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中国科学 C 辑:生命科学 2008 年 第 38 卷 第 4 期: 328 ~ 336
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328
《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS
多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文库的
构建和鉴定
徐粤宇①②*, 周玉雷③④, 宋琳琳⑤, 张艳⑥, 赵茂林②*
① 湖南工程学院化学化工系, 湘潭 411104;
② 北京市农林科学院生物技术研究中心, 北京 100097;
③ 仲恺农业技术学院生命科学学院, 广州 510225;
④ 甘肃农业大学草业学院, 兰州 730070;
⑤ 河南科技学院生物系, 新乡 453003;
⑥ 首都师范大学生命科学学院, 北京 100037
* 联系人, E-mail: zhaomaolin@baafs.net.cn; xuyueyu2008@126.com
收稿日期: 2007-03-30; 接受日期: 2007-12-12
国家自然科学基金(批准号: 30370905 和 30571135)和北京市自然科学基金(批准号: 5032009)资助项目

摘要 为了克隆和转化多枝赖草(Leymus multicaulis)的耐黄矮病、耐蚜虫、
耐干旱、耐盐碱等抗逆性基因, 利用脉冲电泳分离纯化 2 Mb以上核 DNA, 酶
切后回收 10 ~ 200 kb DNA片段按大小分 5组与 TAC载体连接后电转化导入
细菌 DH10B, 在卡那霉素和蔗糖选择压下均有阳性克隆. 用两种 TAC 载体
pYLTAC17 和 pYLTAC747H/sacB 分别构建了文库Ⅰ和Ⅱ, 约 16.5 和 23.6 万
个克隆, 估计覆盖 3 ~ 5倍多枝赖草基因组大小. 文库以混合克隆形式保存在
12×2块深孔 96孔板中, 每孔 1.2 mL菌液中含 300 ~ 600个克隆, 40多万个克
隆转存到 3块 384孔板, 留 24个孔存叶绿体和线粒体 DNA探针菌液, 可用于
后续文库鉴定. 此外, 从文库Ⅰ和Ⅱ分别挑取 2501 和 2890 个单克隆存于 14
块 384孔板中. 17块 384孔板都用 GeneTACTMG3复制了 2份, 点高密度杂交
膜 6张, 以多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因 5′RACE-GR和 3′RACE-GR为探针初
步筛选到 19 个阳性克隆. 两文库为多枝赖草抗性基因的克隆、物理图谱的构
建、功能验证等基因组有关研究奠定了基础.
关键词
多枝赖草(Leymus multicaulis)
Mb级 DNA
可转化人工染色体(TAC)
基因组文库


多枝赖草 (Leymus multicaulis)(2n=4x=28=14Ⅱ ,
XmNs)是禾本科小麦族大麦亚族赖草属小粒种子类
型的一个种, 是我国新疆重要天然牧草, 它分布于盐
渍化荒漠草甸, 目前已被证实具有突出的耐干旱、耐
盐碱、耐黄矮病、耐蚜虫、耐瘠薄、耐污染等优异抗
逆特性[1,2]. 这些特性都是目前种植的大多数农作物、
牧草与草坪草栽培品种本身缺乏急需改良的特性 .
因此, 分离克隆控制这些优异抗逆特性的功能基因
是非常必要的.
构建基因组 DNA 文库是基因克隆和基因组研究
的基础. 植物可转化人工染色体(TAC)载体是 Liu 等
人[3]结合 PAC 载体和双元载体的优点构建的, 载体含




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P1 质粒和 Ri 质粒的复制子 , 能在大肠杆菌
(Escherichia coli)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefa-
ciens) 以单拷贝形式复制 , P1 裂解复制子可被
IPTG(Isoprophylthio- β-D-galactoside, 异 丙 基 硫 代
- β-D-半乳糖苷)诱导产生多拷贝, 利于克隆DNA的提
取和文库筛选[4]. 因此, 一旦筛选到目标阳性克隆, 可
直接利用农杆菌转化系统将其转到植物体中进行基因
功能互补实验, 不必进行亚克隆, 加速了工作进程[5].
目前, 利用TAC载体已成功构建了拟南芥(Arabidopsis
thaliana)[3]、普通小麦 (Triticum aestivum)“中国春 ”
(AABBDD)[6]、小麦-簇毛麦(Haynaldia villosa) 6VS/
6AL 易位系[7]、水稻(Oryza sativa)明恢 63[8]、抗黄矮病
小麦 -中间偃麦草 (Thinopyrum intermedium)易位系
HW642[9] 、 籼 稻 (Oryza sativa ssp. japonica) 品 种
H359[10]、稻瘟菌(Magnaporthe grisea)[11]、百脉根(Lotus
japonicus)[12,13]、番茄(Lycoper- sicon esculentum)[14]、桃
(Prunus persica)[15]等的基因组文库. 而且, 已有研究
报告 TAC 载体能将长达 80 ~ 100 kb 的大片段基因组
DNA 高效稳定地整合到拟南芥和水稻基因组中去[3,8].
本论文为确保实现从将来所构建多枝赖草 TAC
文库中筛选出的阳性抗逆克隆能够直接转化农作物、
牧草与草坪草等的目标, 选择大小、启动子、基因装
配方式不同的两种 TAC 载体 pYLTAC17 和 pYLT-
AC747H/sacB, 构建了 2 个高质量的多枝赖草基因组
(TAC)文库, 为进一步对多枝赖草的特异抗性基因的
克隆、精细物理图谱的构建、抗性机理的研究提供了
新的科研平台.
1 材料与方法
1.1 植物材料、载体和菌株
多枝赖草在浓度 0.4%(W/W)NaCl 的人工模拟盐
池[2]中遮光培养黄化再生苗, 2 种 TAC 载体 pYLTAC17
和 pYLTAC747H/sacB 由华南农业大学刘耀光教授馈
赠, 大肠杆菌感受态细胞(ElectroMAX. DH10B. Cells)
从 Invitrogen 购买, 农杆菌株 LB4404 由北京市农林科
学院刘凡研究员馈赠, 其感受态细胞自制, 叶绿体探
针高粱 psbA 和线粒体探针玉米 atp6 由中国科学院遗
传与发育生物学研究所王斌研究员馈赠.
1.2 主要仪器设备
主要仪器有高速冷冻离心机 Beckman, Eppendorf,
杂交炉, 脉冲场电泳仪 BIO-RAD CHEF-Mapper, 普通
电泳仪 BIO-RAD, 电激仪 BioRad GenePulser®Ⅱ, 相
差显微镜 Olympus, PCR 仪 Biometra T3 Thermocycler,
GeneTAC™ G3.
1.3 主要试剂和溶液
HindⅢ, T4 DNA 连接酶为 Takara 产品, HK 脱磷
酸酶、HK 磷酸酶为 Epicenter 产品, PFG Marker 为
New England Biolabs 产品 . Spermidine, Spermine,
Triton-100, Trizma base, EDTA, Na lauryl sarcosine,
Proteinase K, IPTG, 卡那霉素为 Amerisco 产品, 琼脂
糖、低溶点琼脂糖(low-melting-point agarose, LMP)、
BRL peptone, BRL yeast extract, NaCl等为 Promega产
品. VSWP(0.025 µm)为 Minipore 产品.
1.4 多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文
库的构建
(1) 多枝赖草的 2 Mb 以上核 DNA 制备: 取 25 g
多枝赖草再生黄化苗的嫩叶, 在液氮中磨成粉末, 加
入 250 mL 冰冷的核分离缓冲液 1×NIB (nuclei isola-
tion buffer, NIB: 0.15% β-巯基乙醇, 0.5%Triton X-100,
1×HB(10 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA, 80
mmol/L KCl, 0.5 mol/L 蔗糖, 4 mmol/L 亚精胺, 1.0
mmol/L 精胺; pH 9.4))[16~18], 混匀冰浴 10 min. 依次
用 30, 65, 180 和 300 目的钢丝细胞筛过滤, 再用 250
mL 冰冷的 NIB 清冼, 将滤液分装于 50 mL 离心管中,
4℃, 2000×g, 离心 15 min. 回收上清液再离心 15 min.
所有沉淀用预冷的 NIB 悬浮后, 4℃, 2000×g, 离心 10
min 弃上清, 再用 1×HB(0.15% β-巯基乙醇)悬浮细胞
核移到 2 支 10 mL 离心管, 4℃, 2000×g, 离心 10 min,
1×HB 悬浮细胞核移到 1 支 1.5 mL 离心管, 4℃,
2000×g, 离心 10 min; 沉淀用 1 mL 的 1×HB 悬浮. 在
40×相差显微镜测算核浓度, 用冰冷的适量 1×HB 调
整核液浓度到 1×108 个/mL. 置 45℃水浴 1~3 min, 加
入等体积 45℃的 1.4%用 1×HB 配制的 LMP, 轻柔混
匀, 迅速加到两种模具中(plug mold 1 为 0.5 cm× 0.2
cm×1 cm=100 µL(BioRad); plug mold 2 为 12 cm× 0.2
cm×1 cm=2.4 mL(自制)), 4℃凝固 30 min. 取出胶块,
置于 10 倍体积裂解液(0.25 mol/L EDTA pH 8.0, 1%
Na lauryl sarcosine, 0.2 mg/mL 蛋白酶 K)中, 重置
50℃杂交炉轻柔振荡温育 36 h, 每 12 h更换一次裂解




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缓冲液. 用 0.5 mol/L EDTA(pH 9.3)溶液置换裂解液,
50℃温育 1 h, 再置于 0℃的 0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)
溶液中冰上 1 h. 最后按 Yeast Chromosome PFG
Marker 条件进行脉冲电泳, 用 1%的 LMP 回收 2 Mb
以上的 DNA 片段, 保存于 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)
溶液中[18,19].
(2) 多枝赖草的 2 Mb 以上核 DNA 的部分酶切:
取 5 g 只含 2 Mb 以上的 LMP 凝胶块切成约 0.5 g/块,
置于 10 倍体积含 0.1 mmol/L PMSF 的 TE(pH 8.0)中,
冰上 1 h, 重复 3 次; 用 10 倍体积的 TE (pH 8.0)冰上
洗涤 3 次, 每次 1 h[20]. 按各胶块体积 V 的 3 倍为反应
体系(即 3 V), 分加 0.3 V 的 HindⅢ酶切缓冲液 10×
buffer(100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5), 10 mmol/L dithio-
threitol, 500 mmol/L NaCl, 1 mg/mL BSA 和 35 mmol/
L spermidine), 用 ddH2O 加到 3 V(包括胶体积), 冰上
平衡 3 h, 倒出酶切缓冲液, 新加 0.3 V 的 HindⅢ酶切
缓冲液 10×buffer 和 HindⅢ(以胶的重量为参数计算 10
块胶的酶量: 每 0.05 g 依次为 0.2, 0.4, 1, 2, 3, 4, 6, 8,
10, 15 U), 加 ddH2O 到 3~0.3 V(包括胶体积), 冰上平
衡 3 h, 再加 0.3 V的 0.1 mol/L的MgCl2, 冰上孵育 1 h,
37℃酶切 30 min, 加入 0.1 V 的 0.5 mol/L EDTA (pH
8.0), 冰上 15 min 终止酶反应, TE 清冼 2 次. 按
MidRange PFG marker 条件脉冲电泳确定最佳酶量.
按同批回收胶的最佳酶量进行大量酶切, 酶切
后通过脉冲电泳(图 1)按 Low Range PFG marker 回收
5组不同大小DNA片段(A组: 9.42~23.1 kb, B组: 23.1
~ 48.5 kb, C组: 48.5 ~ 97 kb, D组: 97 ~ 145.5 kb, E组:
145.5 ~ 300 kb)的胶. 分在 5 个透析袋中电洗脱回收
DNA(条件: 0.5×TBE, 起始脉冲 50 s, 终止脉冲 50 s,
电压 6 V/cm, 角度 120°, 电泳 9 h, 温度 14℃, 泵 80).
然后把透析袋转 180°同条件电泳 3 min, 停止电泳.
回收的 DNA 在超净台蒸发浓缩 2~3 倍后, 于 VSWP
膜上, 在 0.8×TEN(1×TEN: 10 mmol/L Tris-HCl, 1.0
mmol/L EDTA, 30 mmol/L NaCl)缓冲液中, 4℃透析
30 min, 小心吸取后 4℃保存.
(3) TAC 载体的制备和连接反应: 扩大培养含
TAC 载体的大肠杆菌[8], 再用 QIAprep Spin Miniprep
Kit 试剂盒分离与纯化 pYLTAC17 和 pYLTAC747H/
sacB (加 1/1000 IPTG 诱导)载体. 3 µg TAC 载体用
10× TA缓冲液 5 µL和 15 U HindⅢ加 ddH2O到 50 µL,
37℃酶切 30 min, 68℃ 5 min 钝化限制酶; 加 2.5 µL
100 mmol/L CaCl2 和 3MBU HK 脱磷酸酶 30℃作用 1
h, 65℃温育 30 min, 最后, 在 TE 中的 VSWP 膜上 4
℃透析 60 min. −20℃保存备用.
按 TAC 载体(pYLTAC17: 75 ng; pYLTAC747H/
sacB: 65 ng)和 5 组 DNA(A: 30 ng, B: 60 ng, C: 120 ng,
D: 160 ng, E: 350 ng)[8]混合后, 放入 PCR 仪, 50℃温育
1 min. 降温至 10℃, 再加 6 µL 的 10×T4 DNA 连接酶
缓冲液和 T4 DNA 连接酶 100 U(0.84 Weiss units), 用
0.7× TEN 调至 60 µL 充分混匀后, 按以下程序进行连
接反应: 10℃ 3 min, 3 min 升至 16℃, 16℃ 5 min, 30 s
升至 18℃, 18℃ 30 s, 30 s 升至 20℃, 20℃ 30 s, 8 s 降
至 4℃, 4℃ 3 min, 5 min 从 4℃升温至 22℃, 22℃ 1
min 再回到 10℃, 如此 20 次循环, 最后 65℃ 5 min.
连接反应液用 VSWP 膜对 1/4×TE 溶液在 4℃透析约
2~3 h.
(4) TAC 克隆导入大肠杆菌和阳性克隆菌落收集
保存: 取 1 µL 的 DNA 连接产物和 20 µL 的电转化感
受态细胞DH10B混匀后, 在BioRad GenePulser®仪上
电激转化(参数为: 电压 2 kV, 电容 25 µF, 电阻 200 Ω,
快速充电). 每次电激后, 将菌体转入 1 mL SOC(2%
BRL 蛋白胶, 0.5% BRL 酵母提取物, 10 mmol/L NaCl,
10 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L MgSO4, 20 mmol/L葡萄
糖, pH 7.0)培养基中 37℃, 225 r/min 摇菌 1 h. 取 10
~ 100 µL 间 10 个梯度的菌液涂于含 25 µg/mL 卡那霉
素和 5%蔗糖的LB固体培养基(1% BRL蛋白胶, 0.5%
BRL 酵母提取物, 0.5% NaCl, 1.5% Agar, pH 7.0)37℃
培养 12~16 h, 计算克隆数, 然后以每平板约 500个克
隆量的菌液按相同方式培养. 每次电激挑取 24~96 个
单克隆于 384 孔板中, 每孔加 90 µL 冷冻保存液(36
mmol/L K2HPO4, 13.2 mmol/L KH2PO4, 1.7 mmo1/L
citrate, 0.4 mmol/L MgSO4, 6.8 mmol/L (NH4)2SO4,
4.4%(V/V)甘油, 25 mg/L卡那霉素的LB溶液), 37℃培
养 10~12 h, 置于−80℃冰箱中保存. 每板统计克隆数
后加 3 mL 冷冻保存液, 用涂布器刮下菌落, 混匀后
保存于 96孔板中, 37℃培养 8 ~ 10 h, 冰上 15 min, 后
置于−80℃冰箱中保存[15].
1.5 TAC文库的鉴定和分析
(1) TAC 克隆的限制酶切分析: 从来源于 A ~ E
组的文库中各随机检测了 10 个 TAC 克隆, 分别接种




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于 3 mL 含有 25 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中,
37℃培养 12 ~ 14 h, 采用碱裂解法提取 TAC 克隆质
粒 DNA, 用 HindⅢ内切酶完全酶切, 用 0.7%琼脂糖
凝胶普通电泳检查文库插入片段大小和空载率. 从
两文库中各选 2 个 TAC 克隆, 接种于 20 mL 含 25
µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基 37℃培养 12 h 后, 培养
物稀释 106 倍后接种到 200 mL 含 25 µg/mL 卡那霉素
的 LB 培养基 37℃过夜培养, 连续继代培养 5 天后,
分别提取 1 天(0 代)和 5 天(约 100 代)TAC 克隆质粒
DNA, HindⅢ内切酶完全酶切后, 用 0.7%琼脂糖凝胶
电泳检查 TAC 克隆在继代培养中是否发生变化.
(2) 叶绿体和线粒体 DNA 污染分析: 用 DIG 标
记叶绿体探针高粱 psbA 基因、线粒体探针玉米 atp6
基因, Southern杂交方法检查文库细胞器DNA污染[19].
(3) TAC 克隆在大肠杆菌菌株和农杆菌菌株的稳
定性鉴定: 随机从文库中挑取 2 个克隆进行质粒的分
离, 通过电转化的方法导入农杆菌株 LBA4404 中,
选择性 LB 平板收集后, 再从农杆菌转化子中重新分
离, 再转化到大肠杆菌DH10B中, HindⅢ酶切分析这
些质粒的稳定性[6].
1.6 利用多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的初步筛
选
借助 GeneTAC™G3 将 14 块 384 孔单克隆板的
5376 个克隆按 6×6 的排列克隆 2 次重复接种于 8 cm
×12 cm 的硝酸纤维素膜上, 将接种面向上置于含 25
µg/mL 卡那霉素、5%的蔗糖和 0.3 mmol/L IPTG 的
LB 平板上, 待菌斑长至 2 ~ 3 mm 约 14 h. 膜的菌落
面向上小心置于用 10%SDS 溶液浸透了的 3 mm滤纸
上 4 min, 同样方法依次用变性液(1.5 mol/L NaCl, 0.5
mol/L NaOH)5 min, 中和液 (1.5 mol/L NaCl, 0.5
mol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA) 5 min 两次, 含 0.1%
SDS 的 2×SSC 5 min, 2×SSC 5 min, 0.4 mol/L NaOH
20 min 处理后, 在 3 mm 滤纸凉干, 放 CL-1000 ultra-
violet croslinker 机中能量为 1200II100 µJ/cm2 紫外线
下交联, 时间 4 min, 每张膜单放一个盒中漂冼, 菌
面向下轻微振荡, 依次再经 5×SSC, 0.1% SDS 中 20
min 两次, 2×SSC 中 10 min 两次, 室温下风干. 制备
好的高密度膜可直接用于杂交分析或室温下保存 .
采用碱裂解法提取本实验室的多枝赖草谷胱甘肽还
原酶基因的克隆菌 5′RACE-GR和 3′RACE-GR的质粒
DNA[21], 用 HindⅢ内切酶完全酶切, 用 0.8%琼脂糖
凝胶电泳, 用 AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收多
枝赖草 5′RACE-GR 为 795 bp 的片段和 3′RACE-GR
为 819 bp 的片段, 用 DIG 标记作为探针, 用 Southern
杂交方法筛选高密度膜.
2 结果
2.1 2 Mb以上核 DNA的制备和酶切
由于钢丝筛不吸附细胞核, 而且回收利用了滤
渣和第一次离心上清中的细胞核, 所以从 25 g 材料
共得到 LMP 胶 20 小块(体积为 100 µL×20 = 2 mL)和
4 长块(2.4 mL×4 = 9.6 mL). 如图 2 所示, 每 100 µL
的胶中 2 Mb 以上的 DNA 约 30 ~ 40 µg, 脉冲电泳回
收分离纯化后, 基本上不含细胞残渣、酚类物质、细
胞器DNA及小分子量核DNA混合物, 避免了它们对
后续实验的干扰[18,19]. 回收 2 Mb以上的 DNA总含量
约有 2~3 mg, 相比于 Liu, Zhang, 伏建民等人[16~18]得
到的纯 2 Mb 以上的 DNA 制备量多 5 ~ 10 倍.
LMP 胶中 DNA 酶切效果与 DNA 浓度、酶量、
胶重量、反应体积、时间、温度等 6 个主要因素密切
相关, 固定后 4 个容易人为调控的函数变量后, 通过
小量酶切测定同一批次回收胶的最佳用酶量, 再大
量酶切. 由于细胞核浓度固定, 所以用 12 cm 的 LMP
胶回收的 2 Mb以上的DNA的浓度相同(图 2), 一般以
每 0.05 g 胶重 2~4 U 可得到理想的酶切效果, 脉冲电
泳后按 Low Range PFG marker 图谱, 分别回收 5 组胶,
电洗脱获得 A, B, C, D, E 5 个不同大小范围的 DNA 片
段, 浓缩和脱盐后调整浓度约为 20 ng/µL(图 1).
2.2 TAC文库的构建
每微克载体 DNA 分别用 1, 2, 3, 5, 7, 10 U 的
HindⅢ酶量, 作用 30 min 后, 再分别用 0.5, 1, 2 MBU
的 HK 脱磷酶对载体进行脱磷, 通过琼脂糖凝胶电泳
和自连产物转化大肠杆菌 DH10B 两个方面对载体酶
切和脱磷效果进行检测 , 得到作用于每微克载体
DNA 的最佳酶用量、反应温度及酶作用时间为 3~5
U HindⅢ, 37℃酶切 30 min, 1MBU HK 30℃脱磷 1 h.
制备好的载体 DNA 浓度为 l00 ng/µL, 分装后保存于
−20℃, 避免了因反复冻融而降低载体连接效率. A~E




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图 1 脉冲电泳测定酶切 DNA 片段大小
1: E, 145.5 ~ 291 kb; 2: D, 97.0 ~ 145.5 kb; M: Low Range PFG
marker ; 3: C, 48.5 ~ 97.0 kb; 4: A, 9.42 ~ 23.1 kb; 5: B, 23.1 ~ 48.5
kb. 脉冲电场电泳条件为: 0.5×TBE, l% LMP 胶, 温度 14℃, 泵 70,
脉冲时间 18 h, 角度 120°(st1 Angle+60°; st2 Angle −60°), 电压 6
V/cm, 起始脉冲 15 s, 终止脉冲 1 s, 转化时间为线性变化

不同大小的 DNA 片段分别和载体按摩尔比从 1/10 到
2/1的 12个梯度进行连接以确定最佳连接比例, 并且每
次连接时载体固定为 TAC17(23 kb)为 75 ng, TAC747H/
sac (18.9 kb)为 65 ng 的用量. 本实验测得核 DNA 最佳
参数为(参看方法 1.2(3)), 基本按 1 mol 插入片段 DNA
和 2~4 mol 的载体 DNA, 片段越大需要的载体量越多.
在 PCR仪上进行 4℃至 22℃间分阶段循环的连接反应
比 4℃, 16℃等单一温度连接反应效率更高[8,9,19].
5 组 DNA 分别与 TAC 载体 pYLTAC17 和
pYLTAC747H/sacB 连接后通过电激法导人大肠杆菌
DHl0B中, 在含有 25 µg/mL卡那霉素和 5%蔗糖的LB
平板上均获得克隆, 每次电激可得到约 3000~5000 个
克隆, 且插入片段越大获得克隆数越少. 所构建的多枝
赖草 TAC 文库按两种方式保存, 单克隆池有 14×2 块
384孔板的5391个克隆(15个单存), 混合克隆池有12×2
块 96 孔板, 每个孔约 300~600 个克隆, 共包括约 40 多
万个克隆, 每个克隆池用 GeneTACTMG3 复制了 2 份. 2
种 TAC 载体和 5 组 DNA 片段在文库中详情见表 1.
2.3 TAC克隆鉴定和分析
A~E 组 50 个 TAC 克隆全部含有插入子, 重组
TAC 克隆的 HindⅢ酶切结果其大小分布在 10~150 kb
之间, 平均长度约 50 kb. 通过实验, 我们认为该方法
在判断插入片段的大小时不容易掌握, 如谱带有亮

图 2 脉冲电泳测定和回收 2 Mb 以上 DNA
(a) 1 ~ 4: 0.5, 2.5, 5, 10 µg λDNA(电泳 23.5 h 后加样); 5~8: 1/8, 1/4, 1/2, 1 块胶(100 µL); (b)和(c) 2 ~ 14: 12 cm长胶(2.4 mL)中间 11 cm 部分
切下没有 EB 染色. M: Yeast Chromosome PFG marker 脉冲电场电泳条件为: 0.5×TBE, 1% LMP 胶, 温度 15℃, 泵 70, 总脉冲时间 26 h;
Block1, 脉冲时间 15 h, 角度 120°(st1 Angle+60°; st2 Angle −60°), 电压 6 V/cm, 起始脉冲 70 s, 终止脉冲 70 s, 转化时间为线性变化;
Block2, 脉冲时间 11 h, 角度 120°(st1 Angle+60°; st2 Angle −60°), 电压 6 V/cm 起始脉冲, 120 s, 终止脉冲 120 s, 转化时间为线性变化




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表 1 多枝赖草基因组可转化人工染色体(TAC)文库概况
文库分类(按载体) 文库Ⅰ(pYLTAC17) 文库Ⅱ(pYLTAC747H/sacB)
文库保存形式

单克隆数 混合克隆数 单克隆数 混合克隆数
A 组 9.42~23.1 kb 45 1076 30 2784
B 组 23.1~48.5 kb 704 24281 268 19946
C 组 48.5~97.0 kb 792 83224 1608 147894
D 组 97.0~145.5 kb 696 46245 624 57610
E 组 145.5~291 kb 264 9804 360 8261
总计 2501 165380 2890 236495

暗之分, 同一条带可能代表不只同一条 DNA 插入片
段, 普通电泳中在载体 23.1 kb 处常有多条亮带, 加
样孔下有带形等. 因此本研究根据图 3(a)和表 1, 综
合依据了参与连接反应 5 组 DNA 的最小值、在文库
中的克隆数和 HindⅢ酶切结果 , 进行覆盖率估测.
两文库至少覆盖了 3~5 倍多枝赖草基因组(16.7×2/3=
11.1 Gb, 依据是小麦 ABD 基因组为 16.7 Gb, 推论多
枝赖草 XmNs 基因组为小麦的 2/3)大小.
为了评估 TAC 克隆的插入片段在大肠杆菌中是
否稳定, 随机挑选了两文库的 TAC 克隆, 接种于 5
mL 含 25 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中进行继代培
养, 比较第 1 代和第 100 代 HindⅢ完全酶切图谱, 电
泳检查结果表明, TAC克隆在继代培养前后没有变化
(图 3(b)). 克隆在大肠杆菌和农杆菌中的相互转化
(DH10B→LBA4404→DH10B)实验表明, 前后 2 次
TAC 克隆的 HindⅢ酶切图谱均相同(图 3(c)).
2.4 TAC克隆初步筛选
利用多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的 5′RACE-
GR 和 3′RACE-GR 为混合探针对文库进行筛选, 共筛
选出了 19 个阳性克隆, 说明该文库具有很好的代表
性和实用性(图 4).
以高粱叶绿体 psbA 基因和玉米线粒体 atp6 基因
为混合探针进行菌落原位杂交, 检查细胞器 DNA 对

图 3 TAC 克隆质粒 DNA 的 HindⅢ酶切普通电泳图谱
(a): 载体, 2~9:TAC17; 10~17: TAC747H/sacB; 插入 DNA, 2, 17: A; 3, 4, 6: B; 9, 13, 14, 15: C; 8, 10, 12: D; 5, 7, 11, 16: E. (b): 随机挑选的 4
个 TAC 克隆 0 代和 100 代的 HindⅢ酶切图谱比较; 1, 2, 3, 4: TAC17; 5, 6, 7, 8: TAC747H/sacB; 1, 3, 5, 7: 0 代; 2, 4, 6, 8: 100 代. (c): 随机
选取的 2 个 TAC 克隆在大肠杆菌和农杆菌中的相互转化 DH10B→LBA4404→DH10B)实验, 两个重组克隆, 不但在大肠杆菌中Ⅰ和Ⅱ前
后 TAC 克隆的 HindⅢ酶切图谱均相同, 同时在农杆菌Ⅲ中也相似, 从而有力证明了 TAC 重组克隆能穿梭于大肠杆菌和农杆菌. M: Hind
Ⅲ/λDNA




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图 4 多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因为探针与 TAC 克隆的杂交结果

TAC 库的污染, 随机挑选的 384×(300~600)个克隆均
无杂交信号, 而 24 个阳性对照均有强烈的杂交信号,
说明该文库基本排除了细胞器 DNA 的污染[19].
3 讨论
3.1 材料的选择
根据拟南芥[3]、小麦[6]、水稻[8]等的成功报道, 一
般用植物幼苗更容易提到高质量的 Mb 级 DNA[18].
而多枝赖草主要是多年生宿根繁殖生长, 种子小, 繁
殖周期十分长且成活率低, 叶片细小, 室内发芽难以
长出足够量的黄化幼嫩叶片供 DNA 提取; 室外无性
繁殖虽快, 但田间正常生长条件下的多枝赖草叶片
的木质化程度太高, 成熟叶片中酚类等次生物质积
累较多, 干扰 DNA 的提取. 所以我们用在浓度 0.4%
(W/W)NaCl 的人工模拟盐池[2]中遮光培养的黄化再生
苗为材料, 主要原因是暗培养条件下, 叶绿体的光反
应和相关代谢不旺盛, 植物叶片的机械组织和输导
组织不发达, 叶片黄化, 相对于见光下有更多未分化
的分生组织大核细胞, 更适于进行细胞核提取.
3.2 实验的分析
依据细胞核浓度确定蛋白酶K的用量和反应时间,
通过实验比较, 一般在一定范围内其他条件相同时蛋
白酶 K 浓度与细胞核浓度成正相关, 与时间成反相关.
为了得到好的酶切效果, 即 2 Mb以上DNA尽可
能多的在 HindⅢ酶切位点切开, 且酶切后尽可能多
分布在选择范围内, 首先必须减少 2 Mb以上DNA的
机械断开, 最好 Mb 级 DNA 没有酶切前不要离开
LMP 凝胶固相和减少人为切割, 其次按 2 Mb 以上
DNA 的浓度、胶重量、胶体积为参照, 先作小量酶切
测定同一批次回收胶的最佳用酶量, 后再大量酶切,
脉冲电泳回收一定范围的 DNA 片段.
常用的 DNA 连接反应温度[10~15]为 16℃, 4℃或
22～25℃. 在 4℃条件下, 反应体系中 DNA分子末端
之间易形成可供连接酶作用的底物, 然而在此温度
下酶活性较低. 在 22℃时, 连接酶活性虽高, 但DNA
分子运动快, 不易形成稳定的可供连接的底物, 一般
只适用于高浓度 DNA 分子间的线状连接 [7]. 利用
PCR仪在4, 10, 16, 18, 20和22℃间进行温度循环, 可
使这 2 个因素得到优化, 提高了连接效率[7,8]. 采用电
激法转化大肠杆菌不仅可提高转化效率, 而且对大
质粒有效进入宿主菌体也是必需的.
本研究使用 2 种 TAC 载体 pYLTAC17 和
pYLTAC747H/sacB. 它们有 sacB 蔗糖致死基因作为
插入子的选择标记, 以 HindⅢ酶切位点为克隆位点.
sacB 基因编码果聚糖蔗糖酶(levansurase), 催化从蔗
糖转移果糖残基到各种受体蛋白上, 影响受体的正
常功能. 当琼脂培养基中含有 5%的蔗糖时, sacB 基




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因产物能使大肠杆菌和农杆菌致死. 当有外源 DNA
片段插入到 TAC 载体的克隆位点后, sacB 基因失活,
阳性克隆在含有 5%的蔗糖的琼脂培养基中可以生
长, 而未插入外源基因的阴性克隆致死[9]. 因此只要
在蔗糖培养基上生长的菌落就是插入了外源 DNA 片
段的阳性克隆. 并且我们在进行连接产物转化大肠
杆菌及阳性菌落的收集保存时, 均设在同一平皿内
添加空载体样品菌的对照. 我们检测的结果表明, 本
文库的空载率非常低.
3.3 前景
为了提高文库的利用价值, 设计 5 组不同插入片
段长度来确保不同研究目标. 为了满足以基因片段为
探针筛选出含有完整基因克隆的需要, 我们设计的文
库包含插入片段长度为 48 kb 左右(B, C 组)的克隆约
28 万个, 即能在很大程度上包含候选基因的编码序列
和调控序列以及侧翼序列, 或可能包含基因簇. 较大
插入片段中候选基因的原始侧翼序列提供了一个缓冲
区, 当整合入宿主基因组后, 可能减少染色体位置效
应的影响, 提高候选基因的表达效率. 为了满足染色
体步移、图位克隆、物理图谱的构建等需要, 文库中
插入片段长度为 97 kb以上的有 12万多个(D, E组). 23
kb 以下的构建效率虽然很高, 一次电激最多可达 7000
多个, 但筛选工作量大, 有时还不能包含目的基因的
全序列, 所以我们几乎没有选择保存(A 组)[22].
我们首次构建了多枝赖草基因组可转化人工
染色体(TAC)文库, 其总克隆数为 40 多万个, 至少覆
盖了 3~5 倍多枝赖草基因组, 如此大数目的文库显然
难以使用通常的每个克隆单独保存和高密度杂交膜筛
选的策略. 为了便于文库的保存和筛选, 我们将约500
个 TAC 克隆混合构成一个池, 放入 96 孔板的一个孔
中, 每块板包含约 4~5 万个克隆, 同时还有 3 块 384
孔板包含全文库. 目的基因的筛选方法是首先从 3 块
包含全文库的 384 孔板中用克隆池 PCR[22]和膜杂交相
结合选出阳性池, 再进一步通过菌落原位杂交筛选出
含目的基因的克隆. 每个池的培养、质粒提取和 PCR
扩增都以 384 孔板为单位来进行操作, 快速方便.
我们以多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因为探针对
14 块 384 孔板单克隆文库进行了初筛得到 19 个克隆,
电转化的方法导入农杆菌株 LBA4404 中, 正在拟南
芥中做功能验证实验.
本文库是用已经成熟的高效植物基因 TAC 克隆
系统, 构建拥有许多优异抗逆基因的我国特有种质
资源多枝赖草的基因组可转化人工染色体(TAC)文库,
我们正利用已经获得的各种与耐黄矮病、耐蚜虫、耐
干旱、耐盐碱基因[1,2]相关的分子标记作探针, 对其进
行筛选, 为我们获得含有原创性知识产权的抗逆基
因的阳性克隆, 转化农作物、牧草与草坪草等, 为相
应植物的抗逆遗传育种开辟新途径, 为农业、畜牧业
和草坪业等可持续发展服务.
致谢 感谢华南农业大学刘耀光教授为本研究提供 TAC载体 pYLTAC17和 pYLTAC747H/sacB, 中国科学院
遗传与发育生物学研究所王斌研究员提供叶绿体和线粒体探针及个人相关研究资料, 北京市农林科
学院蔬菜研究中心刘凡研究员提供农杆菌株 LB4404, 中国农业科学院作物科学研究所孔秀英研究员
提供宝贵经验.
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