全 文 ：大赖草总 DNA转化小麦叶片 mRNA差异显示技术中总 RNA提取和反转
录活性研究
李 静 1, 2 ,赵民安 1 ＊,郝秀英 3 ,王晓军 1 ,曹玉锦 1, 2 ,胡石开1, 2 ,唐晓义1, 2　(1.中国科学院新疆理化技术研究所 , 新疆乌
鲁木齐 830011;2.中国科学院研究生院 ,北京 100049;3.新疆农业科学院微生物应用研究所 ,新疆乌鲁木齐 830000)
摘要　[目的]研究大赖草总DNA转化小麦叶片mRNA差异显示技术中总RNA的质量及反转录活性。 [方法]在大赖草总DNA转化小
麦幼苗叶片mRNA差异显示相关试验中 ,利用改进的 TRIzol法 ,从幼苗叶片中提取总 RNA,紫外光谱分析 , 1.2%琼脂糖电泳检测 ,并进
行随机引物RT-PCR扩增。 [结果] OD260nm /OD280nm比值为 1.95～ 1.98;总RNA和RT-PCR电泳条带均表现出整齐 、清晰。 [结论 ]获得的总RNA质量好、纯度高 ,有很高的反转录活性 ,完全适合于进一步的分子生物学研究。
关键词　大赖草总 DNA转化小麦;差别显示;RNA;提取;反转录活性
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)11-04917-03
StudyonTotalRNAExtractionandAnti-transcriptionActivityfromTransgenicWheatLeaveswithTotalDNAofLeymusracemosus
(Lam.)TzvelinmRNADiferentialDisplayingTechnology
LIJingetal　(XinjiangTechnicalInstituteofPhysicsandChemistry, ChineseAcademyofSciences, Urumqi, Xinjiang830011)
Abstract　[ Objective] Thepurposewastostudythequalityandanti-transcriptionactivityoftotalRNAfromtransgenicwheatleavesindiffer-
entialdisplayingtechnology.[ Method] IntherelevantdiferentialdisplaytestofmRNAfromtransgenicwheatwithtotalDNAofLeymusracem-
osus(Lam.)Tzvel, totalRNAwasextractedfromseedlingleavesbyusingmodifiedTRIzolmethod.AndtotalRNAwasdeterminedbyUV-
spectroscopicanalysisand1.2% agarosegelelectrophoresis.ThenRT-PCRamplificationwasmadebyusingrandomprimers.[ Result]
OD260nm /OD280nm wasfrom1.95to1.98.ThebandsoftotalRNAandRT-PCRwereclearandorderly.[ Conclusion] TheobtainedtotalRNAhadgoodqualityandhighpurityandanti-transcriptionactivity.Itwassuitableforthefurthermolecularbiologicalresearch.
Keywords　TransgenicwheatwithtotalDNAofLeymusracemosus(Lam.)Tzvel;Diferentialdisplay;RNA;Extraction;Anti-transcription
activity
基金项目　新疆农业科学院院长基金项目。
作者简介　李静(1983-), 女 ,新疆玛纳斯人 , 硕士研究生 ,研究方向:
植物分子生物学。 ＊通讯作者 , 研究员 , E-mail:zhaominan@
yahoo.com.cn。
收稿日期　 2009-02-01
　　小麦(TriticumaestivumL.),单子叶植物纲禾本科小麦
属 ,遍及全国各地 , 北起黑龙江的漠河 ,南到海南岛 ,西至新
疆 ,东抵沿海 ,南北跨越寒 、中 、暖三带及各类型的亚热带及
热带 , 是我国第二大粮食作物。目前对小麦的研究不仅限
于组培 、化学成分分析及其食用价值等方面 ,在分子水平上
的研究也日益受到重视 [ 1] 。
大赖草(Leymusracemosus)是新疆和中亚地区特有的禾
本科小麦亚族赖草属植物 ,是培育小麦新品种的优良亲本 。
由于远缘杂交困难 , 20世纪 90年代笔者用大赖草总 DNA花
粉管通道法转化栽培品种春麦 761,并获得大穗 、高蛋白和抗
病的变异植株大赖草总 DNA转化小麦 [ 2] ,通过同位素标记
杂交 ,证实约 2%的大赖草基因进入了转基因大穗小麦之
中 [ 3] ,采用 DDRT-PCR技术研究转基因大穗小麦与受体春麦
761之间的差异表达 ,则有可能获得有用的信息 ,将已转入小
麦的大赖草优良性状基因分离出来 。
mRNA差异显示(mRNAdiferentialydisplay)是由 Liang
和 Pardee于 1992年创立的一种快速 、简便的分离未知样品
新基因的技术 [ 4] 。 1994年 EricHaay等将这种方法正式命名
为差异展示反转录聚合酶链式反应(DiferentialyDisplayRe-
verseTranscripionPolymeraseChainReaction, DDRT-PCR)。
自 1992年创立这项技术以来 , mRNA差异显示技术在植物
分子生物学研究中得到了广泛应用 ,这项技术中的关键一环
就是总 RNA的提取 ,因为总 RNA提取的纯度和完整性对试
验结果有很大影响 , RNase活性很强 , RNA很容易被 RNase
降解 ,所以要得到无降解的植物 RNA一直是一个较难的问
题 ,植物细胞具有坚硬的细胞壁 ,含较多的多糖 、蛋白质及一
些不明次生代谢物 [ 5-6] 。植物缺少富含单一的 mRNA的组
织和器官 ,植物 mRNA含量较低 ,而 RNase含量丰富 、活性又
很强 ,很容易将 RNA降解 ,故无降解的总 RNA的提取更显
得困难 ,因此 ,对于植物叶片中总 RNA提取的方法在不断改
进。笔者就大赖草总 DNA转化小麦叶片 mRNA差异显示技
术中总 RNA提取和注意问题进行了探讨 ,以期为大赖草总
DNA转化小麦后续的分子克隆和基因表达分析等研究提供
基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　材料培养与取样 。大赖草总 DNA转化小麦是中国
科学院新疆理化技术研究所分子生物学实验室在 20世纪 90
年代通过花粉管通道法将新疆大赖草总 DNA导入春麦 761
后得到的转基因小麦 [ 4] ,将其种植后幼苗长至 5 ～ 8 cm时 ,
剪取幼嫩叶片作为试验材料 。
1.1.2　主要仪器与试剂 。主要仪器:EppendorfCentrifuge
5417R、EppendorfMastecyclerGradientPCR、DK-S22型电热恒
温水浴锅(上海精宏)、DYY-Ⅲ-8B稳压稳流型电泳仪(北京
六一)、TU-1800SPC紫外可见分光光度计(北京普析)。主要
试剂:焦碳酸二乙酯(DEPC)、TRIzol试剂 、DNaseⅠ、Tris、M-
MuLVFirstStrandcDNA合成试剂盒 、巯基乙醇 、锚定引物
(B0328)、随机引物(B0316)、水饱和酚均为上海生工产品 ,
其余试剂均为国产分析纯。RNA提取中所用的溶液除 Tris
外 ,均用 0.1%DEPC水处理并高压灭菌 ,含 Tris的溶液用经
高压灭菌的 DEPC-H2 O直接配制;玻璃器皿于 180℃烘烤 12
h;塑料制品等用 0.1%DEPC-H2O37℃浸泡过夜后高压灭菌。
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(11):4917-4919 责任编辑　罗芸　责任校对　卢瑶
1.2　方法
1.2.1　总 RNA的提取。采用改进的 TRIzol法提取大赖草
总 DNA转化小麦的总 RNA。①取材料 100 mg左右 ,剪碎置
于冰浴的研钵中 ,加 1mlTRIzol提取液 ,混匀 ,尽快用力研磨
至液体匀浆 ,注意样品总体积不能超过所用 TRIzol体积的
10%;②室温放置 5min,以 1mlTRIzol液加入 0.5ml的比例
加入饱和酚 /氯仿(5∶1),盖紧离心管 ,用力剧烈振荡 20 s,冰
浴 10 min;③12 000 r/min, 4 ℃离心 5 min;④将上清转移到
新的 1.5ml离心管中 ,加入等体积的氯仿 /异戊醇(24∶1),充
分混匀 ,室温静置 5 min, 12 000 r/min, 4 ℃离心 5 min;⑤将
上清转移到新的离心管中加入等体积的异丙醇 ,缓慢混匀 ,
室温静置 5min,将上清转移到新的离心管中 , 12 000r/min, 4
℃离心 5min;⑥弃去上清液 ,按照 TRIzol液与 75%乙醇体积
比为 1∶1加入 75%乙醇 ,涡旋混匀洗涤沉淀 2次 , 7 500
r/min, 4 ℃离心 5min;⑦小心弃去上清液 ,室温干燥 5 min,
注意不要干燥过分 ,否则会降低 RNA溶解度;⑧加 50 μl
DEPC-H2 O, 55 ～ 60 ℃水浴 2 min溶解 RNA, -80 ℃保存
备用。
1.2.2　总 RNA的质量检测 。
1.2.2.1　总 RNA中污染 DNA的去除 [ 7] 。无论采取哪种方
法提取的 RNA,均避免不了有少量 DNA的存在 ,为了防止对
后续的 cDNA扩增产生干扰作用 ,进行 RT-PCR操作前 ,用
DnaseⅠ对提取的总 RNA样品作纯化处理:①在 0.5 ml离心
管中依次加入下列成分:10×DnaseⅠ缓冲液 5μl,总 RNA溶
液 40 μg, DTT(0.1 mol/L)12 μl, Rnase抑制剂(40 U/ μl)1
μl, DnaseⅠ(不含 Rnase, 10U/μl)2μl,混匀后 , 37℃温浴 30
min,置于冰上;②加入 50μl的 DEPC-H2O,加入 100μl(等体
积)酚 /氯仿(3∶1),剧烈混合后 ,置于冰上 10 min, 12 000
r/min, 4 ℃离心 5min;③取上清移至新管中 ,加 10μl(110倍
体积)3mol/L醋酸钠(pH5.2), 250 μl(2.5倍体积)冷无水
乙醇 ,混匀 , -80℃放置 30 min,沉淀 RNA;④7 500 r/min, 4
℃离心 10 min,弃上清 ,用 500 μl70%乙醇(DEPC-H2 O配
制)洗涤沉淀;⑤ 7 500r/min, 4 ℃离心 10 min,弃上清 ,室温
干燥 10 min,用 20μlDEPC-H2 O溶解 RNA。
1.2.2.2　检测试剂的配制。 ①10×TBE贮液(1L):48.2 g
Tris碱 , 27.5 g硼酸 , 20 ml0.5 mol/LEDTA(pH值 8.0),用
DEPC-H2 O溶解后定容至 500 ml。 ② 0.5 mol/LEDTA(pH
值至 8.0)溶液:称取 EDTA-Na237.2 g,先加 140 mlddH2O,
加入 14 ml10 mol/LNaOH溶液 ,调节 pH值至 8.0,定容至
200ml,灭菌 20 min。③6×甘油凝胶上样液(10 ml, 4 ℃贮
存)1.5 ml1%溴酚蓝 , 1.5ml1%二甲苯青(FF), 100 μl0.5
mol/LEDTA(pH8.0), 3 ml甘油 , 3.9mlddH2 O。
1.2.2.3　RNA定性和定量检测。取 3 μl总 RNA溶液 ,用
DEPC-H2 O稀释 10倍 ,用紫外分光光度计检测 230、260、280、
300nm处的吸光光度值(OD230nm、OD260nm、OD280nm、OD300nm),
计算 OD260nm /OD280nm和 OD260nm /OD230nm。按照公式(总 RNA
浓度 =OD260nm ×40×稀释倍数)计算出总 RNA样品的浓度 [ 7] 。
1.2.2.4　总 RNA完整性检测。采用改进的 TRIzol方法抽
提大赖草总 DNA转化小麦总 RNA,所用器皿 、塑料制品 、试
剂都经过高温灭菌并进行了无 Rnase处理后 ,提取得到的小
麦总 RNA,经过 1.2%普通琼脂糖非变性凝胶电泳 ,通过凝
胶成像系统观察照相 ,根据 28S、18S及 5S3条带的清晰度和
相对含量评估总 RNA的完整性。
1.2.3　RT-PCR检测转录活性。将所得的总 RNA采用 Fer-
mentas公司的 RevertAidTM FirstStrandcDNASynthesisKit,严
格参照说明进行操作反转录合成 cDNA第一链。然后 PCR
扩增 ,锚定引物序列为 5′(AAGCTTTTTTTTTTA)3′(B0328),
随机引物序列为 5′(GATCACGTAC)3′(B0316),按照如下
程序扩增:94℃预变性 4 min;94 ℃, 40 s;46 ℃, 40 s;72 ℃,
1.5min, 40个循环;循环完毕后 72 ℃, 5min。产物在恒压 80
V, 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。
2　结果与分析
2.1　总 RNA的质量　图 1为大赖草总 DNA转化小麦总
RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳图 ,从图中可见 , RNA特异带
型清晰 、亮度好 、无背景 ,点样孔及条带其他部分干净无杂
质 , 28SrRNA的亮度约是 18SrRNA的 1.5倍 ,表明多糖和
DNA都去除完全 ,提取的总 RNA纯度好 、产率高。 280、300、
230和 260nm下的吸光度值依次代表了核酸 、背景(溶液浑
浊度)、盐浓度和蛋白等有机物的含量 。高纯度 RNA的
OD260nm /OD280nm应介于 1.8 ～ 2.0, OD260 nm /OD230nm大于 2.0。
由表 1可见 ,改进的 Trizol法从小麦苗中提取的总 RNA,其
OD260nm为 0.386 ～ 0.415, OD280nm 为 0.195 ～ 0.212,
OD260nm /OD280nm为 1.95 ～ 1.98, OD260nm /OD230nm >2.0,通过
选取不同样品 ,重复试验 ,结果稳定 ,再次表明改进的 TRIzol
法所获得的小麦总 RNA纯度高 、完整性好 ,蛋白质和其他杂
质污染极小。
图 1　大赖草总 DNA转化小麦总RNA1.2%琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.1　1.2%agrosegelelectrophoresisresultoftotalRNAintransgen-
icwheatwithtotalDNAofLeymusracemosus(Lam.)Tzvel
表 1　大赖草总 DNA转化小麦总 RNA的紫外分析结果
Table1　UVresultoftotalRNAinwheatbytotalDNAofLeymusracemosus(Lam.)Tzvel
样品
Samples OD230nm OD260nm OD280nm OD300nm OD260nm /OD280nm OD2 60nm /OD230nm
浓度∥μg/μl
Concentration
1 0.182 0.386 0.195 0.032 1.95 2.12 1.544
2 0.201 0.415 0.212 0.039 1.98 2.06 1.660
4918 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
2.2　RT-PCR　为进一步验证改进 TRIzol法提取的大赖草
总 DNA转化小麦总 RNA的完整性 、转录活性 ,以总 RNA为
模板 ,进行反转录 PCR扩增 ,结果显示(图 2),反转录获得的
cDNA条带大约在 500 ～1 500bp, PCR后有明显的 3条特异
条带 ,约分别位于 750、500、250bp,条带均亮度高 、清晰 ,表明
已成功克隆到 cDNA片段。这表明改进的 TRIzol法提取的
大赖草总 DNA转化小麦总 RNA质量好 ,具有高的反转录活
性 ,完全适用于进一步的 mRNA差异显示研究 。
注:1、2、3.PCR扩增产物;4.Marker;5.单链 cDNA。
Note:1, 2and3standforRT-PCRamplificationproducts;4, Mark-
er;5, SinglestandcDNA.
图 2　大赖草总 DNA转化小麦总 RNA的 RT-PCR产物琼脂糖
凝胶电泳结果
Fig.2　AgrosegelelectrophoresisresultofRT-PCRproductof
totalRNAinwheatbytotalDNAofLeymusracemosus
(Lam.)Tzvel
3　结论与讨论
(1)对植物材料进行 mRNA差异显示(mRNADDRT-
PCR),需提取高质量 、高反转录活性的总 RNA[ 8] 。前人已经
对植物材料葡萄 、苹果 、猕猴桃 [ 9-11] 、棉花 、瓜叶菊 、矮牵
牛 [ 12]等叶片的总 RNA提取及活性做了一定的研究 ,但是由
于植物总 RNA的提取具有很强的种属和组织的特异性 ,因
此 ,需要根据不同物种及不同组织的特性选择或改良相应的
方法 [ 13] 。影响总 RNA提取质量和转录活性的因素是多方
面的 , 如组织的破碎程度 、RNase的活性 、多糖和蛋白质等大
分子物质的存在 [ 14] ,这些物质的存在不仅影响到总 RNA的
提取效率而且还干扰以后的反转录和体外扩增 [ 15] 。笔者在
借鉴前人研究的基础上改进了 TRIzol法过程 ,选取小麦幼嫩
的苗加 TRIzol提取液冰浴研磨成匀浆进行提取 , 操作迅速 ,
整个提取过程在 1 h内完成 。由于材料鲜嫩 ,得到的结果比
较好 ,免去了在小量提取植物总 RNA中加液氮的过程 ,为一
些液氮使用不方便的实验室提供了一定的参考依据;RNase
是一类耐热 、耐酸 、耐碱的生物活性非常稳定的酶类 ,将 75%
乙醇用 DEPC-H2 O配 , RNase-free水溶液也是 DEPC处理过
的水 ,这样可除去内源性 RNase,而外源性 RNase则存在于
外界环境中的灰尘 、器皿 、试剂 、汗液 、唾液中 ,各种器皿 、耗
材等都很容易被污染 ,操作前将器皿 、耗材按文中所述方法
处理 ,以除去外源性 RNase;苯酚能使蛋白质变性 ,变性后的
蛋白质从水相中被析出 ,能有效地去除蛋白等杂质 ,是核酸
提取过程中常用的试剂 ,但如果苯酚去除不完全 ,就会直接
影响后续转录实验的进行 ,该研究采用饱和酚 /氯仿抽提可
有效地除去材料中的蛋白质等杂质 ,而避免了苯酚对后续实
验的影响;提取过程中 ,总 RNA中会混有少量的 DNA,该试
验用 DnaseⅠ降解 RNA中混入的 DNA,不但 RNA的质量不
会受到影响 ,还会因此而提高总 RNA的产率。 RT-PCR的结
果显示此方法得到的总 RNA转录活性也较高 ,完全可以用
于后续实验。
(2)笔者采用改进了的 Trizol法成功地获得了高质量的
RNA,其纯度高 、完整性好 、转录活性高 ,但因 RNA易降解 ,
所以提取实验仍有一定的难度 ,笔者的体会是:①材料的量
不是越多越好 ,如材料过量 ,那么多糖 、多酚及内源性 RNase
的量就较大 ,而溶液的处理水平有限 ,通常会出现不同程度
的多糖 、多酚污染或 RNA的降解;②提取的全过程必须在清
洁无尘的环境中进行 ,操作时使用一次性手套 ,并且要减少
走动;③提取过程中取上清时 ,动作要轻 ,一定不要取到中间
层 ,这也关系到 RNA提取的质量 。④实验最好在冰上操作 ,
低温下酶的活力低 , RNA降解慢;⑤用非变性琼脂糖电泳鉴
定 RNA的完整性即可 ,操作简便 ,其结果完全可以作为判断
RNA质量的标准 ,而并非必须采用有毒性的甲醛变性琼脂糖
电泳;⑥反转录过程是整个实验的关键步骤 , 可先将 RNA置
于冰上 ,但要避免反复冻融 ,在鉴定完总 RNA质量后立即进
行反转录 ,此时效果最好 ,若保存一段时间再进行反转录 ,效
果会降低 ,因为即使 RNA置于 -70 ℃保存 ,仍会有一定的
降解。
该研究获得的总 RNA可满足多数分子生物学实验的需
求 ,为进一步研究大赖草总 DNA转化小麦和对照受体小麦
的 mRNA差别显示及相关突变基因提供了基础。
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