全 文 ：云南悬钩子蔷薇 NBS鄄LRR类抗病基因同源克隆与分析*
陈摇 玲1,2, 张摇 颢1, 邱显钦1, 晏慧君1,
王其刚1, 蹇洪英1, 唐开学1**
(1 云南省农业科学院花卉研究所花卉育种重点实验室, 云南 昆明摇 650205;
2 云南大学生命科学学院, 云南 昆明摇 650091)
摘要: 为研究云南野生蔷薇属中的 NBS类抗病基因, 根据已知抗病基因 NBS鄄LRR 序列中的保守区域设计
简并引物, 利用 RT鄄PCR技术从云南悬钩子蔷薇中进行体外扩增, 获得了对应区域的 cDNA 片段, 回收、
克隆这些特异片段, 测序分析, 共得到 4 个含有 NBS鄄LRR 保守结构域的抗病基因同源序列 (RGAs), 分
别命名为 AC9、 AC39、 AC50 和 AC68。 它们与已报道的 11 个 NBS类抗病基因相应区段的氨基酸序列相似
性为 5. 4% ~ 79. 2% , 其中这 4 个 RGAs片段与 Mi、 RPS2、 Pib和 RPM1 基因聚为一类。 表明这 4 条 RGAs
序列可进一步用作悬钩子蔷薇抗病候选基因的分子筛选及遗传图谱的构建。
关键词: 悬钩子蔷薇; 保守区域; 抗病基因同源序列; 简并引物
中图分类号: Q 78摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2012)01-056-07
Cloning and Analysis of NBS鄄LRR Type Disease Resistance
Gene Analogs from Rosa rubus in Yunnan
CHEN Ling1,2, ZHANG Hao1, QIU Xian鄄Qin1, YAN Hui鄄Jun1,
WANG Qi鄄Gang1, JIAN Hong鄄Ying1, TANG Kai鄄Xue1**
(1 Flower Research Institut鄄Flower Breeding Key Labe, Yunnan of Agricultural Sciences, Kunming 650205, China;
2 College of Life Sciences, Yunnan University, Kunming 650091, China)
Abstract: In the study of NBS resistance genes of Yunnan wild Rosa, the degenerate oligonucleotide primers were
designed according to the conserved motifs NBS鄄LRR of most plant resistance (R) genes. The cDNA fragments were
isolated from Rosa rubus by reverse transcription PCR (RT鄄PCR). Then four resistance gene analogs (RGAs) were
sequenced and named as AC9, AC39, AC50 and AC68, which contain NBS鄄LRR domain. The sequence of each
RGAs was compared with NBS region of eleven resistance genes reported before, and the similarities of amino鄄acid
sequences ranged from 5. 4% to 79. 2% , and these four RGAs were clustered a group with Mi、 RPS2、 Pib and
RPM1 gene. These results showed that the four RGAs will be used as molecular markers for screening candidate dis鄄
ease resistance genes and genetic map construction of Rosa rubus in the future.
Key words: Rosa rubus; Conserved motif; Resistance gene analogs (RGAs); Degenerate oligonucleotide primers
摇 植物抗病基因 (plant disease resistance genes,
简称 R基因) 的克隆对于培育抗病植物及研究
病原物与寄主之间互作的分子机制等具有重要意
义。 R基因主要通过转座子标签技术和图位克隆
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2012, 34 (1): 56 ~ 62
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2012. 11057
*
**
基金项目: 国家自然科学基金项目 (31160403); 云南省应用基础研究计划项目 (2011FB124); 科技部 863 项目 (2011AA100208);
云南省攻关项目 (2011BB013); 农业部 948 项目 (2011鄄G17)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: kxtang@ hotmail. com; Tel: 0871-5120870
收稿日期: 2011-04-02, 2011-09-23 接受发表
作者简介: 陈摇 玲 (1986-) 女, 汉族, 在读硕士, 主要从事花卉育种相关研究。 E鄄mail: liushui_2008@ yahoo. com. cn
技术获得, 这两种技术适用于基因组较小的植
物, 但对于基因组复杂的植物则相当困难 (高
丽华等, 2007), 因而寻求新的克隆技术是必要
的。 研究发现 R 基因在结构上具有相当的保守
性, 根据 R 基因保守结构域的特征, 可将 R 基
因分为 4 大类 (玉米抗圆斑病基因 Hm1 和大麦
抗白粉病基因 Mlo 例外) (Hammond鄄Kosack 和
Jone, 1997), 其中 NBS鄄LRR 是最主要的一类,
占所有已克隆 R 基因的 75%左右 (Hulbert 等,
2001), 该结构域能够结合 ATP 或 GTP, 在植物
抗病反应中起重要作用 (Ellis 和 Jones, 1998)。
R基因的保守性使得同源克隆技术成为可能
(Speulman等, 1998), 即根据 R 基因保守序列
设计简并引物来扩增基因组 DNA 或 cDNA, 从
中获得 R 基因同源序列 ( Resistance gene ana鄄
logues, RGAs), 通过染色体定位或明确它们与
已知 R基因位点的连锁关系, 达到筛选 R 基因
或抗病相关基因的目的。 这就是近年兴起的基于
同源性的克隆技术 ( homology鄄based cloning),
该方法已成为当前克隆 R 基因较流行的策略之
一 (刘宇等, 2010)。
随着基因工程技术的发展, 人们已能够将多
种抗植物病虫害的基因转入目的植物中, 这使得
发掘植物自身的 R 基因资源显得越来越重要。
野生蔷薇由于长期处于野生状态, 经受了各种灾
害和不良环境的自然选择, 抗逆性较强, 是天然
的基因库, 保持有栽培月季不具有或已经消失了
的遗传基因, 是克隆 R 基因极有价值的材料
(白锦荣, 2009)。 云南省拥有全国一半以上的蔷
薇属 (Rose L. ) 野生资源, 在生态和遗传水平
上都有较高的多样性, 具有抗病、 抗逆、 香型、
连续开花等许多优良性状 (白锦荣等, 2009; 唐
开学等, 2008)。 悬钩子蔷薇 (Rosa rubus) 是云
南野生蔷薇中优良的种质资源, 色香俱美、 耐
旱、 抗病虫, 适应性强、 分布区域较广, 是垂直
绿化的优良观赏花木, 在月季育种中具有较大的
潜在利用价值 (张佐双和朱秀珍, 2006)。 近几
十年来, 关于蔷薇属抗病种质资源方面的研究已
有报道 (Byrne和 Black, 1996; 张喜萍等, 2002;
刘永刚和刘青林, 2004; 李卉, 2010), 但对于悬
钩子蔷薇的应用还只是停留在庭院观赏方面
(张佐双和朱秀珍, 2006; 章银柯等, 2009)。
本文根据已报道的 NBS鄄LRR 类 R 基因的保
守区域 P鄄loop 和 GLPL, 设计简并引物, 采用
RT鄄PCR技术, 从悬钩子蔷薇 cDNA 中扩增和分
离 RGAs。 以期通过这些 RGAs 的克隆和序列分
析, 为进一步研究云南野生蔷薇的 R 基因资源
和抗病机制奠定基础。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
1. 1. 1摇 植物材料 摇 供试材料为悬钩子蔷薇 (Rosa ru鄄
bus), 采集于云南省农业科学院花卉研究所蔷薇种质资
源圃。 田间采取新鲜幼嫩叶片, 用锡箔纸包裹之后立即
投入液氮中带回实验室, -80益冰箱保存。
1. 1. 2摇 引物设计摇 根据拟南芥 (Arabidopis thaliana) 抗
丁香假单孢杆菌 (Pseudomonas syringae) 基因 RPS2、 烟
草 (Nicotina tabacum) 抗花叶病毒 ( Tobacco mosaic vi鄄
rus) 基因 N、 亚麻 (Linum usitatissimum) 抗锈病 (Mel鄄
ampsora lini) 基因 L6 等 NBS鄄LRR 类 R 基因的蛋白保守
区域 P鄄loop和 GLPL设计简并引物 (表 1)。
1. 1. 3摇 试剂与测序摇 RNA 提取试剂盒购自上海捷瑞生
物技术有限公司; 反转录酶和 PCR产物回收试剂盒购自
北京全式金生物技术有限公司; TaqDNA 聚合酶和
pMD18鄄T载体连接试剂盒购自宝生物工程 (大连) 有限
公司; 引物合成由上海捷瑞生物技术有限公司合成; 测
序由上海杰李生物技术有限公司完成。
表 1摇 用于 PCR扩增的简并引物
Table 1摇 Degenerate primers used for PCR amplification
摇 引物 Primer 保守结构域 Conserved motif摇 引物序列 Sequence (5忆寅3忆)
(正向引物) NBS1 GGV / IMGKTT摇 GGNGGNRTNGGNAARACNAC
(反向引物) NBS2 GL / FPL / FA / VL摇 AKWGCYARRGGDARYCC
(正向引物) APF GGV / IMGKTT摇 GGWATGGGWGGWRTHGGWAARACHAC
(反向引物) APR GL / FPL / FA / VL摇 ARNWYYTTVARDGCVARWGGVARWCC
注: N=A / T / C / G; M=A / C; W=A / T; S=C / G; Y=C / T; K=G / T; V=A / C / G; H=A / C / T; D=A / G / T; R=A / G
751 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈摇 玲等: 云南悬钩子蔷薇 NBS鄄LRR类抗病基因同源克隆与分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
1. 2摇 方法
1. 2. 1摇 总 RNA 的提取 摇 RNA 提取按照 RNA 提取试剂
盒说明进行, 提取的 RNA经紫外分光光度法和琼脂糖凝
胶电泳进行浓度测定和质量检测。
1. 2. 2摇 RT鄄PCR扩增摇 反转录第一链的合成按反转录试
剂盒说明书进行。 取 1 ~ 2 滋L 反转录溶液作模板进行
RT鄄PCR扩增, 反应体系如下: 10 伊 PCRBuffer 2 滋L;
MgCl2 (25 mmol·L-1 ) 1. 6 滋L; dNTPs (2. 5 mmol·L-1 )
1. 6 滋L; 引物 (10 滋mol·L-1 ), 各 1 滋L; TaqDNA 聚合
酶 (5 U·滋L-1) 0. 1 滋L; 用 ddH2O 补足至 20 滋L。 扩增
条件: 94益预变性 3 min, 94益变性 30 s, 55益退火 30 s,
72益延伸 1 min, 30 个循环, 最后 72益延伸 10 min。 在
实验过程中, 同时以 ddH2O为模板, 其它反应成分和反
应条件均相同, 作为阴性对照, 1%琼脂糖凝胶电泳检
测 PCR产物。
1. 2. 3摇 PCR产物克隆及测序 摇 PCR产物凝胶电泳之后,
切下目的片段, 使用凝胶回收试剂盒回收 PCR产物, 回
收片段连接到 pMD18鄄T 载体上, 转化到大肠杆菌 DH5琢
中, 进行蓝白斑筛选, 挑取阳性单菌落 (白斑), 接种
于 LB液体培养基中, 并用相应引物 (本研究的两对简
并引物) PCR鉴定后, 选取有插入片段的阳性克隆送公
司测序。
1. 2. 4 摇 序列分析 摇 测序获得的序列在 GenBank 中进行
同源性检索, 结合 BioXM2. 6 查找开放阅读框 (ORF) 并
翻译成氨基酸序列, 结构域分析采用 SMART, 氨基酸序
列多重比对采用 DNAStar和 DNAMAN。 用于参比的 R基
因有: 拟南芥 RPS2 (AAA21874)、 RPS5 ( AAC26125)
和 RPP8 (AAC83165), 烟草 N (AAA50763), 亚麻 L6
( AAA91022 ), 芥 蓝 头 ( Arabidopsis lyrata ) RPM1
(AAD41050), 莴苣 (Lactuca sativa) Dm3 (AAP42998),
番茄 ( Lycopersicon esculentum) I2C (AAB63274) 和 Mi
(AAC97933) 及水稻 (Oryza sativa) Xa鄄1 (BAA25068)
和 Pib (BAA76281), 其中 N 和 L6 基因为 TIR鄄NBS鄄LRR
类, 其余基因为 non鄄TIR鄄NBS鄄LRR类。
2摇 结果与分析
2. 1摇 RNA的提取
提取的 DNA经紫外分光光度计检测浓度为
0. 4 滋g·滋L-1, 且 OD260 / OD280 比值为 1. 85,
表明总 RNA的纯度较高, 经琼脂糖凝胶电泳检
测 (图 1), 结果表明, 提取的总 RNA 质量良
好, 无 DNA污染, 也没有发生降解, 可以满足
后续实验操作。
图 1摇 悬钩子蔷薇总 RNA的提取
Fig. 1摇 Total RNA extracted from Rosa rubus
2. 2摇 悬钩子蔷薇 RGAs的分离与鉴定
利用引物对 NBS1+NBS2 和 APF+APR 进行
RT鄄PCR扩增。 从图 2 中可见, 两对引物都扩增
出单一清晰的条带。 对扩增产物进行回收、 克
隆, 多次测序得到 56 条序列, 经鉴定得到 NBS
序列 20 条, 获得的序列中有 4 条具有连续的开
放阅读框 ( ORF), 分别命名为 AC9、 AC39、
AC50 和 AC68。 其余 16 条序列都含有不少于 1
个的终止密码子, 不能通读, 因此这 16 条序列
不再进行下一步分析。
图 2摇 两对简并引物 PCR扩增产物
M: 2000 DNA marker; 1: APF+APR引物组合;
2: NBS1+NBS2 引物组合
Fig. 2摇 Electrophoretogram of PCR amplification using two
degenerate primers APF+APR and NBS1+NBS2
M: 2000 DNA marker; 1: APF+APR primer combination;
2: NBS1+NBS2 primer combination
2. 3摇 悬钩子蔷薇 RGAs保守结构域分析
利用 DNAMAN将 4 条序列进行多重序列比
对分析 (图 3), 结果发现, 4 条序列都具有 NBS
85摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
图 3摇 悬钩子蔷薇 RGAs氨基酸序列比对分析 (最下方的横线表示该区域为 RGAs共同的保守结构域)
Fig. 3摇 Multiple amino acid sequence alignment in Rosa rubus RGAs (The mutual domains were denoted by the line below)
类 R基因的 4 个保守基序, 即 “P鄄loop冶、 “Ki鄄
nase鄄2a冶、 “Kinase鄄3a冶 3 个模体和 “GLPL冶 区
(William, 1999), 并且具有Meyers等 (1999) 所
定义的 RNBS鄄A鄄nonTIR ( FnLxAWVCvSQxF)、 B
(GSRIIITTRD)、 C (YEVxxLSDEEAWELFCKxAF)
3 个模体, 指示悬钩子蔷薇的 4 条 RGAs 序列都
为 non鄄TIR鄄NBS鄄LRR (CC鄄NBS鄄LRR) 类。
2. 4摇 悬钩子蔷薇 RGAs核苷酸相似性搜索
使用 Blastn进行相似性搜索, 未发现有与之
完全相同的序列, 但发现该 4 条序列与栽培月季
和刺梨的 RGAs有着 90%以上的相似性, 与其它
物种的 RGAs (如毛果杨、 葡萄) 相似性也较高,
在 85% ~98%之间。 并且发现 AC9 与高山栎抗
疫病基因 RPc (GU289638) 相似性为 68% , 与芭
蕉抗镰刀菌枯萎病基因 BR (EU123875) 相似性
为 81% , AC39 与马铃薯抗晚疫病基因 R3a鄄like
(AAW48299) 相似性为 83% , AC68 与马铃薯抗
晚疫病基因 R3a (AAW48299) 相似性为 95% ,
AC50 与蔷薇科李属植物 (如樱桃、 甘肃桃等)
的部分 RPM家族基因 (如 RPM1、 RPM2、 RPM3
等) 相似性在 73% ~75%之间。
2. 5摇 RGA氨基酸与已知R基因的比较与聚类分析
应用 DNAStar将悬钩子蔷薇的 4 条 RGAs 氨
基酸序列与已知 R 基因 RPS2、 RPS5、 RPP8、 Xa鄄
1、 Pib、 N、 L6、 RPM1、 Dm3、 Mi、 I2C的 NBS 区
域氨基酸序列进行相似性比较分析 (图 4), 结
果显示, 这些悬钩子蔷薇的 RGAs与已知 R 基因
相应区域的氨基酸序列相似性在 5. 4% ~ 79. 2%
之间, 相对于 4 条序列而言, AC39 与 AC68 之
间相似性最高为 79. 2% , AC9 与 AC50 之间相似
性最低为 14. 2% ; 4 条序列与其它已知序列相似
性都很低, AC9 与 RPM1 相似性最高, 但也只有
26. 8% 。 进一步进行聚类分析发现 (图 5), 4 条
RGAs片段聚为一类, 与 Mi、 RPS2、 Pib 和 RPM1
聚为一大类, 其中 Mi、 RPS2、 Pib 和 RPM1 为
non鄄TIR鄄NBS鄄LRR类 R 基因, 说明 4 条序列为
non鄄TIR鄄NBS鄄LRR类, 与前面多重序列比较结果
相一致。
951 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈摇 玲等: 云南悬钩子蔷薇 NBS鄄LRR类抗病基因同源克隆与分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 4摇 悬钩子蔷薇 RGAs与已知植物 R基因的 NBS区域的氨基酸序列相似性比较
Fig. 4摇 The identity percentage among amino acid sequence of Rosa rubus RGAs and NBS region of known plant R genes
图 5摇 悬钩子蔷薇 RGAs氨基酸序列与 11 个已知植物 R基因 NBS区域的聚类分析结果
Fig. 5摇 Phylogenic tree based on alignment of the deduced amino acid sequences of
Rosa rubus RGAs and NBS region of known plant R genes
3摇 讨论
3. 1摇 悬钩子蔷薇 RGAs的分离与鉴定
RGAs是个庞大的基因家族, 从基因组中分
离的部分 RGAs可能由于内含子的存在, 无法通
读, 为不表达的假基因, 而从 cDNA 中分离的
RGAs则均为表达序列, 不含任何内含子, 它们
为抗病候选基因的可能性更大, 本研究从悬钩子
蔷薇 cDNA中扩增分离 RGAs, 这将更有利于我
们筛选真正的 R基因。
摇 摇 从获得的 4 条 RGAs的结构分析表明, 这些
RGAs序列中含 NBS类 R基因的保守结构域, 如
P鄄loop、 Kinase鄄2、 GLPL 等, 并且这些序列具有
连续的开放阅读框 (ORF)。 因此, 这些 RGAs
序列可能是功能性的 R 基因的部分序列, 尤其
AC68 与马铃薯抗晚疫病基因 R3a (AAW48299)
相似性为 95% , 提示 AC68 很可能是抗晚疫病相
06摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
关基因序列。 其中获得的部分序列, 有的与从栽
培月季 ‘金银岛爷 和 ‘香云爷 中克隆的花香基
因、 种子储存蛋白、 P450 羟基化酶家族基因、
或线粒体 Cox3 基因等有较高的相似性, 说明
NBS序列与上述基因有一定的进化关系, 同时也
说明, 上述基因在抗病进化过程中起到了一定的
作用。
模式植物全基因的测序结果表明, 虽然,
NBS结构域是最重要的 R 基因保守结构域之一,
在植物的抗病反应中起着重要的作用, 但是植物
NBS鄄LRR类 R 基因在植物基因组中广泛存在,
而且并非只有 R 基因才具有 NBS 结构域, 许多
蛋白家族, 包括 RAS (rat sarcoma) 族蛋白、 AT鄄
Pase 延伸因子、 G蛋白都含有 NBS 位点 (Baker
等, 1997)。 另外, NBS 还出现在许多 ATP 和
GTP的结合蛋白中 (Traut, 1994) 。 除了 NBS结
构域, NBS鄄LRR类 R 基因还应具有其它一些重
要的结构域, 如 TIR ( toll or interluken鄄1鄄recep鄄
tor)、 LRR ( leucine鄄rich repeats) 或 LZ ( leucine
zipper) 等。 所以本研究分离得到的 4 条 NBS 类
RGA, 仅为潜在的 R 基因片段, 其确切的功能
还需进一步的分析。
3. 2摇 悬钩子蔷薇RGAs的多样性及进化关系分析
目前, 已有 200 多条蔷薇属的 RGAs 被分离
出来 (经 GenBank查询), 将本研究获得的 4 条
序列进行相似性比较之后, 发现 4 条序列与这
200 多条 RGAs 中的部分序列具有较高的相似
性, 但没有完全相同的序列, 从中表明了蔷薇植
物的 NBS类 R基因及候选基因为一个庞大的基
因家族, 可能分属于不同的亚族, 表现出丰富的
多态性, 这暗示了获得具有抗病功能的基因可能
性较大。 研究表明, 在植物基因组中的 RGAs 序
列多样性可能是由于不等交换造成的, 但造成
RGAs序列多样性和复杂度的遗传机理直接证据
还待进一步研究。
本研究 4 条 RGAs氨基酸序列相似性比较中
(图 3), AC39与 AC68之间相似性最高 (79. 2%),
AC9 与 AC50 之间相似性最低 (14. 2% ), 由此
推测, AC39 与 AC68 可能是同一基因的不同拷
贝, 而 AC9 与 AC50 则可能为趋异起源 ( diver鄄
gent origins)。 目前关于 R 基因进化的遗传机制
主要有两个: 逐步进化趋异 (slowing evolving di鄄
vergence) 假说和快速进化过程 ( rapidly evolving
process) (Xu 等, 2005), 本研究结果为这两个
遗传机制提供了一些佐证。 通过对 4 条序列的比
对分析表明, 在保守结构域之间存在许多点突
变, 小片段的插入或缺失事件, 它们是悬钩子蔷
薇植物 RGAs趋异的源泉, 这表明, 在悬钩子蔷
薇中, NBS 类 R 基因的进化是逐步进化趋异,
而不是快速进化过程, 这与前人关于 R基因进化
的研究结果相近 (Pan 等, 2000; Yuksel 等, 2005;
陈观水等, 2006)。
3. 3摇 悬钩子蔷薇 RGAs分离的意义
R基因的获得是进行抗病育种的基础, 发掘
R基因资源是提高植物抗病性、 防治病害的关
键。 常规育种手段在许多病害育种中存在一定困
难, 将克隆的 R 基因应用于抗病育种、 具有高
效、 安全和广谱的优点, 很有应用前景。 悬钩子
蔷薇利用的目的是将其优良的目标性状基因导入
到栽培月季中, 扩大栽培月季的遗传基础, 选育
出具有优良抗逆抗病能力的月季新品种。 本研究
中悬钩子蔷薇的 4 条 RGAs克隆, 为进一步通过
分子生物学和遗传学手段对这些抗病相关基因片
段进行全长克隆、 功能分析和染色体定位等工作
奠定了基础。
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