全 文 ：第 30 卷 第 2 期 热 带 作 物 学 报 Ｖｏｌ．30 Ｎｏ．2
2009 年 2 月 ＣＨＩＮESE ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＴＲＯＰＩＣＡＬ ＣＲOPS Feb ．２００9
斑茅 NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析
阙友雄， 许莉萍 *， 林剑伟， 张木清， 陈如凯
福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室， 福州 350002
摘要 根据已知 NBS-LRR 抗病基因 [含有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复（LRR)的胞内受体蛋白基因] NBS
结构域蛋白质的保守序列， 设计简并引物， 对斑茅基因组进行体外扩增， 获得了对应区段的 DNA 片段， 回收、
克隆这些特异片段， 测序分析， 共获得 8 个片段序列。 序列分析发现其中 7 个编号分别为 RGA-Q1、 RGA-Q2、
RGA-Q3、 RGA-Q4、 RGA-Q5、 RGA-Q6 和 RGA-Q7 的片段推导的氨基酸序列均具有典型的 NBS 结构域， 即 P-
loop(GGVGKTT)、 Kinase-2a(VLDDVW)、 Kinase-3a(GSR/KILVTTR)及疏水结构域 HD(hydrophobic domain)。 它们在
NCBI 上的登录号为 EU685828、 EU685829、 EU685830、 EU685831、 EU685832、 EU685833 和 EU685834。 这些抗病
基因同源片段（RGA）与已经克隆的 N、 L6、 RPS2和 Mi等 11个抗病基因在氨基酸水平上的同源性为 2.3％～39.8％，
可进一步用作斑茅抗病候选基因的分子筛选及遗传图谱的构建。
关键词 班茅； 保守区域； 抗病基因同源序列； 简并引物
中图分类号 S566； Q781
抗病基因克隆对于培育抗病作物新品种和研究病原物与寄主作物之间互作的分子机制具有重要的意
义。 迄今， 已经从植物中克隆了 50 多个抗病基因。 根据这些抗病基因编码蛋白质的结构特征， 可以将除
玉米抗圆斑病基因 Hml（Helminthosporium carbonum susceptibility1）外的其他基因分为 4 大类， 即： 含有核
苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复（LRR)的胞内受体蛋白基因； 丝氨酸 ／苏氨酸蛋白激酶(STK)基因； 含有
胞外 LRR 结构的跨膜受体蛋白基因以及同时含有胞外 LRR 和胞内 STK 结构的跨膜受体蛋白基因等 [1]， 其
中含有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复（LRR)的胞内受体蛋白基因是最主要的一类抗病基因， 占所有
已克隆抗病基因的 70％左右[2]。 作物抗病基因的克隆主要通过遗传表型分析如转座子标签技术和以遗传图
谱为基础的图位克隆技术获得的[3]。 NBS结构域能够结合 ATP 或 GTP， 在植物抗病反应中起重要作用。 根
据植物抗病基因保守序列结构特点设计引物来扩增基因组 DNA或 cDNA可获得抗病基因同源序列（Reistance
gene analogs， RGAs）， 为筛选抗病基因或抗病相关基因提供了一种有效手段， 现已成为当前较流行的克
隆和分析植物抗病基因的策略之一[3]。
斑茅属蔗茅属, 是甘蔗的近缘植物， 具有良好的抗病虫、 抗旱、 抗寒和耐瘠性, 宿根性好, 分蘖能力
强, 极粗生, 同时适应性强、 分布区域广， 在甘蔗育种中具有较大的潜在利用价值 [4]。 近几十年来， 有关
斑茅的研究， 越来越受到国内外甘蔗育种界的重视， 但主要集中在斑茅的形态学性状、 染色体行为和生
理生化抗性等方面 [5~7]， 在分子水平上的研究还不够深入， 斑茅 R 基因的克隆至今尚未见报道。 笔者拟根
据前人已克隆的 NBS-LRR 类抗病基因保守的 P-loop（GLPLAL）和疏水结构域（GLPLAL）， 设计简并引物，
采用 PCR 技术， 从斑茅叶片 DNA 中扩增和分离 RGAs。 以期通过这些 RGAs 的克隆和序列分析， 为进一
步从斑茅中克隆抗病基因打下基础。
基金项目： 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(No. 2007AA100701)， 农业部引进国际先进农业科学技术计划(948计划)项目(No. 2006-G37)，
国家自然科学基金项目(No. 30170639)， 福建省科技厅国家科技项目备案(No. F2007AA100701)资助。
作者简介： 阙友雄， 男, 1979 年生, 博士。 研究方向: 植物抗病分子生物学。
* 通讯作者， 许莉萍, E-mail: xlpmail@yahoo.com.cn; Tel: 0591-83772604。
收稿日期： 2008-08-26 修回日期： 2008-12-22
2期 阙友雄等： 斑茅 NBS-LRR 类抗病基因同源序列的克隆与分析
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 供试材料为斑茅（Erianthus arundinaceum Retz.）， 采集于福建农林大学农业部甘蔗遗
传改良重点开放实验室资源圃。
1.1.2 引物序列 根据拟南芥（Arabidopis thaliana）抗丁香假单孢杆菌（Pseudomonas syringae）基因 RPS2、
烟草（Nicotina tabacum）抗花叶病毒
（Tobacco mosaic virus）基因 N、 亚
麻（Linum usitatissimum）抗锈病（rust）
基因 L6中保守的 NBS结构域 P-loop
(GMGGVGKT)和保守的未知功能疏
水结构域 HD（hydrophobic domain）
(GLPIAL)设计简并引物（表 1）。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取方法 田间采取
新鲜幼嫩斑茅叶片， 立即投入液氮中带回实验室， -70 ℃冰箱保存。 称取 0.05～0.10 g 组织， 采用 SDS 法
提取 DNA[8]。
1.2.2 PCR反应体系与程序 反应体系为： ddH2O 15.8 μL， 10×PCR buffer 2.5 μL， dNTPs (2.5 mmol/L each)
0.5 μL， Forward primer(10 μmol/L)2.5 μL， Reverse primer(10 μmol/L)2.5 μL， Taq(5 U/μL)0.2μL， 基因组
DNA 1.0 μL， 总体积 25 μL； 反应程序： 94 ℃预变性 4 min； 94 ℃ 45 s， 45 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 35 个
循环； 最后 72℃ 10 min[8]。 在实验过程中， 同时以去离子水为模板， 其它反应成分和反应条件均相同， 作
为阴性对照实验， 1.5％琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。
1.2.3 目的片段的克隆 目的片段的克隆、 PCR和酶切鉴定等按照文献[8]的方法进行。
1.2.4 阳性克隆序列测定及其分析 将经过 PCR 和酶切鉴定的阳性克隆送往上海捷瑞生物技术有限公
司测序。 测序获得的核苷酸序列采用BLAST 程序在 GenBank 上进行相似性搜索， 然后利用 Primer Premier
5.0查找 ORF并翻译成氨基酸序列， 再用 DNAStar进行氨基酸序列的多重比对， 研究它们之间的同源性， 分
析其隐含的进化关系。 用于氨基酸序列参比的抗病基因有： 拟南芥（Arabidopsis thaliana）RPS2（ATU14158）、
RPS5（AF074916）和 RPP8（AAC83165）， 水稻 （Oryza sativa）Xa-1（AB002266）和 Pib（AB013448） ， 烟
草 (Nicotiana tabacum)N （U15606） ， 亚麻 (Linum usitatissimum)L6
（LUU27081）， 芥蓝头(Arabidopsis lyrata)RPM1（AF122982）， 番茄
（Lycopersicon esculentum）I2C(AF004878)， 番茄 Mi（AF091048）和莴苣
Dm3（AF072267）。
2 结果与分析
2.1 DNA的提取
从图 1中可以看出， 利用本方法提取的斑茅基因组 DNA， 质量良
好， 无酚类物质污染， 也没有发生降解， 可以满足后续的实验操作。
2.2 斑茅 NBS-LRR类 R基因同源序列的扩增
利用表 1中引物组合， 以斑茅基因组 DNA为模板进行 PCR扩增。
从图 2可见， 多对引物在斑茅基因组 DNA中扩增出了 1条或者多条条
带， 其中特别值得注意的是， 引物对 H2016/H2021在 500～750 bp 之间
扩增出 1 条清晰的， 长度大约为 680 bp 左右的条带。 根据已克隆的

  

    
 
Forward
H1145
H2016
H2017
H2018
H2019
GGVGKTT
GGVGKTT
GGSGKTT
GGLGKTT
GGMGKTT
5GGIGGIRTIGGIAAIACIAC 3
5GGTGGGGTTGGGAAGACAACG 3
5GGIGGIWSIGGIAARACIAC 3
5GGIGGIYTIGGIAARACIAC 3
5GGIGGIATIGGIAAAACIAC 3
Backward H2021 GLPLAL 5CAACGCTAGTGGCAATCC3
I=inosineR=A/GW=A/CY=C/TN=A/G/C/TS=G/CD=A/G/TK=G/T




bp
21 226
5 148
4 976
5 4 3 2 1 M
图 1 斑茅基因组 DNA 提取效果


bp
750
500
250
M 1 2 3 4
图 2 斑茅 RGA 扩增结果
193
热 带 作 物 学 报 30 卷
NBS-LRR类抗病基因分析结果， 其 NBS结构域长度大多集中在 500 bp左右。 因此对每对引物扩增产物中
长度在 500 bp左右的片段， 加上 H2016/H2021 中 680 bp 左右条带进行回收、 克隆和测序， 这些片段分别
命名为 RGA-Q1、 RGA-Q2、 RGA-Q3、 RGA-Q4、 RGA-Q5、 RGA-Q6、 RGA-Q7 和 RGA-Q8， 片段大小
分别为 513、 672、 668、 516、 516、 516、 528和 534 bp。
2.3 斑茅 R基因同源序列的比较和聚类分析
将 8 个片段的 DNA 序列输入 GenBank 数据库， 进行同源性检索， 发现除了编号为 RGA-Q8 的片段，
其余7 个编号为 RGA-Q1～RGA-Q7 的片段与 GenBank 中已释放的植物 NBS-LRR 类抗病基因及同源序列
具有一定的同源性。 从结构上看（图 3）， 这 7 个 DNA 片段推导的氨基酸序列均具有典型的 NBS 结构域，
图 3 斑茅 RGAs 氨基酸序列与几种已知的植物抗病基因序列保守结构域的比较
194
2期 阙友雄等： 斑茅 NBS-LRR 类抗病基因同源序列的克隆与分析
即 P-loop(GGVGKTT)、 Kinase-2a
(VLDDVW) 、 Kinase -3a (GSR/
KILVTTR) 及疏水结构域 HD
(hydrophobic domain) 。 据 此 ，
可以认为此 7 个片段为斑茅的
抗病基因同源序列（RGAs）。 但
是其中值得注意的是， 编号为
RGA-Q2 和 RGA-Q3 的 2 条片
段不能通读， 推测其中存在部
分内含子序列。
应用 Primer Premier 5.0 和
DNAStar软件对这 7个 RGAs与
已知的植物抗病基因， 如拟南
芥（Arabidopsis thaliana）RPS2（ATU14158）、 RPS5
（AF074916）和 RPP8 （AAC83165） ， 水稻 （Oryza
sativa）Xa-1（AB002266）和 Pib（AB013448）， 烟草
(Nicotiana tabacum) （NU15606） ， 亚麻 (Linum
usitatissimum)L6（LUU27081）， 芥蓝头 (Arabidopsis
lyrata)RPM1 (AF122982） ， 番茄 （Lycopersicon
esculentum）I2C (AF004878)， 番茄 Mi（AF091048）
和莴苣 Dm3（AF072267）等进行比较分析（图 4），
结果显示， 这些斑茅的 RGAs 与已知植物抗病基
因相应区域的氨基酸序列相似性为 2.3％～39.8％；
7 个斑茅 RGAs 片段间在氨基酸水平上的相似性
为 4.5％～98.8％。 进一步进行聚类分析发现（图 5），
斑茅的 7 个 RGAs 大体上聚为 4 类， 其中 RGA-Q2 和 RGA-Q3 独自聚为一类， RGA-Q4、 RGA-Q5 和
RGA-Q6 聚为一类， 其它剩下的 2 个编号分别为 RGA-Q1 和 RGA-Q7 的斑茅 RGA 与所有 11 个已知的植
物抗病基因的相应片段聚为一类。
3 讨论
通过对某些模式植物全基因的测序， 研究结果表明， 植物 NBS-LRR 类抗病基因在植物基因组中广泛
存在。 NBS 结构域是最重要的抗病基因保守结构域之一， 在植物的抗病反应中起着重要的作用。 但是，
并非只有抗病基因才具有 NBS结构域， 许多蛋白家族， 包括 RAS（rat sarcoma）族蛋白、 ATPase 延伸因子、
G 蛋白都含有 NBS 位点 [9]。 另外， NBS 还出现在许多 ATP 和 GTP 的结合蛋白中 [10]。 除了 NBS 结构域，
NBS-LRR 类抗病基因还应具有其它一些重要的结构域， 如 TIR(toll or interluken-1-receptor)、 LRR
(leucine-rich repeats)或 LZ(leucine zipper)等。 本研究分离得到的 7 条 NBS 类 RGA， 仅为潜在的抗病基因
片段。 其确切的功能还需进行进一步的分析。 然而， RGA 是个庞大的基因家族， 从基因组中分离的部分
RGAs 可能由于内含子的存在， 无法通读， 为不表达的假基因， 而从 cDNA 中分离的 RGAs 则均为表达序
列， 不含任何内含子， 它们为抗病候选基因的可能性更大， 这将更有利于真正的抗病基因的筛选。 Pan 等
对植物中 NBS-LRR 类抗病基因的综合分析显示， 在 NBS保守结构域 kinase-2（LLVLDDVW/D）中， 当最后
一个氨基酸为色氨酸（W）时， 该基因属于 non-TIR-NBS-LRR 类型； 而当最后一个氨基酸为天冬氨酸（D）
图 4 斑茅 7个 RGAs 与 11个已知植物抗病基因相应区域的氨基酸序列同源性比较
图 5 斑茅 7 个 RGAs 序列与 11 个已知植物
抗病基因相应片段的聚类分析结果
195
热 带 作 物 学 报 30 卷
时， 则该基因为 TIR-NBS-LRR类抗病基因[9]。 氨基酸序列分析表明， 本研究克隆的所有 7条斑茅 RGAs中，
kinase-2（LLVLDDVW/D）最后一个氨基酸皆为色氨酸的典型特征， 推测所属基因为 non-TIR-NBS-LRR 类
抗病基因， 这与 Pan等研究结果一致， 即单子叶植物中所有 NBS-LRR类抗病基因皆为 non-TIR-NBS-LRR
类[11]。 一般认为单子叶植物不具有 TIR-NBS-LRR类抗病基因[11,12]。 Pan等还认为低拷贝古老的 R 基因位点
分别在双子叶和单子叶植物中有差异地剧增， 是造成在单子叶植物没有 TIR-NBS-LRR类 R基因的原因[11]。
斑茅利用的目的是导入其优良目标性状基因， 扩大栽培品种的遗传基础， 选育出具有优良抗逆抗病能
力的甘蔗品种。 可是， 甘蔗与斑茅的杂交一代花粉少、 不育， 致使斑茅的优良基因难以利用， 同时斑茅也
具有糖分低、 纤维份高、 茎皮硬、 蒲心等不良性状， 在导入目标性状基因的同时, 也不可避免导入不良的
非目标性状基因。 为了去除或减弱这些不良性状基因的影响， 育种工作者一方面可以利用优良栽培品种对
其后代进行多次回交和多个世代的选择， 但该方法耗费时间长， 工作量大， 这就延缓了甘蔗杂交育种进
程， 相关研究一直未能取得突破性进展。 另一种方法是先分离斑茅中优良目标性状基因， 然后通过转基因
手段将该基因转导入目标甘蔗品种， 直接改良该甘蔗品种的目标性状。 因此， 挖掘和克隆斑茅的抗病基
因， 而后通过现代转基因技术培育甘蔗抗病新品种， 使其不仅具有抗病的突出特点， 还避免了不良性状基
因的导入， 保持了目标甘蔗品种的原有性状和品质特性， 是解决当前斑茅利用和甘蔗新种质创新中所遇到
问题的具有较好可行性的途径之一。 本研究中 7 条斑茅 NBS 类抗病基因同源序列的克隆， 为进一步通过
分子生物学和遗传学手段对这些抗病相关基因片段进行全长克隆、 功能分析和染色体定位等奠定了基础。
为了充分发挥其在斑茅抗病基因克隆方面的作用， 进一步的实验可以从以下几个方面开展： 首先在引
物设计上， 深入分析已克隆 R 基因的特点， 设计特异性好的引物， 提高扩增效率， 同时也避免非特异性
扩增； 其次， 在实验技术方面， 可以琼脂糖凝胶电泳和丙烯酰胺凝胶电泳配合使用。 另外， 还可以综合运
用 Southern杂交、 Northern杂交以及定量 PCR等技术， 研究其在斑茅基因组中的拷贝数以及表达特性。
参 考 文 献
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196
2期
（责任编辑： 高 静）
Cloning and Analysis of NBS-LRR Type Disease Resistance
Gene Analogs in Erianthus arundinaceum
Que Youxiong, Xu Liping, Lin Jianwei, Zhang Muqing, Chen Rukai
Ministry of Agriculture Key Lab for Sugarcane Genetic Improvement, Agriculture and Forestry University, Fuzhou,
Fujian 350002, China
Abstract Most of known plant disease resistance genes are featured with a nucleotide-binding site (NBS) and
leucine-rich repeats (LRR). Degenerate oligonucleotide primers were designed according to the conserved NBS
motifs among some disease resistance genes. These primers were used for amplification of disease resistance gene
analog (RGA) from the genome (ic DNA) of Erianthus arundinaceum Retz. by polymerase chain reaction (PCR).
After cloning and sequencing, 8 sequences in Erianthus arundinaceum Retz. were obtained, of which 7 were
NBS-LRR type RGAs (RGA-Q1, RGA-Q2, RGA-Q3, RGA-Q4, RGA-Q5, RGA-Q6, RGA-Q7), the accession
numbers of these RGAs were EU685828, EU685829, EU685830, EU685831, EU685832, EU685833 and
EU685834, respectively. The deduced amino acid sequences of these DNA fragments contained the conserved
motifs of NBS-LRR type RGAs, such as P-loop (Kinase 1a), Kinase 2a, Kinase 3a and hydrophobic domain. The
sequences of each RGA were compared with those of eleven known resistance genes (N, L6, RPS2, Mi, etc.), and
the percentage of amino-acid identity ranged from 2.3％～39.8％. These RGAs may further be used as molecular
markers for screening of candidate disease resistance genes and genetic map construction in Erianthus arundinaceum
Retz. The result indicated that PCR-based homologous cloning approach could be a potentially useful strategy in
cloning of disease resistance genes and related genomic research.
Key words Erianthus arundinaceum; conserved motif; disease resistance gene analogs (RGA); degenerate
oligonucleotide primers
阙友雄等： 斑茅 NBS-LRR 类抗病基因同源序列的克隆与分析 197