全 文 ：江西农业学报 2011，23(12) :31 ～ 33
Acta Agriculturae Jiangxi
蝴蝶兰叶绿体 DNA微卫星分析与标记开发
张君毅
收稿日期:2011 －11 －15
基金项目:福建省农业科技重点项目(2009N0041) ;华侨大学中央高校基本科研业务费资助项目(JB － ZR1115)。
作者简介:张君毅(1978─) ，男，博士，主要从事药用植物资源学研究。
(华侨大学 生物工程与技术系，福建 厦门 361021)
摘 要:为开发兰科植物叶绿体微卫星(cpSSR)引物，对台湾蝴蝶兰叶绿体全序列进行 cpSSR统计分析。结果表明台湾
蝴蝶兰 SSR以单碱基重复为主，占总数的78． 3%。在单碱基重复中又以A和 T重复为主，占95． 8%。重复方式以完全重复为
主，占总数的 70%。开发出 3对 cpSSR引物。
关键词:蝴蝶兰;叶绿体 DNA;叶绿体微卫星
中图分类号:S682． 31 文献标识码:A 文章编号:1001 －8581(2011)12 －0031 －03
Microsatellite Analysis of Chloroplast DNA in Phalaenopsis aphrodite
subsp． formosana and Its Marker Exploitation
ZHANG Jun － yi
(Department of Bioengineering ＆ Biotechnology，Huaqiao University，Xiamen 361021，China)
Abstract:In order to develop the chloroplast microsatellite (cpSSR)primer from arethusa，the cpSSR statistical analysis of the
chloroplast complete sequence of Phalaenopsis aphrodite subsp． formosana in Taiwan was conducted． The results showed that the SSR
of Phalaenopsis aphrodite subsp． formosana in Taiwan was mainly mononucleotide motif SSR，which accounted for 78． 3% of the total．
Repeat A and T were the main base in mononucleotide motif SSRs，accounting for 95． 8% ． The repeat units were mainly pure SSRs，
accounting for 70% of the total． Meanwhile，three pairs of cpSSR primers were developed．
Key words:Phalaenopsis aphrodite subsp． formosana;Chloroplast DNA;cpSSR
叶绿体微卫星(chloroplast simple sequence rpeat，
cpSSR)具有微卫星(simple sequence repeat，SSR)标记共
显性、高多态性、分布广泛性等优点，也保持了叶绿体基
因组(chloroplast DNA，cpDNA)结构简单、相对保守、单
亲遗传等特点［1］。cpSSR作为近年来发展起来的一种高
效的分子标记技术，已广泛用于植物种质资源群体遗
传［2］、物种演化［3 －4］、种群分类［5］等研究中。
兰科植物因在自然界杂交的缘故，中间类型多，变
异较大，给属间、属内种的分类和整理带来了较大的困
难，给进一步杂交培育新品种带来不便。应用 cpSSR 技
术将是较为理想选择，关键问题是 cpSSR 的引物开发。
随着生物信息的发展，烟草(NC － 00187)、玉米(NC －
001666)、水稻(NC － 005973)等多种植物的叶绿体全序
列已被测出。这为 cpSSR 引物开发提供了一种简便高
效方法，并已在烟草［6］等植物上研究成功。目前兰科植
物只有台湾蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite subsp． formo-
sana E． A． Christ．)的叶绿体序列被全部测出。本文以台
湾蝴蝶兰 cpDNA全序列为模板，分析其 cpSSR的分布特
点和规律，为兰科植物叶绿体通用引物开发打下基础。
1 材料与方法
1． 1 SSR搜索与分析 从 GenBank(http:/ /www． ncbi．
nlm． nih． gov /)下载台湾蝴蝶兰叶绿体全序列(NC －
007499)。采用 SciRoKo 3． 1 软件(www． kofler． or． at /
Bioinformatics)搜索 SSR，设定单核苷酸、二核苷酸、三核
苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复分别为
10、5、4、4、3、3次，包括中间被少数碱基(间隔小于 3 bp)
打断的不完全重复的 SSR。用 BVTech Plasmid 1． 0 软件
绘制台湾蝴蝶兰 cpSSRs分布图。
1． 2 引物设计 用 Primer 5． 0 软件对含有 SSR 的 EST
序列进行引物设计，尽量避免引物二级结构的出现。引
物设计主要参数为:引物长 17 ～ 23 bp;引物退火温度 50
～60 ℃，正向和反向引物退火温度之差在 5 ℃以内，GC
含量40% ～70%;PCR预期产物长100 ～500 bp。引物由
上海生物工程技术服务有限公司合成。
1． 3 cpSSR －PCR扩增 20 μL PCR反应体系包括:50
ng DNA模板，0． 2 mmol /L dNTPs，正反向引物各 0． 4 ng /
μL，1 × Buffer，2 mmol /L MgCl2，1． 0 U Taq 酶，所用试剂
均购自宝生物工程(大连)有限公司。
PCR扩增反应条件是:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变
性 30 s，合适温度退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环;
72 ℃延伸 10 min。各引物的合适退火温度根据引物合
成报告单而定。6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 PCR 产
物，快速银染法染色。
1． 4 引物筛选与通用性分析 用蝴蝶兰属(Phalaenop-
sis)的“台林红天使”(Phalaenopsis Tai Lin Redangel
“V31”)等品种验证引物的有效性。此外，选择其他属内
及属间种或杂交种以检验引物在兰科植物的通用性，包
括“国王”(Dendrobium Red Emperor“Prince”)、“伊丽莎
白”(Bulbophyllum Elizabeth Ann“Buckleberry”)、“天母”
(Cattleya Orglade’s Grand“TM”)、“白仙女”(Degar-
moara Winter Wonderland “White Fairy”)、“小金鱼”
(Rhyncattleanthe Ahchung Yoyo“LittleGoldfish”)、腋唇兰
［Maxillariellatenuifolia (Lindl．)M． A． Blanco ＆ Carneva-
li］和万代兰(Vanda coerulea Griff．)等 7种植物。
2 结果与分析
2． 1 cpSSR的丰度 台湾蝴蝶兰 cpDNA全序列大小为
148964 bp，共搜索到微卫星 61 个，总大小为 784 bp，占
cpDNA的0． 53%。由图1看出，cpSSR分布范围较广，从
1375 bp到 142821 bp的基因分布区和间隔区均有分布。
但分布并不均衡，出现几个集中的分布区，如 1375 ～
10628 bp，66442 ～ 71943 bp，116935 ～ 123221 bp 等区间。
集中区覆盖范围约 27 kb 占 cpDNA 18． 3%，SSR长度占
cpSSR总大小的 57． 3%。在大单拷贝区(large single －
copy region，LSC)分布着 41 个 SSR 位点(68． 3%) ，小单
拷贝区(small single － copy region，SSC)则分布了 12 个
SSR位点(20． 0%) ，两个反向重复序列(inverted repeat
sequenc，IR)SSR 位 点 较 少，共 有 7 个 SSR 位 点
(11． 7%)。
图 1 台湾蝴蝶兰叶绿体微卫星分布
2． 2 重复基元分布 对台湾蝴蝶兰 cpSSR重复基元进
行统计分析，见表 1。单碱基微卫星 47 个，占总数的
78． 3%。以碱基 A 为标准基元的 cpSSR 占单碱基微卫
星的 95． 8%，其中 A 重复为 20 个，占 42． 6%，T 重复为
25个，占 53． 2%。二碱基微卫星 8个，占总数 13． 3%，以
(AT)n 为标准基元 cpSSR 占二碱基微卫星的 62． 5%，
(AG)n为 25%，这与植物基因组中 SSR以(AT)n、(AG)
n两种最多的规律基本一致。此外，三碱基微卫星 4 个，
占总数的6． 7%，四碱基、五碱基和六碱基微卫星各1个，
分别占总数的 1． 7%。可见，在台湾蝴蝶兰 cpDNA 中微
卫星是以单碱基重复为主，这与水稻［7］等植物的研究结
果一致，且随着重复单元碱基数量增加其相应 cpSSR 的
出现频率逐渐降低。
2． 3 重复方式分布 微卫星重复方式主要有 3 种:完全
重复、间断重复和复合重复。在台湾蝴蝶 cpSSRs 中，从
单碱基到六碱基重复方式分布情况见图 2(cpSSRs 数量
少，多碱基重复属于何种类型在图中不易看清，建议用列
表表示)。完全重复为 42 个，占总数的 70%，其中单碱
基重复 30个，二碱基重复 6个，三碱基重复 4 个，五碱基
和六碱基重复各 1个。间断重复为 13，占总数的21． 7%，
均为单碱基重复，其中 1个碱基插入为 9 个，2 个碱基插
入为 4个。复合重复为 5 个，占总数的 8． 3%，其中单碱
基重复 2 个，单碱基与二碱基重复 2 个，四碱基重复
1个。
23 江 西 农 业 学 报 23 卷
表 1 台湾蝴蝶兰 cpSSR统计
SSR类型 标准
基元
cpSSR
基元
SSR
数量
基元百
分率 /%
总百分
率 /%
Mononucleotide A A 20 42． 6 75． 0
T 25 53． 2
C C 1 2． 1 3． 3
G 1 2． 1
Dinucleotide AT AT 2 25． 0 8． 3
TA 3 37． 5
AG TC 1 12． 5 3． 3
GA 1 12． 5
AC CA 1 12． 5 1． 7
Trinucleotide AAT TTA 1 25． 0 5． 0
ATA 1 25． 0
TAT 1 25． 0
AAG TTC 1 25． 0 1． 7
Tetranucleotide AAAT TATT 1 100 1． 7
Pentanucleotide AAGAT ATCTT 1 100 1． 7
Hexanucleotide AAATAG ATAGAA 1 100 1． 7
图 2 不同 SSR基元在 cpSSR中的分布
2． 4 重复次数分布 cpSSR 存在方式大多是以 A 或 T
单碱基的重复为主。在台湾蝴蝶 cpSSRs 中单碱基重复
次数最高为 15 次，最低为 10 次，且随着重复次数增加，
其微卫星数量呈现减少的趋势，见图 3。以 A 和 T 单碱
基 cpSSR为例，当重复次数为 10 时，A和 T 的 cpSSR分
别为11个和14个，当重复次数为13时，A和 T的 cpSSR
降至 1个。
图 3 单碱基 A和 T完全重复分布
2． 5 cpSSR有效性 在蝴蝶兰 cpDNA 中有 61 个 SSR
位点，其中 30个位点可以设计引物。随机选择其中 5 对
引物进行验证，见表 2。“台林红天使”PCR 扩增结果显
示，引物 cpSSR1 和 cpSSR5 没有得到扩增产物，引物
cpSSR2、cpSSR3和 cpSSR4 得到了预期的扩增片段。并
且 cpSSR3在兰科不同种属“台林红天使”、“天母”、“小
金鱼”、万代兰(V． coerulea)的供试材料中表现出多态性
和通用性，见图 4。
表 2 蝴蝶兰 cpDNA SSR引物
引物 正向引物 (5) 反向引物 (5→3) SSR单元 Tm 位置
cpSSR1 GCCAATGTCAACCACTCAAA CGGGCAACCCATCAAAC (A)13 50 1375
cpSSR2 ACCTCGTATTTTACCCTCTGCT GAATCCACTTATTTCTGCTGCTT (A)10 51 14478
cpSSR3 TGAATACCTTTACGCTTTGACG TGGGAAAATGGGAAGACGA (T)12 50 16938
cpSSR4 CGGGGCTATCAACCACTCA TCCCTCGCTTCGTCAAAA (A)10 50 37224
cpSSR5 TCCATTTACCACCCTTCCTT TTTCAGCGTCACAAACCATT (T)10 50 71657
1:台林红天使 －1;2:国王;3:伊丽莎白;4:天母;5:白仙女;
6:小金鱼;7:腋唇兰;8:台林红天使 －2;9:小金鱼;10:万代兰
图 4 cpSSR3引物 PCR扩增结果
3 讨论
兰科植物是开花植物中最大的家族之一，而且是单
子叶植物中高度演化的科。为有效进行兰科植物的分类
和品种鉴别，一些叶绿体序列和核糖体序列被用于提供
分子水平的证据。如测定 nrITS、matK和 trnL － F序列揭
示指甲兰亚族演化［8］，鉴别非洲和南亚鸟足兰属植
物［9］。但其研究费用相对较高，且有时扩增效率较低，因
此分子标记技术被广泛应用于兰科植物的研究中，包括
RAPD、RFLP、ISSR、SSR 和 AFLP 等标记［10］。SSR 标记
以其共显性、易操作、重复性好和分布广泛性等优点应用
更为广泛。但 SSR 引物具有物种的保守性，所以开发
SSR引物是应用的关键。用数据库搜索的方法开发 SSR
相对于筛选基因组文库法、微卫星富集法、省略筛库法等
传统方法，具有省时、省力、低成本等优点［11］。本文深入
分析研究台湾蝴蝶兰 cpSSR特征，设计开发引物。相对
于 EST － SSR而言，cpSSR 具有更好的通用性，如 Cheng
等［12］从 22对水稻、黑松、烟草的 cpSSR中仅筛选出 9对
(下转第 37页)
3312 期 张君毅:蝴蝶兰叶绿体 DNA微卫星分析与标记开发
越来越重要的作用，提高江西省农产品的国际国内竞争
力，而且在改善农业生产条件、推动传统农业向现代农业
的历史性转变中也将产生积极的影响。当前，江西省正
在加快实施“绿色崛起”的战略目标，落实“三个基地，一
个后花园”的战略定位，江西省设施园艺迎来大发展的
历史机遇，相信江西设施园艺将能够在国内外市场竞争
中脱颖而出，并取得可持续性的发展。
参考文献:
［1］农业部设施园艺发展对策研究课题组．我国设施园艺产业发
展对策研究［J］．现代园艺，2011(4) :13 －16．
［2］刘发万，钟利，尹艳琼，等． 云南省设施园艺发展现状及对策
［J］．中国农学通报，2009，25(1) :125 －127．
［3］邱流文，喻晚之．江西省设施蔬菜生产现状及“九五”发展对策
［J］．长江蔬菜，1997(8) :4 －7．
［4］张亚红，陈青云，陈端生．我国南方设施园艺气候区划的研究
［J］．中国生态农业学报，2003，11(4) :36 －39．
［5］中国统计年鉴数据库(挖掘版) ［EB /OL］． http:/ / tongji． cnki．
net /kns55 / index． aspx．
［6］国家统计局农村社会经济调查司．中国农村统计年鉴(2011
年) ［M］．北京:中国统计出版社，2011:136．
［7］江西省统计局，国家统计局江西调查总队． 江西统计年鉴
(2011年) ［M］．北京:中国统计出版社，2011:275．
［8］陈光宇． 芦笋无公害生产技术［M］． 北京:中国农业出版
社，2005．
［9］何科佳．发展湖南设施园艺，提高农业整体效益［J］．湖南农业
科学，2010(24) :14 －17．
［10］朱进，别之龙，袁尚勇． 湖北省设施蔬菜现状、问题及对策
［J］．华中农业大学学报，2004，35(增刊) :14 －17．
［11］周才春，周歆，双巧云． 把江西建设成为国家优质蔬菜供应
“大菜园”的建议［J］．现代园艺，2011(6) :29 －31．
［12］党选民，刘昭华，杨衍，等．海南发展设施园艺的现状及适宜
类型探讨［J］．长江蔬菜，2007(12) :4 －6．
［13］郭世荣．江苏省设施蔬菜发展现状及可持续发展对策［J］．内
蒙古农业大学学报，2007，28(3) :269 －273．
［14］王宏丽，邹志荣，周长吉．西北地区设施园艺发展现状与对策
探析［J］．上海交通大学学报:农业科学版，2008，26(5) :377
－381．
［15］李天来．论设施农业在我国农业发展中的战略地位及今后发
展方向［J］．华中农业大学学报，2004，35(增) :1 －3．
［16］李天来．论设施农业在我国农业发展中的战略地位及今后发
展方向［J］．温室园艺，2011(3) :
櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗
25 －26．
(上接第 33页)
能用于柑橘胞质研究，通用性比例为 40． 91%。拟南芥
叶绿体 SSR引物在甘蓝上的通用性比例为 55． 17%［13］。
本文研究也证实蝴蝶兰 cpSSR 引物在兰科植物具有一
定通用性，期望该技术能成为研究和利用兰科植物资源
的一种高效的手段。
参考文献:
［1］骈瑞琪，李伟，李娜，等．蒺藜苜蓿叶绿体微卫星分布规律的研
究［J］．安徽农业科学，2008(9) :3531 －3534．
［2］Moran M E，Vedel F，Raquin C，et al． Maternal inheritance of a
chloroplast microsatellit emarker in controlled hybrids between
Fraxinus excelsior and Fraxinus angustifolia［J］． Mol Ecol，2002，
11(3) :613 －617．
［3］Heuertz M，Fineschi S，Anzidei M，et al． Chloroplast DNA varia-
tion and postglacial recolonization of common ash(Fraxinus excel-
sior L．)in Europe［J］． Mol Ecol，2004，13(11) :3437 －3452．
［4］Xu H，Abe J，Gai J，et al． Diversity of chloroplast DNA SSRs in
wild and cultivated soybeans:evidence for multiple origin of culti-
vated soybean［J］． Theor Appl Genet，2002，105(5) :645 －653．
［5］Sukhotu T，Kamijima O，Hosaka K． Nuclear and chloroplast DNA
differentiation in Andean potatoes［J］． Genome，2004，47
(1) :4625．
［6］Grivet D，Heinze B，Vendramin G G，et al． Genome walking with
consensus primers application to the large single copy region of
chloroplast DNA［J］． Mol Ecol Notes，2001，1(4) :345 －349．
［7］ Ishii T，McCouch S R． Microsatellites and microsynteny in the
chloroplast genomes of Oryzaand eight other Gramineaespecies
［J］． Theor App Genet，2000，100:1257 －1266．
［8］ Kocyan A，Vogel E F，Conti E，et al． Molecular phylogeny of
Aerides (Orchidaceae)based on one nuclear and two plastid
markers:A step forward in understanding the evolution of the
Aeridinae［J］． Mol Phylogenet Evol，2008，48(2) :422 －443．
［9］Vander N T，Peter L H． Dealing with incongruence in the quest for
the species tree:a case study from the orchid genus Satyrium［J］．
Mol Phylogenet Evol，2008，47(1) :154 －174．
［10］武海，蹇黎，朱利泉．中国兰花资源分子标记鉴定研究进展
［J］．生物技术通报，2010(9) :56 －60．
［11］常玉梅，李绍戊，梁利群，等．微卫星标记的制备策略［J］．中
国生物工程杂志，2005(S1) :210 －214．
［12］Cheng Y J，Guo W W，Deng X X． cpSSR:A new tool to analyze
chloroplast genome of Citrus somatic hybrids［J］． Acta Botanica
Sinica，2003，45(8) :906 －909．
［13］张扬勇，方智远，王庆彪，等．拟南芥叶绿体 SSR引物在甘蓝
上的应用［J］．园艺学报，2011，38(3) :549 －555．
7312 期 温小华:江西省设施园艺发展现状与对策