全 文 ：第 2 5 卷 第 2 期
2 ) (X 4年 6 月
热 带 作 物 学 报
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斑茅 2 0 5 蛋白酶体 a 亚基 5 基因
的克隆与序列分析
余爱丽 姚 伟 徐景升 张木清 陈如凯 *
(福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室 福州 35 0 02 )
摘要 进行 了甘蔗属近缘野生种— 斑茅抗逆性基因克隆的研究 。 以斑茅为材料 , 用 R A C E 技术克隆了斑茅的 20 5 蛋白酶体 a 亚基 5 基因 , 其编码区为 7 l bP ,编码 2 37 个氨基酸 , 并于 g e n b肚止 分析其核普酸和推导的
氨基酸序列的同源性 , 用 C lus at 坟 ~ in
n 1
.
8 软件分析其系统进化关系 。 结果表明 , 物种间蛋白酶体进化保守 ,
其核昔酸序列与水稻 、 大豆 、 剑叶辞属植物的相应基因同源性分别为 91 % 、 81 % 、 80 % ; 其氨基酸序列与水稻 、
大豆 、 剑叶辞属植物的同源性分别达 97 % 、 95 % 、 86 % , 与人的同源性也高达 69 % 。
关键词 斑茅 RA CE 20 5 蛋白酶体 Q 亚基 5
中圈法分类号 Q 781
斑茅 (百减少王ht 公 蒯翔孟几配e , ) 是甘蔗属 的近缘野生种之一 lIJ 。 斑茅抗早 、 耐瘩 、 抗病 虫性强 , 宿根性
好 , 分萦多 , 生长快 , 具有广泛的适应性 2I] 。 自发现天然甘蔗实生苗进而开创甘蔗杂交育种新纪元 以来 ,
斑茅一直受到育种家们的重视 , 努力把斑茅的优 良性状基因通过杂交转入甘蔗中 , 从而提高甘蔗的抗
逆抗病能力 ; 可是 , 甘蔗与斑茅的杂种一代花粉少 、 不育 , 致使斑茅的优 良基因难以利用 。 为此 , 笔者 以
斑茅为研究材料 , 利用分子生物学方法从斑茅中克隆出与其抗逆性有关的基因 , 试图为寻找和 利用斑
茅的优 良性状基因莫定一定的基础 。 蛋 白酶体 ( p or te as om e) 是一种具有多种蛋 白水解功能的大分子复合
物 , 在细胞内蛋白质的降解过程中起重要作用 。 它是由一个沉降系数为 205 的核心 ( 205 p oert as om e) 和附着在两端的调节复合物结合而成 , 复合物主要起识别蛋 白质和 调节蛋 白酶体生物活性的作用 3[] 。 2 0 5
蛋 白酶体是降解蛋 白质的核心部分 , 它是由不 同的亚单位 (分子质量约为 21 一35 k u) 组成的 四环状 圆
柱型结构 , 两外环由 7 种不同的 a 亚单位组成 , 而两内环则 由 7 种不同的 p 亚单位组成 。 a 和 p 亚
单位在结构上具有同源性问 。 蛋白酶体主要通过泛素依赖和非泛素依赖的 2 种途径对蛋 白质进行降解 3IJ 。
蛋白水解通路的发现被认为是细胞降解 、 细胞恶性转化和细胞免疫学研究的转折点 l7] 。 本研究获得斑茅
的 2 0 5 蛋 白酶体 “ 亚基 5 的 c D N A 序列 , 并分析其核普酸序列和氨基酸序列 , 为进一步研究蛋白酶体
在植物细胞的新陈代谢 、 机体防御 、 蛋 白降解中的作用和功能提供基本的研究材料 。
1 材料和方法
L l 材料及试剂
斑茅采 自福建农林大 学 , 种植于温室中 , 用 30 ~ 。比 氯化钠胁迫 , 3 d 后采样 。 irT oz l 购 自 G ibe 。公司 ; S州叭丑T侧 R A CE c D N A A m p l i if ca it on 刃 t 购自 cl on ect h 公司 ; -X gal 、 IP GT 和 pMD 18一 T v e c otr 购 自
T幼妞R泊公 司 ; E . 。 01 1 D H S Q 为本实验室保存菌种 ; U肛Q一 10 柱式 D N A 胶回收试剂盒购 自上海生物工程
公司 ; 叉七a l 和 S a ir 购 自 Por m e ga 公司 。
L Z 方 法
用 irT oz l 提取总 R N A , 电泳检测其完整性 , 用 s M A RT 侧 R A C E c D N A A m p lif c a tion 幻 t 反转录成
cD N A
, 以 c翻aL at c g a c ot ac t a t a g g c 为引物进行 RT 一PCR 。 cP R 反应程序 : 94 ℃变性 30 5 、 68 ℃退火 30 5 、
7 2 ℃延伸 3 m in , 2 个循环 ; 9 4 ℃变性 3 0 5 、 6 6 ℃退火 3 0 5 、 7 2 ℃延伸 3 m in , 2 个循环 ; 94 ℃变性 3 0 5 、
基金项 目: 863 计划课题 ( 2加 ZA声2 4 1 19 1 ) ;国家科学基金课题 ( 30 17 05 90 )
余爱丽 女 , 1 973 生 , 博士研究生 。 研究方向 : 作物生理遗传与分子育种 。 E一 ial :目 j扣@ e姗 9 .~ . 通讯作者
.
收稿日期 : 20 3一 1 1一25 修回日期 : 2X() 4一-5 14
热 带 作 物 学 报 2 5卷
64 ℃退火 30 5、 7 2 ℃延伸 3 mi n , 2 个循环 ; 94 ℃变性 30 5 、 62 ℃退火 30 5 、 72 ℃延伸 3 m in , 4 个循环 ;
9 4 ℃变性 3 0 5 、 6 0 ℃退火 3 0 5 、 72 ℃延伸 3 n五n , 25 个循环 ; 保持 4 ℃ 。 将扩增的 c D N A 片段 回收 , 与
pM D 1 8
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T ve ct or 连接 , 转化 E . 。 01 D H S 。 , 菌落在含有 x 一gal 和 IP GT 的平板上进行蓝白斑筛选 , 分别选取若干 白斑进行 PC R 和酶切鉴定 , 阳性克隆由博亚公司测序 。提交 C七n B an k , 对其核昔酸序列和推演的
氨基酸序列进行分析 , 用 D N A M叭N 软件比较其推导氨基酸序列 , 并用 a us alt x ~ ion 1
.
8 ( hT o m Pson
等 8I] ) 软件分析其系统进化关系 。
2 结果与分析
2
.
1 c D N A 的合成和克隆质粒验证
以总 R N A 为模板 , 反转录成单链 c D N A , 电泳结果见图 1 。 由图 1 可 见
P c R 产物插入 pM D 18一 v e c otr 获得重组质粒 p TE妙 , 2 个重组质粒经 x万aI
克隆 。 图 2 中 , pTE 妙 n 双酶切 1 . 2 kb 产物 , 即为 目的片段 。
M 1 M 1 2 3 4 5 6
.4 5 冲 和 1 . g kb 两条带 。 将
和 S a l 单双酶切 , 筛选阳性
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图 1 斑茅 口 RN A 反转录 c D N A
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M ar ker (生工 SM 0 3 2 1) : l , PT EAP I 质粒 D N A : 2 PET AP l质粒 D N A ; 3 , Xb a l 单酶切 p ET AP I: 4 , X b o l 单醉切 川甩妙 11:
5
, 捌 I单醉切广E A夕 I; 6 , 枷 I单酶切 p T EAF l ; 7 , X b a l 和胭 I 双酶切 p住lA, l: 8 , X b a 【和 扭 I 双醉切 pET 妙 1 ;
圈 2 斑茅 20 5 蛋白阵体 Q 亚基 S 质粒单双阵切产物
.2 2 蛋白酶体亚基基因的核昔酸序列及分析
斑茅蛋白酶体亚基全长 1 057 饰 , 5 ’端非编码区 10 5 bP , 3 `端非编码区 2 l4 bP , 编码区 l7 l bP , 编码
23 7 个 氨 基 酸 。 在 N CB I 网 站 用 B LA S T 搜索软件 进行 同源 性基 因 检索 , 结 果在 罗 n如舰山+ EM -
B L十 D D B J+ P D B 数据库中显示 18 条同源性序列 。 比对结果表 明 , c D N A 与 已知的水稻 ( O yrz a S at i o a)
20 5 蛋白酶体 Q 亚基 5 的同源性为 91 % ; 与大豆 (砂” ien ~ )20 5 蛋 白酶体亚基同源性为 81 % : 与拟南芥 20 5 蛋 白酶体 Q 亚基 P A E Z 同源性为 82 % ; 与拟南芥 20 5 蛋 白酶体 。 亚基 P A卫 1 同源性为
81 % ; 与只有部分序列的普通烟草 (从亡口坛断心励ac unz ) 20 5 蛋白酶体 。 亚基 5 的同源性为 82 % ; 与剑
叶醉属 (八” co m众er “ a p以 e 、 ) 的 2 0 5 蛋 白酶体 “ 亚基 5 同源性为 80 % 。 并于 h即洲认周切即 .ib o in fo n n at -
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.心p r o t` an a lys i澎 is 即 a l . hmt l 网站分析此序列可能不含信号肤 。
斑茅 20 5 蛋白酶体 Q 亚基 5 测序结果和推演的氨基酸序列如下 。
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2 期 余爱丽 等 :斑茅 02 5 蛋白酶体 Q 亚基 5 基因的克隆与序列分析 57
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2 .3 斑茅蛋白酶体亚墓的推导氨基酸序列分析
D N A M A N 软件分析斑茅蛋白酶体亚基的推导氨基酸序列和比较了水稻 、 拟南芥 、 人 、 鼠 、 醉类 、 大
豆等的同类基因氨基酸序列的异同 , 其与水稻的一致性高达 97 % , 与大豆 的一致性为 95 % , 与拟南芥
(A ar b记叩痴 乃` 拓价 ) 蛋 白酶体 。 亚基 PAE I 和 Q 亚基 P AE Z 同源性都为 94 % , 与 .P p at e 。 同源性
86 %
, 与人 ( oH mo s叩 ie 。 ) 蛋白酶体 Q 亚基 5 同源性为 69 % , 与鼠 ( R at us . sP . ) 类蛋 白酶体 。 亚基 5
同源性为 68 % , 与一种酵母菌 (及 h七os ac c haor 刀岁 c e : p o bnz 。 ) 的同源性为 “ % , 与利什曼原虫 ( eL 站h lan -
n她 爪匀份 ) 的同源性仍有 60 % 。 这说明此蛋 白酶体亚基物种间保守性比较强 。
斑茅蛋白酶体亚基推导氨基酸序列与其他物种相关序列的比较结果如下 :
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5 8 热 带 作 物 学 报 2 5卷
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2 期 余爱丽 等 : 斑茅 20 5 蛋 白酶体 Q 亚基 5 基因的克隆与序列分析
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; 拟南芥产卫汉 352 5( A . ht 心ian PA E Z ) ;剑叶醉属沪 J 4 l 804 l( .P p aet 。 ) ; 酵
母 菌 , AL 109 8 8 ( 5
. 尸 o m b e ) ; 利 什 曼 原 虫 , AL 1 6 3 5 o s ( L
. 了呵 o r ) ; 人 ,B c o l 0 7 o g ( H . : 叩沁。 ) ; 鼠 ,
N M 0 17 2 8 2 ( R
.
SP
.
)
。
.2 4 斑茅蛋白酶体亚基推导氨基酸序列 的系统进化分析
用 C lus at lx ~ ion 1
.
8 软件 , 对斑茅蛋白酶体亚基和 g e n ban k 中已知的蛋白酶体亚基进行系统进化
分析 。 如图 3 所示 , 斑茅在生物系统进化中 , 总体符合分类学进化关系 。 植物界中斑茅与水稻的进化关
系最近 , 与大豆和拟南芥的关系较近 , 与剑叶醉属最远 ; 在其他生物类中 , 斑茅与原生生物酵母菌关系
较远 , 与人和鼠更远 , 与 利什曼原虫最远 。
S
,
p o m be
参 比序列为 : 斑茅 ( E . ar o n d in ac 。 “ : ) ; 水稻 , A B 0 2 6 5 6 1 ( 0 . : a “ , 。 ) : 大 豆 , ^ F 2 5 5 3 3 8 ( G . 二。
PA E I )
;拟南芥产卫侧 3 52 5 ( A . ` 以化曰 PA E Z ) : 剑叶辞属沪J 4 1804 1 ( .P 夕以 e 。 ) :醉母菌 , A L 109 9 8 8
; 拟南芥 , N M I 0 4 2 6 2 ( A . t h al i a n
5
.
p o 川必e ) : 利什曼原虫 , A L 16 3 50 5
( L
.
m甲份 ) : 人 , B C 01 07 0 ( H . :甲肠na ) ; 鼠 , N M 0 17 2 82 ( R . 甲 . ) : 自展次数为 1 0X() 次 , 分枝处的数字表示 自展支持率 。
圈 3 斑茅 20 5 蛋白酶体 Q 亚基 5 与 g叨b a n k 中的其他物种相关墓因的系统进化树
3 讨 论
本研究对克隆的斑茅 c D N A 序列于 g e n b a n k 进行同源分析 , 并用 D N A M叭N 软件比较其氨基酸序
列 , 由于其与水稻 205 蛋 白酶体 Q 亚基 5 核昔酸序列和氨基酸序列同源性分别达 91 %和 97 % , 因此
确定其为斑茅 20 5 蛋白酶体 a 亚基 5 。 由其系统进化结果看出 , 生物界蛋 白酶体的进化保守 , 斑茅蛋 白
酶体亚基与水稻同源性最高 , 与藻类的同源性高达 86 % , 与人和鼠的同源性也分别达 69 %和 68 % 。 目
前医学界正在研究蛋白酶体在人体内对蛋白降解的规律 , 蛋白酶体对人体内废物蛋 白如何起作用 , 如
何利用其降解毒性蛋白 , 以及其与人体免疫力的关系等 。 既然植物体 内也存在蛋白酶体 , 而且其与动物
体内的同源性也较高 , 那么植物体内蛋白酶体与动物体内蛋 白酶体二者的作用是否相似 , 是否也与植
物体内的蛋白降解和防御机制有关 , 还需进一步研究 。 本研究实现了斑茅蛋白酶体的核心部分— 205蛋白酶体 Q 亚基 5 基因的克隆 , 将为研究植物体内蛋白降解和植物防御机理提供理论基础 。
60 热 带 作 物 学 报 2 5卷
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