全 文 ：收稿日期:2007-03-28
基金项目:国家自然科学基金(30370905;30571135);北京市自然科学基金(5032009)
作者简介:徐粤宇(1976-),男 ,湖南湘潭人 ,硕士 ,主要从事多枝赖草和湘莲基因组文库 、基因克隆 、生物制药和生物信息学的研究
通讯作者:赵茂林(1965-),男 ,山西原平人 ,研究员 ,研究生导师 ,主要从事小麦和多枝赖草分子细胞遗传学的研究。
多枝赖草基因组Mb级 DNA制备和酶切方法的优化
徐粤宇1 ,周玉雷2 ,赵茂林3 ,王志平4 ,王克武4 ,张　艳1
(1.首都师范大学 ,北京　100037;2.甘肃农业大学 ,甘肃 兰州　730070;
3.北京市农林科学院 ,北京　100097;4.北京市土肥工作站 ,北京　100029)
　　摘要:Mb 级 DNA 的制备和酶切是构建 YAC , PAC , BAC , BIBAC 和 TAC 文库与大尺度物理图谱的基础。以浓度
0.4%(m/ m)NaCl人工模拟盐池中生长的多枝赖草再生叶为材料提取细胞核 ,经钢丝细胞筛过滤 , 多次回收滤渣和离
心上清中的细胞核 ,相差显微镜调浓度达 108 个/mL后 , 经 LMP包埋 ,蛋白酶 K降解核蛋白 , 脉冲电泳纯化回收后 ,在
LMP胶块中 2 Mb 以上 DNA 的浓度约为 250 ng/μL。在胶中经 Hind III 部分酶切再用脉冲电泳回收不同大小范围的
DNA ,电洗脱浓缩除盐后浓度约为 25 ng/μL。用此方法得到的核 DNA 不但无细胞器 DNA 等的污染 ,而且浓度高 , 可直
接用于各种人工染色体文库的构建。
关键词:多枝赖草;Mb 级 DNA;基因组文库;脉冲交变电场电泳;酶切
中图分类号:Q781;Q243;S812.8　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2007)06-0024-06
Optimized Method of Preparing and Digesting Megabase-size
DNA of Leymus multicaulis Genomes
XU Yue-yu1 , ZHOU Yu-lei2 ,ZHAO Mao-lin3 ,WANG Zhi-ping4 ,WANG Ke-wu4 ,ZHANG Yan1
(1.Capital Normal University ,Beijing　100037 ,China;2.Gansu Agricultural
University ,Lanzhou　730070 ,China;3.Beijing Academy of Agriculture and Forestry
Science ,Beijing　100097;4.Beijing Soil and Fertilizer Station ,Beijing　100029 ,China)
Abstract:Preparation and digestion of Megabase-size DNA with high quality is the basis for construction of genomic
library with large DNA inserts such as yeast artificial chromosome(YAC),bacterial artificial chromosome(BAC),binary
BAC library(BIBAC), transformation-competent artificial chromosome (TAC), and for long-range physical mapping.This
method of embedding the nuclei is optimized to prepare Megabase-size DNA of Leymus multicaulis genomes with high
yield and purity.Generally , it includes isolation of purified nuclei by differential centrifugation , embedment of the nuclei
in low-melting-point agarose pulgs , and digestion with proteinase K to release Megabase-size DNA.To purify the high
molecular weight DNA with pulsed field gel electrophoresis can avoid the contaminants of organellar and small molecular
weight DNA.Selecting digested DNA fragments is between 9 ～ 300 kb after partial digestion.It proves that the method is
suitable for construction of genomic library of Leymus multicaulis.
Key words:Leymus multicaulis;Megabase-size DNA;Genomic library ;Pulsed field gel electrophoresis;Digestion
　　多枝赖草(Leymus multicaulis)(2n=4x =28=14II ,
XmNs)是禾本科小麦族大麦亚族赖草属小粒种子类型
的一个种 ,是我国新疆重要天然牧草 ,为优良的饲用禾
草[1] 。目前已被证实具有突出的耐干旱 、耐盐碱 、耐黄
矮病 、耐蚜虫 、耐瘠薄和耐污染等优异抗逆特性[2] 。郭
光艳等[ 3]利用SSR技术 ,选出了 81对多枝赖草的特异
引物 ,进一步获得4对耐黄矮病的普通小麦-多枝赖草
二体异附加系 Line24的标记[4] 。为了克隆和转化多枝
赖草的抗逆相关基因 ,着手 TAC 文库的构建 ,而制备高
纯度的Mb级DNA。但是 ,由于机械切断 、试剂对分子
结构的破坏和核酸酶降解等因素 ,难以从植物中得到
高纯度的Mb级DNA[ 5] 。1990年 ,Cheung 等[ 6 ,7]最初采
华北农学报·2007 , 22(6):24-29
用低熔点琼脂糖(Low-melting-point agarose ,LMP)包埋原
生质体的方法制备植物Mb级DNA ,但是由于原生质体
的培养周期性长 ,有的物种较难培养 ,需用纤维素和果
胶酶水解细胞壁 ,而且常有叶绿体和线粒体的DNA污
染 ,不利于后续的基因筛选 、克隆和物理图谱分析等。
1994年 ,Liu等[ 8]提出了完整细胞核包埋法制备Mb级
DNA ,虽然较好地克服了包埋原生质体方法的缺点 ,但
在凝胶块和微珠中含有大量的细胞残渣 、酚类物质 、细
胞器 DNA及小分子量核 DNA混合物 ,影响后面的酶切
和分子生物学分析。1998年 ,伏健民等[ 5]利用脉冲电
泳纯化Mb 级 DNA有效地克服了上述缺点 ,但胶块
DNA浓度不高。2004年 ,殷剑美等[ 9]利用酚结合剂
PVP40(Polyvinylpyrrolidone)较好地去除了棉酚等次生物
质的干扰;用低速稍离心去除了不溶性杂质 ,但仍有细
胞器DNA及小分子量核DNA的污染。在前人的基础
上 ,试图寻找经济高效且适合多枝赖草和其他植物Mb
级DNA提取方法 ,不但要去除大杂质、糖 、蛋白质 、酚类
物质 、细胞器DNA和其他小分子量DNA的干扰 ,而且
要获得高浓度Mb级DNA ,能满足各种文库的构建。
1　材料和方法
1.1　植物材料和探针
多枝赖草由北京市农林科学院生物技术中心提
供。栽培在浓度 0.4%(m/m)NaCl 人工模拟盐
池[ 10]里的多枝赖草的成熟绿叶 ,以及剪去叶后遮光
培养 4 ～ 5 d 后采取的黄化再生嫩叶 。叶绿体和线
粒体探针由中科院遗传发育所王斌研究员馈赠。
1.2　方法
我们分别以Zhang[ 11] ,Fu[ 5] ,Liu[ 8]等3种不同方
法(Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ)制备多枝赖草 DNA的同时 ,吸取了这
3种方法的优点提出 IV方法制备 Mb级 DNA 。
1.2.1　细胞核分离　取 25 g 多枝赖草叶 ,在液氮中
磨成粉末 ,加入 250 mL 冰冷的含 0.15%β-巯基乙醇
和0.5%Triton X-100的1×HB[ 11] ,混匀后冰浴10min。
依次经孔经为600 ,230 ,83 ,50μm的钢丝细胞筛过滤 ,
再用 250 mL相同液体清洗所有滤渣 ,将滤液分装于
50 mL离心管中离心(4℃4 500 r/min)15 min ,回收上
清液再离心 15 min;所有沉淀加 50 mL相同液体悬浮
后离心 10 min;细胞核用只含 0.15%β-巯基乙醇的
1×HB悬浮后离心 10 min ,再用 1×HB悬浮后离心 10
min ,用 1mL 的 1×HB悬浮暂放冰上。
1.2.2　细胞核的浓度调整 、包埋和裂解　将细胞核
悬浮液稀释 20倍后 ,用血球计数板在 40×相差显
微镜下观察核的完整性和测算核浓度[ 12] 。用冰冷
的1×HB调整核浓度到 108 个/mL ,置 45℃水浴1 ～
3 min ,加入等体积 1.4%的 LMP ,轻柔混匀 ,迅速加
到两种模具中(BioRad的 plug mold 1为0.5×0.2×1
cm=100 μL;自制的 plug mold 2为12×0.2×1 cm=
2.4 mL)制成两种胶块 ,用蛋白酶 K裂解[ 5] 。
1.2.3　LMP 胶块质量检测与 Mb级 DNA的回收 、保
存 　取 1 , 1/2 , 1/4 , 1/3 , 1/6 和 1/8 胶块按 Yeast
Chromosome PFG Marker(NEB)条件进行脉冲电泳 ,
23.5 h后加λDNA Marker。电泳结束后 EB染色估测
2Mb以上 DNA含量。最后按相同条件脉冲电泳回
收 2Mb以上 DNA ,保存于 TE(pH 8.0)溶液中 。
1.2.4　多枝赖草 2Mb以上 DNA的部分酶切　取 5
g只含2Mb以上DNA的LMP 胶块切成约0.5 g/块 ,
按各胶块体积(V)的 3倍为反应体系(即 3V),分加
0.3 V的 Hind Ⅲ酶切缓冲液(10×buffer),用 ddH2O
加到 3 V(包括胶体积),冰上平衡 3 h ,倒出酶切缓
冲液 ,新加0.3 V的 10×buffer和 HindⅢ(以胶的重
量为参数计算 10 块胶的酶量:按每 0.05 g 分别加
0.2 ,0.4 ,1 ,2 ,3 , 4 ,6 , 8 ,10 ,15 U),加 ddH2O 到 2.7 V
(包括胶体积), 冰上平衡 3 h , 再加 0.3 V 的 0.1
mol/L的MgCl2 ,冰上孵育 1 h ,37℃酶切 30 min后 ,脉
冲电泳确定最佳酶量。按同批回收胶的最佳酶量进
行大量酶切 ,通过脉冲电泳分离和回收 5组含不同
大小的 DNA片段的胶块。用透析袋电泳洗脱回收
DNA(条件:0.5×TBE ,脉冲 50 s-50 s ,电压 6V/cm ,
角度 120°,温度 14°C ,泵 70 ,电泳 9 h后把透析袋转
180°同条件电泳 3 min ,停止电泳)。回收的 DNA 在
超净台上蒸发浓缩至原体积 1/2 ～ 1/3 后 ,用漂在
0.8×TEN缓冲液上的 Minipore(0.025 μm)膜 4℃透
析 30 min ,小心吸取各组DNA于 4℃保存[ 13] 。
1.2.5　检测 DNA大小和纯度　取 5组电洗脱浓缩
后的 DNA 溶液各 15 μL 和 1 μg 的 Low Range PFG
marker 一起脉冲电泳 ,检测回收酶切 DNA片段的大
小范围。把脉冲电泳回收纯化前 、后含 2 Mb 以上
DNA的 LMP 胶块的 Agarase 消化液和 HindIII 酶切
后电洗脱浓缩的 DNA溶液分别直接点在硝酸纤维
素膜上 ,以高粱叶绿体 psbA 基因 、玉米线粒体 atp6
和 atp9 基因为阳性对照 ,并以此为混合探针进行点
杂交 、压片 、冲洗显影后 ,观察所制备 DNA中细胞器
DNA的污染状况。
2　结果与分析
2.1　细胞核的完整性 、浓度调整和包埋
血球计数板显微镜检测结果(图1)表明 ,总体上Ⅰ,
Ⅱ, Ⅲ和Ⅳ四种方法都能获得完整细胞核 ,计算各自细胞
核浓度为Ⅳ(4.78×108个/mL)>Ⅱ(1.13×108个/mL)>
6期 徐粤宇等:多枝赖草基因组Mb级 DNA 制备和酶切方法的优化 25　
Ⅲ(4.4×107 个/mL)>I(3.8×107个/mL),据此调整最
终细胞核浓度到 5×107个/mL(IV为108个/mL),从而
Ⅰ～ Ⅳ最终体积分别为 0.75 ,2.25 ,0.9和 4.8mL ,包埋后
获得胶块数Ⅳ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ(表 1)。可见在Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ方法
中纱布 、Miracloth和尼龙筛的强吸附作用降低了细胞核
的浓度 ,而 IV方法中钢丝筛对细胞核吸附力小 ,通过
多次清洗过滤剩余物 ,使材料中绝大部分的细胞核进
入滤液 ,并再次回收第一次离心上清 ,所以细胞核浓度
最高。
　　从图 1 还可明显看到 ,大杂质颗粒的含量为
Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅰ ,显然通过 Triton X-100或 β-巯基乙
醇的多次离心漂洗可明显减少大杂质颗粒 。
1.多枝赖草细胞核;2.多枝赖草细胞;3.杂质颗粒
1.Nuclear of Leymus multicauli;2.Cell of Leymus multicauli;3.Impurity of granule
图 1　镜检(40×)4种方法提取的细胞核
Fig.1　Nuclei prepared from four methods photographed under 40× phase-contrast objective lens
2.2　LMP胶块中 2 Mb以上 DNA的浓度比较和回
收纯化
脉冲电泳的结果表明(图 2):4种方法获得的
LMP胶块中都获得了一定量的多枝赖草的 2Mb以上
核DNA ,但 DNA的含量 、大小分布和纯度有所区别。
4种方法均没有一次性得到高纯度的 2 Mb 以上
DNA ,如不经分离纯化处理 ,则都不能完全避免小分
子量DNA对后续试验的干扰 ,其中 IV通过调高约 2
倍细胞核浓度使 2Mb以上 DNA含量最高 ,每 100μL
的胶块含 35～ 45μg 。通过图 2 ,3的脉冲电泳条件 , 2
Mb以上的 DNA均在加样孔附近 ,易于分离回收纯化
的操作。
YM.Yeast Chromosome PFG Marker;I ～ IV.4种方法制备的胶块;1～ 4.λDNA(电泳 23.5 h后加样 ,分别为 0.5 , 2.5 , 5, 10μg);5～ 8 ,11,
14和 15.1/ 8 ,1/ 4, 1/ 2 ,1 ,1 , 1/ 3和 1/6块胶(来自黄化再生苗嫩叶);10.MidRange PFG Marker ;12 ,13.1/ 2 ,1/ 4块胶(来自成熟绿叶)
YM.Yeast Chromosome PFG Marker;I-IV.Agarose plug slice by four methods;1-4.λDNA(After 23.5 h, 0.5, 2.5, 5 ,10μg);5-8 ,
11 ,14, and, 15.1/ 8 ,1/ 4, 1/ 2 ,1 ,1 , 1/ 3 ,and ,1/ 6 agarose plug slices from the regenerate leaves;10.MidRange PFG Marker;12 ,13.1/2 , 1/ 4
agarose plug slices fom the old leaves
图 2　脉冲电泳分析 4 种方法制备的 DNA
Fig.2　Pulsed field gel electrophoresis(PFGE)analysis of DNA prepared from the four methods
26　 华　北　农　学　报 22卷
　　图3中Ⅱ和Ⅲ所示 ,用BioRad公司的 plug mold 1所
制100μL的胶块加样电泳后进行2 Mb以上DNA的回
收 ,由于加样时各胶块间的重叠或空隙 ,导致回收的
DNA在胶块中分布不均匀 ,且损失大。图 3-a , b所示
Ⅳ,用自制的 plug mold 2所制 2.4 mL的长胶块加样电
泳后进行 2Mb以上DNA的回收 ,先切下图3-a的1 ,2 ,
14和 15泳道的胶在EB染色后 ,按Marker横切标记好
不同大小范围的位置(图 3-b),取出后拼接复原成原来
的电泳全胶状态 ,对照 5 个标记位置将 3 ～ 13 道的
DNA琼脂糖胶横切成 6条 ,分别回收用于后继试验检
测 ,其中按 A位置回收的 11 cm 的长胶中含所需的 2
Mb以上DNA ,与Ⅱ相比同样有效去除了叶绿体等的污
染[ 5] ,利于后续酶切和提高基因组文库的质量 ,同时
DNA的损失只有10%～ 30%,明显低于Ⅱ的 50%,而且
DNA在长胶块中的分布均匀 ,因而所回收的 DNA 浓度
相同 ,每 100μL胶块中含有约 25 μg的 2Mb以上 DNA
(表1)。
YM.Yeast Chromosome PFG Marker;Ⅱ, Ⅲ.回收第Ⅱ, Ⅲ种方法制备的 2Mb以上DNA;a , b.第 IV种方法制备的 2Mb以上
DNA被回收前 、后;1 ,15.Yeast Chromosome PFG Marker;2～ 14.12 cm长胶(2.4 mL)中间 11 cm部分在 EB染色前被切下用于回收
YM.Yeast Chromosome PFG Marker;II and III.The over 2Mb DNA recovered from the second and third method;a and b.Situation
before and after recovering the over 2Mb DNA d from the fourth method;.1 , 15.Yeast Chromosome PFG Marker(NEB);2-14.11 cm of
12 cm agarose plug slices(2.4mL)were cut before dyed with EB for recovering
图 3　脉冲电场电泳回收多枝赖草 2 Mb以上 DNA
Fig.3　The over 2 Mb DNA of Leymus multicaulis recovered through PFGE
表1　用 4 种方法从 25 g多枝赖草叶中所制备 2 Mb以上 DNA的质量和产率
Tab.1　Yield and purity of over 2 Mb DNA prepared from four methods with 25 g leaves of Leymus multicaulis
方法
Method
胶块(100μL)数
Plugs
2 Mb以上 DNA含量/(μg/块)
Content of DNA
over 2 Mb
2Mb 以上 DNA总量/μg
Grossof DNA
over 2 Mb
2 Mb 以上 DNA产率/(μg/g)
Yieldof DNA
over 2 Mb
2Mb 以下的 DNA
DNA less than
2Mb
叶绿体和线粒体 DNA
DNA from
mitochondrial and
chloroplast
Ⅰ 15 18 270　　 1.08 有 有
Ⅱ 45 10 450　　 18 无 无
Ⅲ 18 20 360　　 14.4 有 有
Ⅳ 96 25 2 400　　 96 无 无
2.3　多枝赖草 2 Mb以上核 DNA的部分酶切
在LMP胶块中 DNA酶切效果主要与DNA浓度 、
酶量 、胶重量 、反应体积 、时间 、温度 6个因素密切相
关 ,固定后 4个容易人为调控的函数变量后 ,通过不
同梯度小量酶切测定所回收同一长胶块的最佳酶用
量为每 0.05 g 胶片 2 ～ 4 U的 Hind III 。由于回收长
胶块中2 Mb以上DNA 的浓度相同(图 3-a ,b),所以 ,
按所确定最佳酶用量进行大量酶切 ,获得了理想的酶
切效果。通过脉冲电泳回收含 A ～ E(图 4)5组不同
大小范围 DNA片段的胶块 ,电洗脱 、浓缩和脱盐后调
整浓度约为 25 ng/μL。
2.4　细胞器 DNA的污染检测
检测结果(图 5)表明 ,只有经过脉冲电泳纯化后
的DNA没有阳性信号 ,说明排除了细胞器 DNA的污
染。I和电泳回收前的 IV虽经采用多次差速离心去
除大部分线粒体 ,借助于TritonX-100特异地破坏叶绿
体膜后 ,使杂交信号相对减弱 ,但仍不能完全排除细
胞器 DNA的污染;III使用了TritonX-100处理 ,只是简
单离心清洗 ,杂交信号相对较强;II 既没有 TritonX-
100处理 ,又只是通过简单离心 ,因而杂交信号强度仅
次于作为阳性对照的叶绿体和线粒体基因。该结果
与已有报道[ 5 ,14]相符。
2.5　Mb级 DNA制备方法的综合比较
综合比较结果列于表 1 ,可见Ⅱ和Ⅲ得到 2 Mb以
上核DNA的纯度一样 ,但是Ⅳ的含量和产率明显高
于Ⅱ,主要一方面由于粗略离心和清冼后 ,杂质颗粒影
响细胞核浓度的调整和制胶 ,另一方面Ⅳ提高了材料
的利用率和2 Mb以上DNA的回收率。
6期 徐粤宇等:多枝赖草基因组Mb级 DNA 制备和酶切方法的优化 27　
M.Low Range PFG marker;1.E, 145.5～ 291 kb;2.D , 97.0～
194 kb ;3.C ,48.5～ 145.5 kb;4.A , 9.42～ 23.1 kb;5.B ,23.1～
48.5 kb;6.透析后的胶块;7～ 9.λDNA(50 ng , 100 ng ,200 ng)
M.Low Range PFG marker;1.E, 145.5-291 kb;2.D, 97.0-194kb;
3.C ,48.5-145.5 kb;4.A , 9.42-23.1 kb;5.B , 23.1-48.5 kb;
6.Plug slice by dialysis;7-9.λDNA(50 ng ,100 ng , 200 ng)
图 4　脉冲电泳测定酶切 DNA 片段大小和浓度
Fig.4　Concentration and size determination by digested
DNA fragment through PFGE
1.线粒体 psbA基因;2.叶绿体 atp6 和atp9 基因;3, 7.方法 II , IV未经
PFGE纯化的DNA;4 , 5.方法 III , I的 DNA;6 ,8.方法 II , IV经 PFGE纯
化的 DNA;9 ,10.酶切后电冼脱A-B , C-E的 DNA片段
1.Mitochondrial psbA gene;2.Chloroplast atp6 and atp9 gene;3 , 7.DNA
from the second and fourth method before PFGE;4, 5.DNA from the third
and first method;6, 8.DNA from the second and fourth method af ter PFGE;
9 , 10.DNA fragment from A-B and C-E digested and dialysis
图 5　核 DNA的纯度检测
Fig.5　Purity test of nuclear DNA
3　讨论
根据拟南芥[ 8] 、水稻[ 8 ,13 , 15] 、小麦[ 16] 等的成功
报道 ,一般用植物幼苗更容易得到高质量的 Mb级
DNA。由于本试验研究的多枝赖草 ,种子发芽特慢 ,
且叶片细小 ,室内发芽难以长出足够量的黄化幼嫩
叶片供DNA的制备;室外无性繁殖虽快 ,但田间正
常生长条件下的多枝赖草“幼嫩”叶片的木质化程度
太高 ,往往叶鞘居多 ,而且酚类等次生物质积累较
多 ,不利于 Mb 级 DNA 的制备 。所以采用在浓度
0.4%(m/m)NaCl 的人工模拟盐池中遮光培养的黄
化再生苗叶为材料 ,使其叶绿体的光反应和相关代
谢不旺盛 ,机械组织和输导组织不发达 ,相对于正常
光照条件下有更多未分化的分生组织大核细胞 ,而
更适于Mb级 DNA的制备 。
本研究通过比较分析前人提取大分子量 DNA
的方法 ,结合多枝赖草的特点 ,提出了一种高产率高
纯度的Mb级 DNA制备的优化方法 ,主要改进点有:
①使用吸附力小的钢丝细胞筛过滤细胞核 ,操作方
便 ,能多次清洗过滤剩余物 ,充分抽提材料中的细胞
核;②再次回收第一次离心上清 ,减小细胞核损失 ,
进一步提高了细胞核浓度;③包埋时使细胞核浓度
调整到 108个/mL ,以增加 Mb 级 DNA 在胶块中含
量;④细胞核包埋时用自制的 plug mold 2制成连续
的长胶块(12×0.2×1 cm=2.4 mL),方便了脉冲电
泳加样和回收 ,避免了小胶块(0.5×0.2×1 cm =
100μL)加样时产生重叠或空隙 ,从而使回收 2 Mb
以上 DNA在胶块中分布均匀 ,浓度相同 ,损失率低 ,
并且有利于小量酶切测定最佳用酶量的准确性 ,从
而使后继大量酶切能够得到理想的酶切效果 ,并具
有良好的可重复性 。并与已报道[ 5 ,8 , 11] 的 3种方法
同时进行试验比较 ,结果表明本研究所提出的方法
解决了一直影响大片段基因组人工染色体文库构建
过程中DNA浓度低 ,以及糖 、蛋白质 、酚类物质 ,细
胞器 DNA 、大杂质颗粒和其他小分子量 DNA污染的
问题[ 14] ,更适于大多数植物Mb级 DNA的制备。
为了得到更好的酶切效果 ,即 2 Mb 以上 DNA
尽可能多的在 Hind Ⅲ酶切位点被切开 ,且酶切后尽
可能多分布在选择范围内 ,首先必须减少 2Mb以上
DNA的机械断开 ,最好 Mb级 DNA没有酶切前不要
离开 LMP凝胶固相和减少人为切割 ,其次按 2 Mb
以上 DNA的浓度 、胶重量 、胶体积等为参照 ,先作小
量酶切测定同一批次回收胶的最佳用酶量 ,后再大
量酶切脉冲电泳回收一定范围的 DNA 片段 。用我
们设计的酶切效果最佳定量法对Mb级DNA进行酶
切 ,有利于文库构建的后续工作。而且所需 DNA片
段大小范围可以通过小量测定设计 ,适应于各种文
库的要求 。同时我们充分利用脉冲电泳技术测定
Mb级 DNA 的浓度 、大小 ,特别是回收 DNA 方法保
证了 DNA浓度高 、选择大小和预期相合 。
用该方法获得的酶切电冼脱各大小范围的
DNA片段已构建了多枝赖草基因组可转化人工染
色体(TAC)文库。
参考文献:
[ 1] 　王世金.小麦族植物作为牧草种质资源的初步评价
[ J] .草业学报 , 1993 , 2(1):60-69.
[ 2] 　葛荣朝 ,赵茂林.赖草属的优良基因导入小麦的研究进
展[ J] .河北师范大学学报 , 2001 , 25(4):512-516.
[ 3] 　郭光艳 ,李瑞芬 ,张敬原 , 等.小麦微卫星引物对多枝赖
草基因组 DNA 扩增的研究[ J] .华北农学报 , 2004 , 19
(1):1-4.
[ 4] 　郭光艳 ,李瑞芬 ,张敬原 , 等.利用 SSR鉴定普通小麦-
多枝赖草二体异附加系 Line24中外源染色体同源群的
归属[ J] .华北农学报 , 2004 , 19(4):14-17.
[ 5] 　伏健民 ,邱　芳 , 谢纬武 ,等.植物高纯度大分子量 DNA
28　 华　北　农　学　报 22卷
的快速 、简便制备方法[ J] .科学通报 , 1998 , 43(23):
2570-2572.
[ 6] 　Cheung W Y , Gale M D.The isolation of high molecular
weight DNA from wheat , barley , and rye for analysis by
pulsed-field gel electrophoresis[ J] .Plant Mol Biol , 1990 , 14:
881-888.
[ 7] 　Wing R A , Rastogi V K , Zhang H B , et al.An improved
method of plant megabase DNA isolation in agarose mi-
crobeads suitable for physical mapping and YAC cloning[ J] .
Plant J , 1993 , 4:893-898.
[ 8] 　Liu Y G ,Whittier R F.Rapid preparation of megabase plant
DNA from nuclei in agarose plugs and microbeads[ J] .Nucle-
ic Acids Res , 1994 , 22(11):2168-2169.
[ 9] 　殷剑美 , 张天真.基于棉花 BAC 文库的大片段核 DNA
的提取方法[ J] .分子植物育种 , 2004 , 2(3):354-357.
[ 10] 　葛荣朝 ,张敬原 , 赵宝存 , 等.一个耐盐小麦-多枝赖
草二体异附加系外源染色体的鉴定[ J] .中国农业科
学 , 2006 , 39(1):193-198.
[ 11] 　Zhang H B , Zhao X, Ding X , et al.Preparation of megabase-
size DNA from plant nuclei[ J] .Plant J , 1995 , 7:175-184.
[ 12] 　刘　越.矮败-中国春小麦品系 BAC 文库的构建与筛
选[ A] .北京:中国农业科学院 , 2003:10-40.
[ 13] 　Liu Y G , Liu H M , Chen L T , et al .Development of new
transformation-competent artificial chromosome vectors and
rice genomic libraries for efficient gene cloning[ J] .Gene ,
2002 , 282(1/2):247-255.
[ 14] 　邱　芳 , 伏建民 ,王　斌.从植物细胞核提取大分子量
核 DNA[ J] .植物学报 , 1999 , 41(11):1204-1207.
[ 15] 　Zhang H B , Choi S D , Woo S S , et al.Construction and
characterization of two rice bacterial artificial chromosome
libraries from the parents of a permanent recombinant inbred
mapping population[ J] .Mol Breed , 1996 , 2:11-24.
[ 16] 　Liu Y G , Nagaki K , Fujita M , et al.Development of an effi-
cient maintenance and screening system for large insert ge-
nomic DNA libraries of hexaploid wheat in a transformation-
competent artificial chromosome(TAC)vetor[ J] .Plant J ,
2000 , 23(5):687-695.
6期 徐粤宇等:多枝赖草基因组Mb级 DNA 制备和酶切方法的优化 29