全 文 ：丁 灿 男，1968年生，在读博士。研究方向：作物栽培生理。联系电话：0898!23300459
*通讯作者
收稿日期：2005!03!23 修回日期：2005!08!18
热 带 作 物 学 报
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第 56卷 第 7期
5;;<年 =5月
低温胁迫等对割手密和斑茅叶片
游离脯氨酸含量的影响
丁 灿 1，2 杨清辉 3 李富生 3 林位夫 1，2*
!1 中 国 热 带 农 业 科 学 院 橡 胶 所2 农业部热带作物栽培生理学重点开放实验室 海南 儋州 571737；
3 云 南 农 业 大 学 昆明 650201）
摘 要 研究了诱导以甘蔗近缘野生种割手密、斑茅无性系的离体叶片等材料中的游离脯氨酸(Fpro)积累的
低温处理、蔗糖诱导方法等。结果表明，低温处理会引起叶片中 Fpro含量增加，其中 3~0!低温处理时叶片中
Fpro含量随处理时间延长而递增，而更低温处理只能引起 Fpro含量短期内增加；外施蔗糖溶液能增强低温处
理的效果；割手密叶部是合成Fpro的主要部位，Fpro在叶部合成后迅速转运到茎和根。不同叶龄的叶片中 Fpro
含量不同，衰老叶中Fpro含量最高，其次为新生叶，成熟叶最低，但衰老叶片中游离脯氨酸的积累与低温无关，
测定Fpro含量的材料以成熟叶片为宜。
关键词 割手密 斑茅 游离脯氨酸（Fpro） 低温胁迫
中图分类号 S566.101
种植由于受地理、气候、栽培品种等因素的影响，世界各国的甘蔗都存在不同程度的冷害威胁[1]，甘
蔗在遭受低温冻害之后，蔗糖含量有不同程度下降。因而甘蔗抗寒性研究受到多数甘蔗种植国家的重
视。选育抗寒力强的甘蔗品种，是减轻低温冻害的主要途径之一[2]。而对甘蔗野生种质资源(指甘蔗属及
其近缘植物的一些野生属种)的研究是甘蔗抗寒育种的基础。长期以来，国内外学者对植物抗寒性鉴定
摸索出许多不同的方法。人们注意到植物体中游离脯氨酸（Fpro）与抗逆性的关系：当植物处于逆境时，
体内的 Fpro大量异常地积累[3，4]以及积累所致的生理生化变化及其意义[5，6]。其中许多学者研究了低温
与Fpro的关系，如何若韫 [7，8]以草莓、大白菜为材料，研究了 Fpro含量的变化与耐冻性的关系；Purvis和
Yeleosky[9]研究了柑桔类在寒冷驯化中 Fpro合成的主要部位。但关于以甘蔗近缘野生种为材料的Fpro
与抗寒性方面的研究尚未见报道。笔者探讨了甘蔗近缘野生种割手密(!##$%&’ !()*+*,&’ L.)、斑茅
(!#-,%).+#$/)中Fpro的诱导和测定方法及其分布等，为进一步研究Fpro与抗寒性关系的实验提供依据。
材料和方法
# 材 料
本试验在云南农业大学甘蔗研究所进行。供试的甘蔗近缘野生种割手密、斑茅无性系材料均采自
云南农业大学甘蔗种质资源圃。
#$ 取样和样品处理
晴天上午 7~9时取样。每丛无性系每次选无病虫植株8~10株，取其不同成熟度的叶片，用湿纱布
包裹后快速带回实验室。叶片用自来水反复冲洗，再用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分，然后分别进行
不同的处理。
样品1：将割手密的成熟叶片清洗后，立即放入长塑料袋内，扎紧袋口保湿。分别进行3，0，!3，!6!
4种不同的低温处理，然后在低温处理后的第1，3，5，7天把材料取出，分别测定其Fpro的含量。样品2：
将割手密、斑茅的成熟叶片分别用 0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10g/mL的蔗糖溶液润湿后，再将叶基部
浸泡于相应浓度的溶液中，于 23!室温下放置 24h后移入 3!的低温冰箱中，分别于第 1，3，5天取出
测定其Fpro的含量。样品3：将不同成熟度的割手密、斑茅叶片在0.08g/mL蔗糖溶液中润湿后，于室温中
4期 丁 灿等：低温胁迫等对割手密和斑茅叶片游离脯氨酸含量的影响
放置24h，移至3!冰箱中3d后测定割手密、斑茅不同成熟度叶片中 Fpro的含量。样品4：将整株的割
手密无性系植株从田间连根挖出并洗净泥土，分 3组处理：A!对整株各部位喷 0.08g/mL蔗糖溶液；B!
对整株的叶部喷 0.08g/mL蔗糖溶液；C!将叶、茎、根分离开，并对各部分喷 0.08g/mL蔗糖溶液。所有
材料充分保湿，喷后1d移至3!的冰箱中进行冷驯化，3d后取出测定处理各部位的Fpro含量。样品5
（对照）：不作任何处理，采下材料后即行测定。每个处理设 1个对照。
!# $%&’的测定
参照文献[10]的磺基水杨酸法进行测定。将预处理后的材料取出，对于叶片类的材料，分别切取各
样品叶片中部约 20cm长的叶段，去掉叶脉后剪碎成约 0.2cm0.2cm大小的碎片；对于茎杆和根系，
取茎杆中部约20cm长茎段，根系(须根)中间段，分别剪碎成约0.1cm0.1cm大小的碎片。各样品分别
充分混匀，称取样品3份，每份0.5g，放入小试管内。每支试管加入 5mL0.03g/mL的磺基水杨酸，将试
管加盖后置于沸水浴中浸提10min，冷却至室温。吸取提取液2mL于另一干净试管中，再加入 2mL蒸
馏水，2mL冰乙酸和4mL0.025g/mL酸性茚三酮溶液，试管加盖后置沸水浴中显色 60min。冷却后，加
入4mL甲苯，萃取红色甲苯层于分光光度计520nm波长处比色。以2mL蒸馏水代替2mL提取液，重
复上述步骤，以此作为空白样品。
标准曲线制作：配制浓度为1~10μg/mL10个系列的脯氨酸标准溶液。取标准液2mL(参比液为2mL
水)和2mL0.03g/mL磺基水杨酸溶液代替样品测定中的 2mL浸提液和2mL水，按上述程序进行显
色，萃取和比色(λ=520nm),最后绘制标准曲线。
结果计算：!=#
$2
$1，其中
!——样品脯氨酸含量(μg/g，鲜重)，#——样品重量(g，鲜重#，——
标准曲线查得脯氨酸$μ%#，$ ——样品提取体积&$ #——样品反应体积。
( 结果与分析
(! 脯氨酸溶液的煮沸显色时间
将已知浓度的脯氨酸溶液5，10μg/mL分别置于水浴锅中显色，于第15，30，45，60，75，90，105分钟
时，分别取出测定其显色后的脯氨酸含量，结果见图1。结果表明，不论浓度高低，显色时间以60min为宜。
(( 不同的低温处理对离体叶片 $%&’含量的影响
割手密无性系的叶片分别在 3，0，!3，!6!的 4个冰箱内分别作 1，3，5，7d低温处理后其 Fpro的
含量测定结果见表1。
由表1中可见，在夏季常温下，割手蜜叶片中的 Fpro含量（9.0μg/g）很低；低温处理能使叶片中的
Fpro含量发生明显的变化。短期（1d）的低温处理，叶片中的Fpro含量随着温度的下降而增高，但随着
处理时间的延长，叶片中 Fpro的含量随温度下降先升后降；在一定低温范围（0~3!）内，叶片中的
表 ! 不同低温处理的割手密无性系叶片中
$%&’含量 /μ%·%’(
处理天数 /d 3! ) ! ’* ! ’+ ! 平均
1 12.5 14.5 16.8 19.0 15.7
3 14.0 17.5 18.5 17.0 16.8
5 15.0 18.5 16.0 15.0 16.1
7 25.0 27.5 14.0 11.5 19.5
平均 16.6 19.5 16.3 15.6
说明：对照的 Fpro含量为 9.0μg/g。
显色时间 /min
图 ! 显色时间对脯氨酸含量测定的影响
吸
光
率
/A
5μg/mL
()μg/mL
53
热 带 作 物 学 报 26卷
Fpro含量随着低温处理的时间延长而递增；但在较低的温度范围（!3~!6!）内，叶片中的Fpro含量随
低温处理时间的延长，先升后降或逐渐下降。这表明，适当的低温处理能引起叶片中 Fpro积累，而较低
的温度则只能使叶片中的Fpro含量短期内迅速升高，但随后下降。
将表 1结果用 SAS统计分析软件进行方差分析，割手密叶片在不同的低温处理之间（F=0.59，
P=0.6329>а=0.05）Fpro含量变化差异不显著，但总的以3，0!低温处理的稍高些。
!# 离体叶片在不同浓度的蔗糖溶液诱导下对 $%&’含量的影响
用6种浓度的蔗糖溶液诱导，并在3!的低温冰箱中分别作1，3，5d的冷训化后测定割手密、斑茅
离体叶片的Fpro的含量，并以蔗糖处理浓度0（蒸馏水）为对照，将结果用 SAS统计分析软件进行方差
分析，结果如表2，3所示。
从表 2中可见，诱导后不同低温处理时间之
间叶片中 Fpro含量有一定的差异。但除斑茅处理
1d与 处 理 3d后 Fpro含 量 有 显 著 差 异
（|!|=2.8401747，p=0.0362<а=0.05）外，其余处
理均未达到显著水平，总体上以处理 3d的高些。
此外，从表 2中还可见，在一定范围内（0~0.08
g/mL），割手密和斑茅的叶片中Fpro含量都随着蔗
糖溶液浓度升高而提高，不同种之间对蔗糖溶液诱
导反应也有差异，割手蜜叶片中Fpro含量增加明显
些；但蔗糖溶液达到0.10g/mL时，叶片中Fpro含量
有下降的趋势。多重比较的结果表明，割手密叶片在
0~0.10g/mL不同的蔗糖浓度处理之间（F=29.58，
P=0.0001<а0.01）以及斑茅叶片在 0~0.10g/mL
不 同 的 蔗 糖 浓 度 处 理 之 间（F=29.47，
P=0.0001<а=0.01）差异都达到极显著。
由表 3还可见，蔗糖溶液为 0.08g/mL的处
理，其 Fpro值极显著高于用蒸馏水（蔗糖浓度
为 0g/mL）和低浓度（0.02，0.04g/mL）的处理。同
时，也明显比用 0.06，0.10g/mL浓度处理诱导的
Fpro积累量高。所以，蔗糖诱导浓度以0.08g/mL为
宜。
!( $%&’ 在不同成熟度叶片中的含量、合成的主
要部位及其运转
割手密、斑茅无性系不同成熟度的叶片，经诱
导处理或不处理的Fpro含量测定结果见图2。图2
表明，割手密、斑茅不同叶龄叶片中 Fpro的含量不
同，衰老叶片的 Fpro含量最高,成熟叶片的 Fpro含
量最低，新生叶片的Fpro含量介于前二者之间。不
同种之间有一定差异，但基本趋势一致，诱导处理
与不处理的结果也一致。这表明，叶片中 Fpro的含
量与叶龄有关。以割手密不同器官(根、茎、叶)为材
料分别用蔗糖溶液和低温处理后，其 Fpro含量测
新生叶 成熟叶 衰老叶 新生叶 成熟叶 衰老叶
割手密 斑 茅
图 ! 割手密、斑茅不同成熟度叶片 $%&’含量
对照
低温处理
Fp
ro
含
量
/μ
# ·
#!
1
表 ! 不同浓度的蔗糖溶液诱导后割手密、斑茅叶
片 $%&’含量 /μ#·#$%
蔗糖浓度
/g·mL!1
割手密 斑 茅
1d 3d 5d 平均 1d 3d 5d 平均
0 6.5 7.0 8.2 7.2 6.8 7.4 7.8 7.3
0.02 10.5 9.5 11.0 10.3 9.5 9.5 8.5 9.2
0.04 11.0 12.813.0 12.3 10.0 12.0 11.0 11.0
0.06 12.8 15.013.5 13.8 11.3 12.0 12.0 11.8
0.08 15.0 16.015.5 15.5 12.5 15.0 14.8 14.1
0.10 14.5 16.813.5 14.9 11.0 14.5 12.8 12.8
平 均 11.7 12.912.5 10.2 11.7 11.2
说明：割手密对照(低温处理前)的 Fpro含量为 5.2μg/g；斑
茅对照&低温处理前’的 Fpro含量为 6.3μg/g。
表 # 不同浓度的蔗糖溶液诱导后割手密、斑茅叶片
$%&’含量多重比较结果
处理浓度
/g·mL!1
野生种割手密 野生种斑茅
Fpro平均值
（a=0.05）
Fpro平均值
（a=0.01）
Fpro平均值
（a=0.05）
Fpro平均值
（a=0.01）
0.08 15.5a 15.5A 14.1a 14.1A
0.10 14.9a 14.9AB 12.8ab 12.8AB
0.06 13.8ab 13.8AB 11.8bc 11.8B
0.04 12.3b 12.3BC 11.0c 11.0BC
0.02 10.3c 10.3C 9.2d 9.2CD
54
4期 丁 灿等：低温胁迫等对割手密和斑茅叶片游离脯氨酸含量的影响
定结果见图 3。从图 3可见，不作处理的植株
（CK），Fpro含量以叶片的最高，其次是茎，再次之
是根。从图 3还可以看出，对植株各器官作不同喷糖
处理可导致不同器官中 Fpro的含量不同程度的增
加（A，B，C）。当将根、茎、叶分开并作喷糖和冷驯
处理时（C处理），只有叶中的 Fpro含量明显增加，
而茎和根的Fpro含量只少量增加。当以整株作诱导
处理时，不论是对整株喷糖(A)还是只对叶部喷糖
（B），叶、茎、根中的Fpro含量都明显地增加。这些
说明，割手密叶部是合成 Fpro的主要部位，根、茎是次要部位，只能少量合成，但在叶部合成的 Fpro可
以迅速转运到茎和根，而这种迅速转运有利于叶部合成 Fpro，并导致根部中 Fpro大量积累，植株中的
Fpro总量大幅提高。
! 讨 论
（1）测定脯氨酸含量的煮沸显色时间以 60min为宜。
（2）低温处理能引起割手密、斑茅植株中 Fpro的积累。在短期（1d）的低温处理时，割手密等的叶
片中 Fpro含量随温度的降低而升高；在一定的低温范围(0~3!)内，叶片中 Fpro含量有随着处理时间延
长而递增，但更低的低温（!3~!6!）处理只能引起叶片中Fpro含量短期内升高。外施一定浓度（0.04，
0.06，0.08g/mL）的蔗糖溶液会增强低温处理的作用。但高浓度的外源蔗糖溶液作为 Fpro的诱导剂会
引起细胞损伤，只有在适宜的浓度范围内才有保护作用[3]。此外，这些诱导处理也会引起植株中根、茎的
Fpro含量的增加。这一结果与许多植物在低温锻炼中用外源蔗糖处理时 Fpro含量增高的现象是一致
的[3，4，7，8，11，12]。从实验结果看，诱导甘蔗近缘野生种割手密、斑茅离体叶片内Fpro形成的冷训化处理以
3!或0!处理3d为宜；蔗糖溶液的浓度以0.08g/mL为宜。
（3）叶片是Fpro的主要合成部位。对割手密无性系整株和分器官诱导处理的结果表明，叶部是合
成 Fpro的主要部位，根、茎是次要部位，只能少量合成，但在叶部合成的 Fpro可以迅速转运到茎和根，
同时这种迅速转运有利于叶部合成Fpro，并导致根部中Fpro大量积累，植株中的Fpro总量大幅提高。
（4）叶片中Fpro含量与叶龄相关，老叶片不宜作为测试的材料。笔者观测到，叶片中Fpro含量与
叶龄有密切关系，衰老叶Fpro含量最多，成熟叶含量最少，而新生叶介于二者之间。在叶片未出现衰老
情况下，Fpro的积累只能通过新的同化物合成来提高氨基酸中Fpro的比例。植物在受到胁迫后，N的重
新分配导致Fpro增加，这无疑是引起脯氨酸积累的机制之一[13]。而叶片衰老过程中首先看到的是细胞
质内蛋白质水解，同时伴随有Fpro的积累[14]，并且某些酶的活性下降了25%~50%，而作为脯氨酸主要
来源之一的谷氨酸水解酶的活性却增加了400%。此时脯氨酸的积累可能是蛋白质降解的结果之一，是
低温的一种伤害反应[15]。这也说明衰老叶片中高含量的 Fpro与低温不相关，Fpro的积累只是叶片衰老
的一种表现。因此，叶片中Fpro含量测定以成熟叶片为宜。
实验中主要研究割手密和斑茅无性系叶片的 Fpro含量低温诱导及测定的方法，其它器官中 Fpro
的含量与低温的关系还有待于进一步研究。
参 考 文 献
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Fp
ro
含
量
/μ
·
!
1
图 ! 不同处理下的割手密叶、茎、根的 #$%含量
55
热 带 作 物 学 报 26卷
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