNA 量 、酶切时间和酶浓度 3个因素也相互影响 ,
即 DNA量越少 、酶切时间越长 、酶浓度越高 ,酶切
越彻底 。由于酶切时间过长可能使酶产生星活性
(具有目标位点以外的酶切活性),而酶量过多 ,可能
使反应体系中的甘油超过 5%,影响酶切活性与准
确性。因此 ,不主张加大酶量或增加酶切时间。为
此 ,将酶量与酶切时间(1h)都固定 ,酶切优化主要
针对 DNA 浓度进行 。
2)MSAP 分析中 ,正常预扩增和选择性扩增产
物应该是弥散状态 , 且有主带 , 大小一般不超过
2Kb。试验中 ,部分扩增产物从点样孔开始出现条
带 ,该现象在 PCR反应中较为常见 ,但难以解释。
因为即使是基因组 DNA ,其电泳位置也应在点样之
外 ,但点样孔位置存在扩增产物 ,似乎说明其分子量
比基因组 DNA 更大 ,这是不可能的。笔者推测 ,扩
增产物可能没有从聚合酶上脱落下来 ,当 DNA 与
蛋白一起电泳时 ,由于蛋白无法运动 ,从而当 DNA
也停留在了点样孔位置 。可以纯化扩增产物后电泳
证实这一假设 ,至于为什么扩增产物无法与聚合酶
剥离 ,还有待进一步深入研究 。
3)水稻基因组用量为 250 ng 、预扩与选扩体系
分别采用 Fermentas的 PCR混合物 1/2 和 1/4 体
系时 ,可获得理想 MSAP 检测效果。
[ 参 考 文 献]
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(责任编辑:杨　林)
(上接第 33 页)
且生长健壮。
3.2 讨论
1)铁线莲属植物枝条表面被毛 ,难于消毒 ,因
此接种前的消毒处理是其组织培养的一大难题 ,消
毒时间过长 ,造成接种后不生长甚至死亡 ,消毒时间
过短又会污染严重 ,如何掌握最佳的消毒时间和方
法还需进一步探讨 。
2)在对丛生芽增殖的研究过程中发现 ,转接15
d后的增殖效果不明显 ,而且伴随着新叶变黄和部
分叶片出现黑色斑点 ,造成此类现象的原因以及最
佳增殖培养基还有待进一步研究 。
[ 参 考 文 献]
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(责任编辑:杨晓容)
·36· 　　　　　　　　　　 　　　　　　贵 州 农 业 科 学 2011 , 39 卷