全 文 ：书核 农 学 报 2016，30(8):1453 ～ 1459
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2016-01-19 接受日期:2016-04-06
基金项目:国家自然基金(31270715，31000295)，国家科技部 973 项目(2012CB723008)
作者简介:刘世男，女，主要从事森林培育及竹子生物技术研究。E-mail:lsn_smile8866@ 126． com
通讯作者:林新春，男，教授，主要从事植物生物技术研究。E-mail:lxc@ zafu． edu． cn
文章编号:1000-8551(2016)08-1453-07
雷竹 SEP-like基因的克隆及功能分析
刘世男1，2 戚田田2 马晶晶2 马履一1 林新春2
(1 北京林业大学林学院，北京 100083;2 浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300)
摘 要:为探究竹类植物中 SEP-like基因的功能，利用同源克隆方法从雷竹中克隆出 1 个 SEP-like基因，
命名为 PvMADS5。该基因的开放阅读框为 687bp，可编码 228 个氨基酸。同源比对与系统进化树分析
表明，该蛋白与箭竹、毛竹、麻竹 SEP类蛋白同源，同属于禾本科 OsMADS5 亚类。实时荧光定量 PCＲ结
果表明，PvMADS5 在开花和不开花雷竹中的幼叶、老叶、秆、竹笋及花中均有表达;亚细胞定位表明
PvMADS5 是核蛋白。在拟南芥中过表达 PvMADS5，转基因植株比野生型开花晚并且莲座叶变小，表明
PvMADS5 可能是开花抑制基因且参与叶的发育。本研究为揭示竹子开花的分子机制提供了理论依据。
关键词:雷竹;PvMADS5;组织特异性;开花
DOI:10. 11869 / j． issn． 100-8551. 2016. 08． 1453
植物花器官的发生发育与其自身的繁衍紧密相
关，并受一系列花器官同源异型基因进行调控。1991
年，Coen 等［1］ 通过对来源于拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)和金鱼草(Antirrhinum majus)的花同源异型
基因进行研究，提出 ABC模型。ABC 模型假设存在 3
类功能不同的调控基因，即 A 类，B 类和 C 类，它们共
同作用决定每一轮花器官的发育。在拟南芥中，A 类
基因 AP1(APETALA1)和 AP2(APETALA2)决定第 1 轮
位置上萼片的形成;同时，它们与 B 类基因 AP3
(APETALA3)和 PI(PISTILLATA)共同控制第 2 轮位置
上花瓣的形成;而 B 类基因与 C 类基因如 AG
(AGAMOUS)一起控制第 3 轮位置上雄蕊的形成;C
类基因单独决定第 4 轮位置上心皮的形成，然后终止
一朵花的形态建成［2 － 3］。之后有研究发现胚珠的发育
需要另外基因的参与，这类基因被定义为 D 类基
因［4］。2001 年 Theien［2］发现所有花器官特征的调控
还需要另外一类基因(E 类)的参与，从而发展为
ABCDE模型。
通过对拟南芥的研究发现，E 类基因 SEP
(SEPALLATA)1 /2 /3 /4 主要在花组织中表达，是花器
官发育所必需的基因，参与花分生组织的整个过
程［5 － 7］。SEP基因的单双突变体的表型都与野生型差
异不明显，但是 sep1 sep2 sep3 三突变体花的内三轮花
器官均变成了萼片状器官［5，8］;而 sep1 sep2 sep3 sep4 四
突变体中 4 轮花器官全部变为叶片［6］。SEP 基因在 4
轮花器官的决定上是功能冗余的，在花发育过程中与
ABC类基因共同行使功能，是花瓣、雄蕊和心皮发育
所必需的［6，9 － 10］。一些物种中的 SEP类基因除了参与
花器官的形成，还促进植物开花，相关的报道除了模式
植物拟南芥外，还有百合花(Lilium longiflorum)、烟草
(Nicotiana tabacum)、大豆(Glycine max)等［11 － 13］。
禾本科植物中 SEP-like 基因非常丰富。如水稻
(Oryza sativa L．)中至少有 5 个，包括 OsMADS1、
OsMADS5、 OsMADS8 (OsMADS24 )、 OsMADS7
(OsMADS45 )与 OsMADS34 (OsMADS19 )，其 中
OsMADS1、OsMADS5、OsMADS34 属于 AGL2 /4 亚类，而
OsMADS7 和 OsMADS8 属 于 AGL9 亚 类［14 － 18］。
OsMADS1 与其它禾本科直系同源基因构成了 AGL2 亚
类基因中一个禾本科特异的 LHS1 分枝，研究较为深
入［19］。OsMADS1 (LHS1)具有禾本科物种特异的功
能，即能够调控小穗的确定性;除此之外还调控内外稃
的细胞分化和增殖［19 － 20］。OsMADS5 与 OsMADS1 是
旁系同源，主要在第 3 和第 4 轮花器官表达，并与
OsMADS34 参与花器官的发育［21 － 22］。
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竹类植物与水稻同属于禾本科，但是开花特性差
异很大。竹子开花周期一般 3 ～ 120 年，而且大多数竹
种开花后成片死亡，导致竹子开花原因至今尚不清
楚［23］。目 前 竹 子 SEP 基 因 的 研 究 仅 在 麻 竹
(Dendrocalamus latiflorus)中有报道，麻竹 DlMADS8 的
过表达使拟南芥提前开花［24］。竹类植物根据地下茎
不同可分为两大类:丛生竹与散生竹。麻竹属于丛生
竹，通常成片开花后死亡。本研究所用的雷竹
(Phyllostachys violascens)为散生竹，属零星开花竹种，
开花后不一定死亡。不同地下茎类型和不同开花类型
竹子的 SEP基因功能是否分化，需要进一步研究。本
研究利用同源克隆技术从散生竹雷竹中克隆 1 个 SEP
同源基因，对其组织表达、亚细胞定位及功能进行分
析，以期为揭示该类基因在竹子开花过程中的作用提
供理论基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
雷竹材料采于浙江农林大学智能温室大棚。雷竹
为零星开花竹种，在同一片竹林里有些竹株开花，有些
竹株不开花，甚至来源于同一竹鞭的竹株也有类似的
情况。由于外界环境影响基因的表达，为保证研究材
料遗传背景和外界环境的一致性，试验选取来源于同
一竹鞭的开花与未开花竹株研究相关基因的表达。采
集相应的幼叶、老叶、秆、竹鞭、竹笋及花芽材料，经液
氮速冻，－ 70℃保存备用。
1. 2 ＲNA的提取及 cDNA的合成
利用 Trizol法提取雷竹各个组织的总 ＲNA，然后
利用 Ｒeverse Transcriptase M-MLV(TAKAＲA 公司，大
连)反转录试剂将各组织的总 ＲNA，合成 cDNA 第 1
链，以备目的基因扩增或实时荧光定量 PCＲ所用。
1. 3 目的基因的克隆及序列分析
以 OsMADS5 为参照在毛竹(Phyllostachy edulis)
转录组数据库［25］进行比对，找到 1 个候选基因
(PH01001174G0480)，并根据该候选基因的基因组序
列设计引物(F:TTAGAGGGAGAGGGAGAGGCAG和
Ｒ:TTGAACCATCGCATCCAACATT)。以花芽 cDNA为
模板，利用上述引物进行 PCＲ 扩增，获得 790bp 的
cDNA片段。预测开放阅读框并利用引物(F:ATGGG
CCGCGGGAAGGTTGA和 Ｒ:TCATTCATTGTTCAAGTG
ATCCAAG)进行扩增。反应程序:94℃ 预变性 3 min;
94℃变性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 50 s，32 个
循环;72℃延伸 10 min。PCＲ产物经 1%琼脂糖检测，
由上海生工生物工程服务有限公司胶回收试剂盒纯化
后，将回收产物连接 pMD18 － T载体上，通过转化大肠
杆菌(DH5α)，PCＲ 检测阳性克隆送于上海华大基因
测序验证。
测序的结果经 VectorNTI 分析，利用 Protparam 和
ProtScale工具分别对其蛋白质的理化性质进行分析。
利用 DNAMAN对其与不同物种的 SEP 同源基因的氨
基酸序列比对，并用 Mega5. 0 中临近法对其系统进化
树的构建，其中进行 1 000 次 bootstrap分析。
1. 4 基因表达分析
采用实时荧光定量 PCＲ进行基因的表达分析，目
的基因的特异引物为 F:5-GCAACTACAACTCATCCGA
AGCA-3;Ｒ:5-GACCCAAGTCCTCACCAAGAATA-3;
以毛竹的 PheUBC18 基因(F:5-CTCCTCGTCTCCTTC
CCGAA-3;Ｒ:5-GTCCGTTGCTGTAAATGTGTGG-3)
为内参［26］。实时荧光定量 PCＲ 的反应体系如下:
cDNA 1 μL，引物(10 μmol·L －1)各 0. 4 μL，2 × SYBＲ
Premix Ex Taq II(Takara)10 μL，ddH2O 8. 2 μL。反应
程序:95℃预变性 3 min;95℃变性 10 s，60℃退火 20
s，72℃延伸 20 s，40 个循环;熔解曲线测定从 60℃到
95℃，每个 PCＲ 反应重复 3 次。PCＲ 扩增反应在
CFX96 TM Ｒeal-Time PCＲ Detection System (美国 Bio-
Ｒad)仪器上进行，数据分析采用 2 － ΔΔCt方法［27］。
1. 5 瞬时表达载体的构建
在目的基因 OＲF 区的上下游分别引入 KpnI 和
XbaI，上游引物为 GGTACCATGGGCCGCGGGAAGGTT
GA，下游引物为 TCTAGATTCATTGTTCAAGTGATCCA
AG。以 pMD18-PvMADS5 质粒为模板，用上述引物进
行扩增，PCＲ产物回收后连接 pMD19 － T载体后，测序
正确后，提取质粒。重组质粒经 KpnI 与 XbaI 酶切后
回收连接至 pCaM35S-GFP 载体上，经测序验证后，得
到 PvMADS5 － GFP 融合表达载体，用于原生质体转
化。
1. 6 原生质体的制备与转化
取生长 3 ～ 4 周抽薹前的野生型拟南芥(哥伦比
亚型)叶片，切成 0. 8 ～ 1mm 的细条，放入酶解液中，
23 ℃40 r·min －1暗培养 4 ～ 5 h。按照 Yoo 等［28］的方
法提取原生质体，在 PEG介导下将 PvMADS5 － GFP转
入原生质体。转化后的原生质体于室温弱光下培养
16 h，正置 OLYMPUS DP70 荧光显微镜 (Zeiess，
Japan)下观察荧光分布，以 pCaM35S-GFP 空载作为对
照。
1. 7 过表达载体的构建及拟南芥的遗传转化
将构建好 pMD19-T-PvMADS5 重组质粒经 KpnI与
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8 期 雷竹 SEP-like基因的克隆及功能分析
XbaI酶切后回收连接至 pC1301 载体上，将 pC1301-
PvMADS5 重组质粒通过冻融法导入农杆菌 GV3101
中，利用 Floral-dip 法［29］进行拟南芥的遗传转化。拟
南芥 Col － 0 种子经 10% NaClO 灭菌，均匀撒于含
50mg·mL －1潮霉素的 1 /2MS 固体培养板上，4 ℃放置
3 d后于 22 ℃、16 h 光照、8 h 黑暗条件下培养。筛选
出的 T1 经 DNAPCＲ进一步鉴定。
2 结果与分析
2. 1 PvMADS5 基因的克隆与分析
根据在毛竹转录组数据库中的候选基因设计引
物，利用同源克隆法，从雷竹中分离出 1 个 SEP 同源
基因，命名为 PvMADS5。序列分析表明，PvMADS5 的
开放阅读框为 687bp，编码 228 个氨基酸。预测其蛋
白分子量为 26. 2498kD，该蛋白是 MADS-box 家族一
员，具有典型的 MIKC结构域。为了确定 PvMADS5 与
禾本科其它物种的相似蛋白的进化关系，采用
Mega5. 0 进行序列比对并构建进化树。由图 1 可知，
PvMADS5 与箭竹(Fargesia nitida)的 MADS2、毛竹的
MADS5、麻竹的 MADS15 和 MADS16 关系较近，都属
于 OsMADS5 亚类。而毛竹的 MADS1、麻竹的 MADS8
和 MADS9 则属于 OsMADS1 /LHS1 亚类。
图 1 PvMADS5 与禾本科同源蛋白的系统进化树
Fig． 1 Phylogenetic analysis of PvMADS5 and the homologues from grass family
2. 2 PvMADS5 的组织表达特异性研究
采用实时荧光定量 PCＲ技术，检测同一竹鞭上开
花与不开花雷竹的幼叶、老叶、秆、竹笋及花芽中
PvMADS5 基因的表达情况。结果表明，PvMADS5 在开
花和不开花雷竹中均有表达。开花雷竹中，其在秆和
花中的表达水平较高，而在老叶中的表达水平最低;不
开花雷竹中，其在幼叶中的表达量最高，在竹笋中的表
达量最低(图 2)。
2. 3 PvMADS5 蛋白质的原生质体亚细胞定位
经 PlantCAＲE预测，PvMADS5 定位于细胞核。为
了验证这一预测结果，构建 PvMADS5 － GFP 瞬时表达
载体，并转化至拟南芥的原生质体中，让其瞬时表达。
由图 3 可知，转化 GFP 空载体的原生质体，绿色荧光
在整个细胞中分布;而转化含有 PvMADS56 － GFP 融
合表达载体的原生质体，绿色荧光仅在细胞的细胞核
中分布，表明 PvMADS5 定位于细胞核，与预测结果一
致。
2. 4 PvMADS5 在拟南芥中的过量表达研究
为了解 PvMADS5 基因的功能，构建 pC1301 －
PvMADS5 过表达载体并转化拟南芥。通过潮霉素筛
选及基因组 PCＲ 检测获得 28 个独立的拟南芥 T1 植
株。与野生型比较，转基因植株开花时间明显延迟，莲
座叶数量显著增加(P ＜ 0. 01)，且莲座叶变小(图 4)。
3 讨论
禾本科植物中的 SEP 基因分成三大亚类:Oryza
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核 农 学 报 30 卷
注:标尺为 15μm。
Note:Bars = 15μm．
图 3 PvMADS5 在拟南芥原生质中的亚细胞定位
Fig． 3 Subcellular location of PvMADS5 in Arabidopsis proplasts
图 2 PvMADS5 在开花与不开
花雷竹的不同部位表达水平
Fig． 2 Ｒelative expression level of PvMADS5 in
different tissues of flowering and non-flowering
Phyllostachys violascens
sativa MADS1 /LEAFY HULL STEＲILEＲ1 (OsMADS1 /
OsLHS1)、Oryza sativa MADS5 (OsMADS5)和 Oryza
sativa MADS34 /PANICLE PHYTOMEＲ2 (OsMADS34 /
OsPAP2)［30］。本研究从雷竹中克隆出的 SEP 同源基
因属于 OsMADS5 亚类，故命名为 PvMADS5，PvMADS5
与 OsMADS5 具有较高的一致性(86. 84%)，而麻竹中
SEP类基因———DlMADS8 则属于 LHS1 亚类。
双子叶植物中 SEP 类基因主要在花中表
达［5 － 7，11，31］;单子叶禾谷类植物，如水稻(Oryza sativa
L．)、大麦(Hordeum vulgare )、高粱(Sorghum bicolor)
注:图中的标尺为 5cm。＊＊表示差异显著(P ＜ 0. 01)。
Note:Bar = 5cm． ＊＊ indicate significant differences at 0. 01 level．
图 4 PvMADS5 过表达拟南芥 T1 植株的表型
Fig． 4 Phenotypes of the 35S::PvMADS5 transgenic
Arabidopsis in T1generation
的 SEP类基因在花序中大量表达，在叶、茎和根中表
达水平低或不表达［16，19］;麻竹中的 DlMADS8 主要在
成熟花中表达强烈，与水稻的 OsMADS5 的表达模式极
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8 期 雷竹 SEP-like基因的克隆及功能分析
相似［24］。PvMADS5 在检测的雷竹各个部位均有表达，
在开花雷竹的花和秆中表达水平较高，而在不开花雷
竹幼叶中的表达量最高。这些结果说明 PvMADS5 与
其它 SEP类基因的表达模式不同，可能具有不同的功
能。研究表明，单子叶禾谷类植物中的 SEP 类基因主
要参与花器官的发育［15，22］，而双子叶植物中的 SEP 类
基因除了参与花器官的发育，还影响开花时间［32］。拟
南芥中的 SEP3 基因的过表达可以促进开花［33］;大豆
中的 SEP-like 基因 GmMADS28 异位表达使烟草提前
开花［13］;百合花中的 SEP-like 基因 LMADS3 过表达使
拟南芥早花［11］。麻竹中的 SEP-like 基因 DlMADS8 过
表达拟南芥植株表现为花瓣与花萼发育迟缓、开花时
间提前和叶子发生卷曲［24］。本研究通过观察转基因
拟南芥发现，PvMADS5 的过表达并未引起花器官的变
化，而是延迟开花时间，此外莲座叶明显变小，说明
PvMADS5 可能是一个开花抑制基因并影响叶的发育。
上述结果说明，PvMADS5 发挥了不同于其它物种中
SEP类基因的功能。DlMADS8 与其它物种中的 SEP
类基因在影响花器官发育和调控开花时间上有具有相
似的功能，同时与 PvMADS5 一样影响叶的发育，说明
竹子中 SEP-like基因可能参与叶的发育，这个功能在
其它物种的 SEP-like 基因中鲜见报道。竹子中
DlMADS8 过表达促进拟南芥开花，相反 PvMADS5 过表
达延迟拟南芥开花。DlMADS8 属于 LHS1 亚类，而
PvMADS5 属于 OsMADS5 亚类;麻竹和雷竹属于不同
地下茎和开花类型，这可能是 2 个基因具有不同功能
的原因。此外，竹子中 SEP-like 基因可能存在功能分
化，这需要更多的研究去验证。
蛋白质是生物功能的直接体现者，它的亚细胞定
位与其功能发挥密切相关［34］。拟南芥原生质体瞬时
表达显示，PvMADS5 定位于细胞核中，与大豆的 SEP-
like 蛋白表达部位一致，进一步说明该蛋白发生功能
的部位是细胞核［13］。
4 结论
利用同源克隆技术，从雷竹中分离克隆了 1 个
SEP类基因———PvMADS5，其开放阅读框为 687bp，编
码 228 个氨基酸，具有典型的 MADS-box 区域，是
MADS-box家族一员。系统进化树表明 PvMADS5 属
于 OsMADS5 亚类，与箭竹、麻竹和毛竹中的 SEP 类蛋
白关系较近。组织特异表达分析结果表明，PvMADS5
在开花和不开花雷竹中的幼叶、老叶、秆、竹笋及花中
都有表达。亚细胞定位结果表明 PvMADS5 在细胞核
中表达。PvMADS5 过表达拟南芥植株表现为开花时
间延迟且莲座叶变窄小，表明 PvMADS5 可能是一个开
花抑制基因并参与叶的发育。本研究为 SEP 类基因
在竹子开花中的作用研究提供了重要理论依据。
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Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2016，30(8):1453 ～ 1459
Cloning and Functional Analysis of SEP-like Gene From
Phyllostachys violascens
LIU Shinan1，2 QI Tiantian2 MA Jingjing2 MA Lyuyi1 LIN Xinchun2
(1 Forestry College，Beijing Forestry University，Beijing 100083;2The Nurturing Station for
State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang Agriculture and Forestry University，Linan，Zhejiang 311300)
Abstract:To study the functions of SEP-like genes in bamboo，a SEP homolog was isolated from Phyllostachys
violanscens，and named as PvMADS5． The full-length OＲF of PvMADS5 is 687bp and encod a protein of 228aa．
Sequence alignment and phylogenetic analysis showed that PvMADS5 belongs to OsMADS5 subfamily and was homologous
to SEP-like protein from Fargesia nitida，Phyllostachys edulis and Dendrocalamus latiflorus． Ｒeal-time quantitative PCＲ
revealed PvMADS5 was expressed in all the tested organs of flowering and non-flowering bamboo plants． Based on
subcelluar localization assay PvMADS5 was shown to be a nuclear protein． Overexpression PvMADS5 in wild-type
Arabidopsis delayed flowering，and caused narrow and small rosetta leaves，suggesting that PvMADS5 might be a floral
repressor and involved in the leaf development． This study will provide valuable information for further disclosing the
mechanism of bamboo flowering．
Keywords:Phyllostachys violascens，PvMADS5，expression pattern，flowering
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