全 文 ：　　　　　　　
第 27 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 6
2001 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2001
用m RNA 差别显示方法分析黑麦盐胁迫下应答基因 cD NA
片段的表达特性Ξ
王振英ΞΞ　郑坚瑜
(南开大学生命科学学院分子生物学研究所, 天津 300071)
提　要　利用mRNA 差别显示方法分析经 250 mmo löL N aC l 处理 3d 的黑麦幼苗, 14 个差异 cDNA
片段, 包括 8 个诱导表达片段, 2 个增强表达片段和 4 个抑制表达片段被检测到。N o rthern B lo t 分析
证实, 其中 0. 8 kb、0. 65 kb 和 0. 35 kb cDNA 片段有强烈阳性信号, 命名为 S I800、S I650、S I350 (Salt
Induced 800 bp、650 bp、350 bp ) , 证明与盐胁迫有关。以 S I800为探针与分别经盐胁迫 3d、7d、14d 的
黑麦幼苗总体RNA 杂交, 表明其表达产物随盐胁迫时间的延长而增加。
关键词　差别显示; 盐胁迫; 黑麦; N o rthern B lo t; 总体RNA
Stud ies on the Express ion Character iza tion of cD NA Fragm en t of
Early Respon sive Gene of Rye Induced by Sa lt Stress Using
Techn iques for D ifferen tia lly Expressed m RNA D isplay
W AN G Zhen2Y ing　ZH EN G J ian2Yu
( Institu te of M olecu lar B iology , N anK ai U niversity 300071, Ch ina)
Abstract 　 　 Fou rteen differen t ia l exp ression cDNA fragm en ts, includ ing 8 induct ion
exp ression fragm en ts, 2 in ten sive exp ression fragm en ts and 4 inh ib it ion exp ression
fragm en ts. have been detected in rye seed lings trea ted w ith 250mm o löL N aC l fo r 3d by u sing
the techn iques fo r d ifferen t ia lly exp ressed m RNA disp lay. N o rthern b lo t ana lysis ind ica ted
tha t 0. 8 kb, 0. 65 kb and 0. 35 kb cDNA fragm en ts have obviou sly hyb rid signa l, nam ed
S I800, S I650, S I350 (Sa lt induced 800 bp , 650 bp and 350 bp ). It though t to be rela ted to sa lt
st ress. T he exp ression p roducts w ere increased obviou sly a t the d ifferen t ia l sa lt st ress t im e
w hen to ta l RNA s iso la ted from N aC l trea ted rye leaves fo r 3d, 7d and 14d respect ively, w ere
hyb rid ized to the S I800 p robe.
Key words　　D ifferen t ia l d isp lay; Sa lt st ress; R ye; N o rthern B lo t; To ta l RNA
土壤的盐渍化对植物的生长造成很大的影响, 因此对植物耐盐机理研究一直受到研究者
们的高度重视[ 1～ 3 ]。植物在遇到高盐等不良环境条件时, 体内会产生一系列的生理、生化变
化, 使其与环境条件相适应而得以生存。迄今为止, 这方面的研究已积累了相当丰富的资料,
如发现植物在盐胁迫时, 细胞内一些具有渗透保护作用的有机分子 (糖类、脯氨酸、多胺、甜ΞΞΞ 现工作单位: 天津师范大学生物系
收稿日期: 2000209225, 接受日期: 2001201210
Received on: 2000209225, A ccep ted on: 2001201210天津市重大导向性攻关项目 (2000～ 2002)资助, 本文为第一作者博士论文工作的部分内容

菜碱等) 累积增加[ 4～ 6 ], 一些与盐相关的组织特异蛋白[ 7～ 9 ]诱导产生等。然而, 上述研究虽然
为植物耐盐机理的理解提供了十分有用的资料, 但植物的耐盐特性既受个体发育的生理、生
化条件环境变化所制约, 同时也受系统发育的遗传基因所控制。植物在长期的进化过程中形
成的耐盐特性与遗传因素有密切的关系。近 10 多年来, 尽管很多研究者也从遗传的分子机理
上探讨植物的耐盐特性, 并相继在很多作物中克隆了与耐盐性有关的结构基因[ 7～ 9 ], 对耐盐
基因的表达特性及染色体定位也有初步的工作报道, 但与耐盐生理、生化所揭示的实验结果
相比还相对滞后。近几年来, 我们以黑麦为材料, 在完成对其盐胁迫后的耐盐特性、耐盐蛋
白的生化性质及可能的与耐盐性的关系[ 10 ]、耐盐性相关的 RA PD 分子标记检测做了系统分
析[ 11 ]后, 利用m RNA 差别显示方法, 对盐胁迫应答基因的差异表达做了初步分析, 结果报
道如下。
1　材料与方法
1. 1　材料
取黑麦 (S eca le cerea le) 当年种子 2 份, 各 50 粒, 安替福民消毒后, 水冲洗干净, 27℃温
箱内萌发 3 d, 再在光照下培养 3 d, 一组用水培作为对照, 另一组用含有 250 mm o löL N aC l
水溶液培养, 每天换液, 3 d 后, 分别收获叶片备用。
1. 2　总体 RNA 的提取
取 0. 2g 黑麦叶片, 在液氮中, 迅速研磨成粉末, 加入提取缓冲液 (4 m o löL 的硫氰酸胍;
N aA c, pH 4. 2) , 用酸性苯酚和氯仿抽提后, 异丙醇沉淀总体 RNA , 70% 的乙醇洗涤沉淀 3
次, 去掉盐分, 用适量的D EPC 处理过的 ddH 2O 溶解RNA , 总体RNA 的产量和纯度通过紫
外分光光度法进行测定, OD 260öOD 280的比值大于或等于 2. 0 的 RNA 样品, 再经 1. 0% 的琼
脂糖凝胶电泳, 确定 28S RNA 和 18S RNA 的亮度比为 2∶1 左右, 证明RNA 样品的完整性
较好, 可以用于 cDNA 的合成。
1. 3　RNA 样品中痕量D NA 的去除
取 5 Λg 总体 RNA 样品, 加入 25 ΛL D EPC 处理的 ddH 2O , 再加入 3 ΛL 10×DN ase I
buffer、1 ΛL RN asin、1 ΛL DN ase I(RN ase free) , 混匀, 室温下作用 15 分钟; 25 mm o löL
ED TA 灭活DN ase I, 酚仿抽提后, 加入 51 ΛL 糖原、51 ΛL KA c 及 120 ΛL 无水乙醇, 混匀,
沉淀RNA , 12000 röm in 离心 (T GL 216G2A ) , 75% 乙醇洗涤沉淀, 吹干后溶于适量D EPC 处
理的 ddH 2O 中, - 20℃保存。
1. 4　总体 RNA 的反转录及 PCR 扩增
在所有m RNA 锚定引物群体的 12 种O ligodT 12M V 中, 随机O ligodT 12GC 为 cDNA 第
一链合成引物, 以黑麦对照和盐胁迫的叶片总体RNA 为模板, 在逆转录酶 (T aKaR a)的作用
下, 进行反转录, 反应体系为 20 ΛL , 其中总体RNA 1 Λg; 5 Λm o löL O ligodT 12GC (上海生工
合成) ; 10 Λm o löL 的 dN T P s; 4 ΛL Buffer (5×) ; AM V 200 U。反应条件: 25℃, 5 m in;
42℃, 1h; 95℃, 5 m in。合成的 cDNA 用于 PCR 扩增或存放在- 20℃冰箱中保存。cDNA 的
PCR 扩增采用与反转录相同的锚定引物作为下游引物, 上游采用 10 碱基随机引物 (购自上海
生工) , 总体系为 25 ΛL : cDNA 1 ΛL , dN T P 2 Λm o löL , 下游引物O ligodT 12GC 2. 5 Λm o löL ,
上游引物 (10 m er 随机引物) 0. 5 Λm o löL , 0. 25U 的 T aq p lu s (上海生工)。将上述组分在涡旋
混合器上混匀, 瞬间离心收集, 在 PE2400PCR 仪上进行扩增, 扩增条件为: 94℃变性 4 m in;
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94℃变性 15s, 40℃复性 30s, 72℃延伸 30s; 35 各个循环, 72℃补齐 7 m in。
1. 5　cD NA 片段的凝胶电泳分析
所得的 PCR 产物在 1. 4% 的琼脂糖凝胶中上分离, EB 染色, 紫外灯下观察照相记录。有
差异带的立即在相同条件下进行重复实验, 重复 3 次差异带仍然存在的, 可用低熔点胶将剩
余的 PCR 产物进行电泳分离, 切下差异带备用。
1. 6　差异 cD NA 的回收和再扩增
在低熔点胶切下的差异 cDNA 带, 放在一干净的事先称重的离心管中, 称重, 以 3 mL ög
胶重的比例加入 T E (pH 8. 0) , 65℃水浴使胶熔化, 加入等体积的酚仿抽提, 取上清冷乙醇沉
淀后, 离心, 70% 乙醇洗涤沉淀 2 次, 10 ΛL 水溶解沉淀, 取 5 ΛL 进行二次扩增, 反应条件同
前, 所得产物经琼脂糖凝胶电泳确认后, 再次用低熔点胶纯化后, 可直接用于探针的标记。
1. 7　Northern Blot 分析
取 30Λg 总体RNA , 经甲醛变性胶电泳 (含 EB ) , 0. 5 m o löL N H 4A c 洗胶去除甲醛, 紫外
灯下观察 28S 和 18S rRNA 带的亮度, 以保证电泳的效果后, 将RNA 转移到尼龙膜上 (方法
见分子克隆实验方法) , 80℃烘干 2 小时以固定RNA。随机引物法制备32P 标记的 cDNA 探
针, 42℃预杂交 4h 后, 加入 cDNA 探 针, 杂交过夜 (12h 以上)。2×SSC, 0. 1% SD S 少量洗
膜 (回收) 15 m in。2×SSC, 0. 1% SD S; 1×SSC, 0. 1% SD S; 0. 1×SSC, 0. 1% SD S; 0. 1×
SSC 洗膜各 1 次, 每次 15 m in。所得的膜用保鲜膜包好, 压上X 光片, - 20℃曝光 10d。
1. 8　差异 cD NA 片段的表达特性分析
分别取黑麦对照和盐胁迫下 3d、7d、14d 的幼苗叶片提取总体 RNA , 各取 30 Λg 总体
RNA 在甲醛变性胶上电泳并转膜, 以差异 cDNA 为探针进行N o rthern B lo t 分析, 预杂交、
杂交、洗膜、压片、曝光等同 1. 7。
2　实验结果
2. 1　m RNA 的差别显示与 cD NA 片段的 PCR 扩增
我们以O ligod T 12GC 为锚定引物, 反转录合成了对照和经 250 mm o löL N aC l 胁迫 3d 的
cDNA 第一链, 再以该链为模板, O ligod T 12GC 为下游的特异引物, 取 50 个 10 m er 的随机
引物为上游引物进行RCR 扩增, 结果表明, 所有 50 个随机引物都能扩增出谱带, 谱带数在 1
～ 8 条之间, 分子量处于 200～ 3000 bp 间。表 1 和图 1 所示为对照和经盐胁迫后的 cDNA 差
表 1　　黑麦叶片对照和盐胁迫下差异表达的 cD NA 片段
Table 1　　D ifferen tia l display cD NA s of rye
引物 P rim ers
序号　N o. 序列　Sequences
盐胁迫　Salt stress
诱导表达
Induced exp ression
增强表达
In tensive exp ression
抑制表达
Inh ib it ion exp ression
S269 GT GA CCGA GT 1. 7 kb
S271 CT GA T GCGT G 2. 1 kb, 1. 8 kb 0. 8 kb
1. 7 kb
S263 GTCCGGA GT G 0. 7 kb
S268 CA CT GCCTCT 0. 48 kb
S61 T TCGA GCCA G 1. 6 kb, 1. 7 kb 0. 65 kb
S68 T GGA CCGGT G 0. 7 kb
S78 T GA GT GGGT G 1. 5 kb
S267 CT GGA CGTCA 0. 7 kb 0. 35 kb
3586 期　　　王振英等: 用mRNA 差别显示方法分析黑麦盐胁迫下应答基因 cDNA 片段的表达特性　　　　

图 1　　盐胁迫和未经盐胁迫黑麦叶片的mRNA 差别显示
1, 4, 6, 9, 11, 14, 16, 19 泳道为未经N aC l 胁迫的黑麦叶片 cDNA ; 2, 5, 7, 10, 12, 15, 17, 20 泳道为经 250
mmo löL N aC l 胁迫 3d 的黑麦叶片 cDNA 箭头→示诱导表达 cDNA 片段; → 示增强表达 cDNA 片段; ] 示抑制表
达 cDNA 片段
F ig. 1　　D ifferen tial disp lay of mRNA in leaves of the contro l rye and treated w ith 250 mmo löL N aC l fo r 3days.
L ane 1, 4, 6, 9, 11, 14, 16, 19 w ere cDNA s of contro l rye leaves, lane 2, 5, 7, 10, 12, 15, 17, 20 w ere cDNA
of rye leaves treated w ith 250 mmo löLN aC l fo r 3days. A rrow → indicates induct exp ression cDNA fragm ents; →
indicated in tensive exp ression cDNA fragm ents; ] indicates inh ib ito ry exp ression cDNA fragm ents
异片段, 统计结果表明, 约有 14 个差异片段被找到, 其中包括盐胁迫后诱导表达的 8 个, 增
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强表达的 2 个和抑制表达的 4 个。我们着重对引物 S271 在盐胁迫的 cDNA 中扩增得到一诱
导表达增加的特异 cDNA 片段 (命名为 S I800 Salt Induced 800 bp )进行了耐盐特性分析。
2. 2　盐胁迫后应答 cD NA 片段的 Northern blot 分析
为排除假阳性结果, 我们对上述差别显示的 cDNA 片段在进行 2 次 PCR 扩增后
N o rthern B lo t 分析。其中 4 个差异片段由于回收的DNA 量少而没有再扩增出来, 其余 10 个
均有二次扩增结果。以该 10 个差异片段为探针, 分别与对照和盐胁迫的总体 RNA 进行杂
交, 结果表明有 3 个差异表达的 cDNA 片段显示出较为强烈的阳性杂交信号 (图片未列出) ,
而其它 7 个 cDNA 片段则未显示信号, 估计是假阳性结果, 故未做进一步分析。图 2a 为S I800的 2
次 PCR 扩增结果, 2b 则是以S I800为探针, 与对照和盐胁迫总体RNA 的N o rthern B lo t 结果, 可
以看出, 在对照的RNA 中, 该探针有微弱的杂交信号, 而经盐胁迫后, 其表达量增加显著。
图 2　　盐胁迫差异 cDNA 片段的二次 PCR 扩增与N o rthern B lo t 分析
a. S I800的二次扩增; b. 以 S I800片段为探针与对照和盐胁迫总体RNA 杂交结果 (RNA 上样量为 30 Λg)
F ig. 2　　Second PCR amp lification and N o rthern B lo t analysis of differen tial exp ression cDNA
fragm ent of rye treated w ith 250 mmo löL N aC l
a. Second PCR amp lification of 0. 8kb fragm ent; b. To tal RNA s iso lated from rye nontreated
and treated w ith N aC l w ere hybridized to labelled 0. 8kb cDNA p robe
2. 3　　SI800在盐胁迫下的表达
图 3 是以 S I800为探针, 分别与未经盐胁迫和分别经 250 mm o löL N aC l 胁迫 3d、7d、14d
的总体 RNA 杂交结果, 在未经盐胁迫的对照中表达量极少, 但经盐胁迫的幼苗中, 其表达
量迅速增加, 并且随胁迫时间的延长其表达量的增加呈现出正相关性, 可以认为盐胁迫可以
强烈而迅速地诱导其转录产物的积累。为了证明新增加的表达产物是由于盐胁迫诱导的结果
而不是实验操作上的误差, 我们展示了总体 RNA 的变性胶电泳图谱, 上样量均为 30 Λg (图
3b)。表明图 3a 中得到的表达量的增加, 确实是由于盐胁迫后差别m RNA 的增加所形成的。
3　讨论
植物耐盐机理的生理生化研究已相当深入[ 12 ] , 但分子生物学机理研究起步较晚, 而且较
难深入[ 13 ]。虽然9 0年代初C laes等克隆了盐诱导水稻愈伤组织中特异表达蛋白的cDNA
5586 期　　　王振英等: 用mRNA 差别显示方法分析黑麦盐胁迫下应答基因 cDNA 片段的表达特性　　　　

图 3　黑麦 S I800在 250 mmo löL N aC l 胁迫下的表达
a. 以 S I800为探针, 与 250mmo löL N aC l 胁迫 0d、3d、
7d、14d 黑麦叶片总体RNA 的杂交结果
b. 250 mmo löL N aC l 胁迫 0d、3d、7d、14d 黑麦
叶片总体RNA 变性胶电泳 (上样量均为 30 Λg)
F ig. 3　T he exp ression of 0. 8kb in the rye
treated w ith 250 mmo löL N aC l
a. 30Λg to tal RNA of rye leaves stressed by
250 mmo löL N aC l fo r 0d、3d、7d、
14d w ere hybridized w ith 0. 8kb
b. 30 Λg to tal RNA of rye leaves stressed by
250 mmo löL N aC l fo r 0d、3d、7d、14d
(Sa lt) [ 3 ] , 并且相继植物耐盐基因的分子克隆
及其表达调控研究取得很大进展[ 1 ] , 通过转基
因技术提高植物耐盐特性的报道也屡见不
鲜[ 14 ] , 但迄今为止还没有得到真正耐盐植物,
说明对于植物耐盐分子机理的研究还相对滞
后。m RNA 差别显示技术的建立为研究耐盐基
因在不同组织、不同器官、不同环境条件及不
同发育时期的差异表达提供了可能, 为植物耐
盐分子机理研究提供了很多有价值的实验结
果。
　　目前这一研究技术也已广泛应用与抗性基
因如抗干旱、耐低温和抗病特性的分子机理研
究中[ 15, 16 ]。我们利用m RNA 差别, 显示技术
分析黑麦幼苗在盐胁迫下的基因差别表达, 在
盐胁迫黑麦幼苗中 14 个差异表达的 cDNA 被
检测到, 这些差异表达的 cDNA 有 3 种类型,
诱导表达型、增强表达型和抑制表达型。
N o rthern B lo t 排除了假阳性结果后, 证明其中
有 3 个差异表达 cDNA 与盐胁迫直接有关, 其
中 S I800随盐胁迫时间的延长, 其m RNA 的积
累量呈正相关性增加。推测 S I800可能是一个盐
胁迫应答基因片段。
我们曾同样以黑麦为材料, 经盐胁迫后双相电泳分析幼苗中蛋白质组分的变化, 同样检
测新蛋白质组分诱导形成、原组分增量和一些蛋白质组分被抑制表达 (南开大学学报, 2001)
3 种类型, 这一结果与本研究中m RNA 的差异显示所得结果相一致。因此, 从生化和分子水
平上为耐盐机理的理解提供了一些实验依据。
参　考　文　献
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