全 文 ：分子植物育种，2014年，第 12卷，第 4期，第 760-764页
Molecular Plant Breeding, 2014, Vol.12, No.4, 760-764
研究报告
Research Report
莲瓣兰转录因子MADS家族 DEF基因克隆及拟南芥遗传转化
李琼洁 1 朱芮 2 王小巧 1 朱永平 3 赵兴富 1 肖靖译 1 贾茸 1 秦晓杰 4 和凤美 1*
1云南农业大学园林园艺学院,昆明, 650201; 2福建农林大学艺术园林学院,福州, 350000; 3云南农业大学农学与生物技术学院,昆明, 650201;
4云南师范大学文理学院城市学院,昆明, 650201
*通讯作者, hefengmei918@126.com
摘 要 本研究以莲瓣兰‘玉兔彩蝶’花瓣为材料，根据 GenBank 中已经登录的春兰 DEF 基因序列
(HM106982.1)设计引物，克隆 DEF基因开放阅读框，构建表达载体，转化‘拟南芥’，并验证基因功能。研究结果
表明：所扩增的 DEF基因开放阅读框大小为 669 bp，编码 222个氨基酸，预测蛋白质分子质量为 25.560 kD。该
基因具有典型的植物MADS-box基因结构域，与春兰开放阅读框同源性达 99%，与其它兰花同源性都在 90%
以上。将 DEF基因构建到植物真核表达载体 pCAMBIA2300中，利用农杆菌花序法转化拟南芥，经 PCR分子
鉴定，获得含 DEF转基因拟南芥植株。
关键词 莲瓣兰, MADS, DEF,克隆,转化
Clone Transcription Factor of DEF-Like MADS Family Gene from
Cymbidium lianpan and Its Transformation in Arabidopsis thaliana
Li Qiongjie 1 Zhu Rui 2 Wang Xiaoqiao 1 Zhu Yongping 3 Zhao Xingfu 1 Xiao Jingyi 1 Jia Rong 1 Qin
Xiaojie 4 He Fengmei 1*
1 College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming, 650201; 2 College of Art and Landscape, Fujian Agriculture and
Forestry University, Fuzhou, 350000; 3 College of Agriculture and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming, 650201; 4 College of
Arts and Sciences Yunnan Normal University, Kunming, 650201
* Corresponding author, hefengmei918@126.com
DOI: 10.13271/j.mpb.012.000760
Abstract For research DEF gene function, DEF gene with open reading frame from petals of Cymbidium lianpan
cv.‘Yutu Caidie’was cloned using primers which had been designed based on Cymbidium goeringii DEF gene
sequences logged in GenBank (HM106982.1), the expression vector was constructed, Arabidopsis thaliana was
transformed. The results showed that DEF gene with open reading frame was 669 bp and encoded a protein of 222
amino acids and had 25.560 kD predicted protein molecules. The gene had a typical MADS-box gene structure.
Homology analysis showed that DEF shared 99% similarity with Cymbidium goeringii and above 90% similarity
with other orchids. Plant over expression vector was constructed by enzyme digestion of DEF gene and
pCAMBIA2300 and successive ligation, and transferred into Arabidopsis thaliana by floral dip. Transgenic plants
with DEF gene were obtained successfully after molecular identification.
Keywords Cymbidium lianpan, MADS, DEF, Cloning, Transformation
收稿日期：2013-12-09 接受日期：2014-01-24 网络出版日期：2014-03-08
URL: http://www.biopublisher.cn/index.php/mpbopa/article/view/1897
基金项目：本研究由云南省教育厅研究生项目(2012J076)资助
莲瓣兰(Cymbidium tortisepalum)主产于云南的
大理州，是中国春兰的一个新品系，并表现高度特异
的形态、结构和生理特性。目前，莲瓣兰在云南已经
成了观赏价值和经济价值高且开发前景好的滇兰主
体(陈定谋和陈浩, 2010,云南科技出版社, pp.12)。然
而，由于所处环境的破坏和高价位兰花使得来源于
广袤无垠的林地的莲瓣兰资源变得极度濒危，在一
些局部地区甚至已经灭绝(罗毅波等, 2003)。因此，克
隆莲瓣兰重要功能基因并研究其功能，对保护国兰
野生资源，培育优良国兰品种具有重要意义。
MADS基因家族在兰花成花转换及花器官发育
过程中具有重要作用，这些基因的表达和功能可能与
兰花结构的特异性及多样性有关(田敏等, 2011)。研究
兰花MADS基因将有助于对中国兰花发育机理的了
解，为国兰花型遗传改良奠定基础。DEF 基因为
MADS基因家族中 B类功能基因，参与植物花瓣和雄
蕊的发育(Mondragón-Palomino and Theissen, 2008)。
莲瓣兰‘玉兔彩蝶’为三星蝶珍品，因其两个捧
瓣全舌样化，酷似兔耳而得名，是蝶花中最具代表的
捧心蝶。本研究以莲瓣兰‘玉兔彩蝶’花瓣为研究对
象，根据 GenBank中其它物种 DEF基因序列设计简
并引物，从‘玉兔彩蝶’花瓣中克隆 DEF基因全长
cDNA，构建表达载体，转化‘拟南芥’，观察‘拟南芥’
花型的变化，并验证基因功能，为探索国兰蝶花形
成分子机理和进一步培育蝶花新品种提供新思路
和理论依据。
1结果与分析
1.1‘玉兔彩蝶’总 RNA提取与基因克隆
利用 Takara RNAiso Plus提取‘玉兔彩蝶’花瓣
总 RNA，电泳检测结果显示，在总 RNA的 28S、18S
和 5S处条带整齐明亮，且比例恰当，说明所提取的
RNA比较完整，无降解(图 1)。通过紫外分光光度计
检测，结果显示：‘玉兔彩蝶’花瓣总 RNA的 A260/
A280值为 1.95，表明所提取的‘玉兔彩蝶’总 RNA纯
度高，没有糖、蛋白质等污染，可以用于下一步试验。
利用 TransGen公司反转录试剂盒进行反转录，
以反转录 cDNA为模板，进行 PCR扩增，胶回收后
连接到 pEASY-T1，提取质粒送至生工生物工程(上
海)股份有限公司测序。再以 pEASY-DFF质粒为模
图 1‘玉兔彩蝶’花瓣总 RNA电泳图
Figure 1 Extracted of total RNA
板，用获得序列的编码区、pEASY-T1载体和 pCam-
bia2300双元载体多克隆位点设计的引物，进行开放
阅读框克隆，将胶回收纯化的 DEF基因开放阅读与
TransGen公司的 pEASY-T1载体进行连接，提取阳
性克隆 pEASY-DFF1质粒(图 2)。pEASY-DFF1质粒
PCR产物电泳结果显示，在 600~700 bp处有 1条明
显的亮带(图 3)，说明已获得 DEF基因开放阅读框。
图 2 pEASY-DFF质粒
注: M: DL2000 marker; 1~3:提取质粒
Figure 2 pEASY-T1-DFF plasmid
Note: M: DL2000 marker; 1~3: Plasmid
图 3 DFF RT-PCR扩增产物
注: M: DL2000 marker; 1,2: DFF RT-PCR扩增产物
Figure 3 RT-PCR amplified products of DFF
Note: M: DL2000 marker; 1,2: RT-PCR amplified products of
DFF
1.2序列分析
序列分析表明，所扩增的基因开放阅读框大小
为 669 bp，编码 222个氨基酸，预测蛋白质分子质量
为 25.560 kD。利用 Genious软件搜索基序表明，此基
因具有典型的植物MADS-box基因的结构，并且其
编码的蛋白质与春兰(AF169801.1) DEF蛋白有着较
高同源性，达 99%，与文心兰 DEF蛋白同源性达
95%，与石斛达 94%，与红鹤顶兰达 93%，因此，可以
推测该基因属于莲瓣兰 DEF功能基因(图 4)。
1.3植物表达载体的构建和检测
分析对比 pCAMBIA2300载体的多克隆位点和
莲瓣兰 DFF 基因的酶切位点，选用限制性内切酶
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Clone Transcription Factor of DEF-Like Gene from Cymbidium lianpan and Its Transformation in Arabidopsis thaliana 761
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 4莲瓣兰 DEF基因的 cDNA核苷酸和推测氨基酸序列
Figure 4 Nucleotide sequence of the cDNA encoding the DEF and the deduced amino acid sequence
BamHⅠ/XbaⅠ双酶切，经 1%的琼脂糖凝胶电泳，
检测到一条约 600~700 bp的条带，和一条约 3 000~
4 000 bp的条带，说明酶切成功(图 5)。将目标片段回
收后，在 T4连接酶作用下连接同样酶切后的 pCAM-
BIA2300载体，提质粒，获得重组表达载体 pCAMBI-
A2300-DFF (图 6)。经同样双酶切验证(图 7)，获得一
条约 600~700 bp的条带，和一条约 7 000~8 000 bp的
条带，说明获得重组表达载体 pCAMBIA2300-DFF
是正确的。
将重组载体 pCAMBIA2300-DFF通过电转化法
转入农杆菌 GV3101，进行菌液 PCR。PCR产物经过
1%的琼脂糖凝胶进行核酸电泳，检测到有大约
图 5 pEASY-T1-DFF双酶切
注: M: DL2000 marker; 1,2:双酶切产物
Figure 5 pEASY-T1-DFF double digests
Note: M: DL2000 marker; 1,2: Double digests products
图 6 pCAMBIA2300-DFF质粒
注: M: DL2000 marker; 1~5:提取质粒
Figure 6 pCAMBIA2300-DFF plasmid
Note: M: DL2000 marker; 1~5: Plasmid
图 7 pCAMBIA2300-DFF双酶切
注: M: DL2000 marker; 1~2:双酶切产物
Figure 7 pCAMBIA2300-DFF double digests
Note: M: DL2000 marker; 1~2: Double digests products
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莲瓣兰转录因子MADS家族 DEF基因克隆及拟南芥遗传转化
Clone Transcription Factor of DEF-Like Gene from Cymbidium lianpan and Its Transformation in Arabidopsis thaliana
600~700 bp的条带，说明成功完成表达载体构建并
顺利转入农杆菌 GV3101 (图 8)。
1.4 pCAMBIA2300-DFF通过侵染法转入拟南芥
将含有重组 pCAMBIA2300-DFF表达载体的农
杆菌 GV3101，侵染拟南芥植株的花序(T0)，正常生长
后收取其种子，进行卡那霉素抗性筛选，得到拟南芥
抗性植株。采用 CTAB法分别提取野生型拟南芥和
抗性拟南芥幼苗 DNA，PCR后，琼脂糖电泳，在抗性
拟南芥幼苗中检测到约 600~700 bp条带，而野生型
拟南芥没有检测到，说明目的片段已成功转入拟南
芥植株中(图 9)。
图 8菌液 PCR扩增产物
注: M: DL2000 marker; 1: PCR产物
Figure 8 PCR amplified products from bacteria liquid
Note: M: DL2000 marker; 1: PCR product
2讨论
莲瓣兰中捧瓣和萼片舌瓣化，成为蝶花，舌瓣化
程度的差异构成了一个观赏价值和经济价值极高的
独立的兰花群体(黄泽华, 1999, 中国花卉盆景, (7):
23-25)。“兰花密码”假说认为 DEF基因控制舌瓣的
形成(Mondragón-Palomino and Theissen, 2008)，然而
兰科植物种类很多，而该假说仅来源于部分洋兰，能
否适用于所有兰科植物，还需进一步验证。莲瓣兰为
图 9 GV3101侵染植 PCR产物
注: M: DL2000 marker; 1~2: PCR产物
Figure 9 DNA and PCR products from plant which infected by
GV3101
Note: M: DL2000 marker; 1~2: PCR products
滇兰主体，其蝶花代表‘玉兔彩蝶’2个捧瓣全舌瓣化，
形成三星蝶，是研究蝶花很好的材料。为探索蝶花形
成机理，本研究在前人研究的基础上试图进一步验证
莲瓣兰 DEF基因是否是舌瓣形成的功能基因。
本研究构建 DEF基因过量表达载体并转化模式
植物拟南芥，分子检测证实了目的基因己转入植株
体内，但在植株花瓣的表型上，变化不明显，具体原
因还有待进一步研究。德国学者对已发表的包括兰
花在内的所有单子叶植物的 DEF基因进行了系统进
化及发育方面的分析，发现兰花中的 DEF基因明显地
分为 4 类(Mondragón-Palomino and Theissen, 2008)。
本研究只克隆了一个 DEF基因，这个亚基因属于哪
类 DEF基因？控制兰花花瓣状的萼片和捧瓣及舌瓣
的形成到底是哪类基因？仍有待深入研究。DEF基因
在莲瓣兰花型的形成过程中是怎样发挥作用依然需
要通过莲瓣兰转基因试验来进一步证实，但目前莲
瓣兰组织培养的瓶颈问题还没得到解决，因此，莲瓣
兰转基因技术仍然面临巨大挑战。本研究为探究莲
瓣兰花发育相关 MADS-box基因的功能和花发育的
分子机理提供一定的研究基础。
3材料与方法
3.1植物材料
‘玉兔彩蝶’花瓣材料由云南省大理洲农科所提
供。在植株花初开时采下花瓣，用无菌锡纸包住，迅
速投入液氮，12 h后取出，-80℃冰箱贮存待用。
3.2试验方法
3.2.1总RNA提取与 cDNA合成
以‘玉兔彩蝶’花瓣为材料，用 Takara RNAiso
Plus提取 RNA (朱永平等, 2010)。用 TransGen公司
的 TransScript誖Ⅱ First-Strand cDNA Synthesis Super
Mix试剂盒合成 cDNA。
3.2.2基因克隆与序列分析
根据 NCBI 所登录的春兰 DEF 基因编码序列
(HM106982)设计引物，DEF_F：5-TTGGGGAAGGA
GAGAAAGAAAGAC-3；DEF_R：5-GCTTGGGAGC
ATAGAAACATCAGT-3，送往上海生工生物工程技
术服务有限公司进行合成。以前面实验合成的‘玉兔
彩蝶’花瓣 cDNA作为模板，进行 PCR 扩增获得目
的基因，反应体系总量为 50μL：25 μL 2×TransTaq誖
HiFi PCRSuperMixⅡ，引物各 1 μL，cDNA模板 2μL，
H2O 21 μL。反应的条件为：94℃预变性 30 s，59℃
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分子植物育种
Molecular Plant Breeding
退火 30 s，72℃延伸 1 min，35 个循环后 72℃保持
10 min。利用百泰克公司 DNA胶回收试剂盒回收目
的片段，连接到 TransGen 公司的 pEASY-T1 载体
上，转化到大肠杆菌感受态细胞内，提取阳性克隆质
粒并命名为 Peasy-DFF质粒。电泳检测后送上海生
工生物有限公司测序。
根据获得序列的编码区，pEASY-T1载体多克隆
位点序列，pCambia2300双元载体多克隆位点设计引
物 ，DEF F：5-ATGGGGAGAGGGAAGATAGA-3，
DEF R：5-TCAAGCCAGACGCAGATCAT-3，以质
粒 pEASY-DEF为模板，PCR扩增 DEF基因开放阅
读框，PCR反应体系与反应条件同上。利用百泰克公
司 DNA胶回收试剂盒回收目的片段，连接到 Trans-
Gen公司的 pEASY-T1载体上，转化到大肠杆菌感
受态细胞内，并提取阳性克隆质粒并命名为 pEASY-
DEF。测序后在 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
database)中进行 Blastn同源比对，并以 DNAman 软
件预测编码氨基酸和分子量，利用 Genious软件搜索
MADS基序。
3.2.3基因植物表达载体的构建
将 pEASY-DEF1 重组质粒用限制性内切酶
BamHⅠ/XbaⅠ双酶切，DNA凝胶回收试剂盒回收，
然后与经同样双酶切回收后的双元载体 pCAMBI-
A2300相混合，用 T4 DNA连接酶连接，连接产物转
化 DH5ɑ感受态细胞。涂板获得白斑菌落，经菌落
PCR检测为阳性后，摇菌提取质粒，双酶切鉴定。
3.2.4拟南芥的转化、检测
用电击法将含有目的基因的植物表达载体质
粒转入农杆菌(GV3101)内，并参照徐芳等(2005)的
方法进行转化拟南芥。直接观察转基因植株拟南芥
的表型，并提取转基因植株的基因组 DNA (Rogers
and Bendich, 1985)，进行 PCR扩增检测，PCR反应
条件与上述相同。
作者贡献
李琼洁与和凤美是本研究的实验设计和实验研
究的执行人，并完成论文初稿的写作；朱芮、王小巧
和赵兴富完成数据分析；朱永平参与实验设计；秦晓
杰、贾茸和肖靖译参与试验结果分析；和凤美是项目
的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文
写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由云南省教育厅研究生项目(2012J076)
资助。感谢云南农业大学农业生物多样性应用技术
国家工程研究中心和云南省农业生物多样性利用与
保护重点实验室提供资金支持。
参考文献
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