全 文 ：收稿日期:2011 － 08 － 25
基金项目:国家自然科学基金项目(30771345) ;陕西省“13115”科技创新工程计划项目(2009 ZDKG-11，2010 ZDKG-08) ;西北农林科技大学唐仲英育
种基金项目。
作者简介:赵继新(1971 －) ，男，陕西汉中人;博士，研究方向:作物遗传育种及小麦染色体工程;E-mail:zhjx881@ 163． com。
通讯作者:陈新宏，E-mail:cxh2089@ 126． com。
华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基因的分离与序列分析
赵继新1， 阎 新1， 王玉卿1， 武 军1， 陈新宏1， 程雪妮2， 刘淑会1， 杨群慧1
(1．西北农林科技大学农学院; 陕西 杨凌 712100; 2．西北农林科技大学生命学院， 陕西 杨凌 712100)
摘要:采用 AS-PCR技术，从华山新麦草基因组 DNA中分离获得了其籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a(HM 448475)和 Pin b(HM
448476)的基因序列。DNA序列分析显示，这 2 条序列相似性仅为 69． 25%，它们与小麦、山羊草、黑麦、燕麦和大麦亲缘
种属植物等的 Pin a和 Pin b基因序列具有 93%以上的一致性;推导的氨基酸序列分析显示，序列 HM 448475(Pin a)和
HM 448476(Pin b)都具有籽粒硬度吲哚蛋白基因的 19 个氨基酸残基组成的信号肽，与脂类易于结合的色氨酸结构域
WRWWKWWK(Pin a)或WPTKWWK(Pin b) ，以及位置固定的 10 个半胱氨酸残基等典型结构特征，同时，这 2 条序列与
小麦、山羊草等亲缘植物的 Pin a和 Pin b基因氨基酸相比，分别有 15 个和 8 个主要位点的差异;系统进化树分析显示，
序列(HM 448475)可能为 Pin a基因家族中的一个新类型，而序列(HM 448476)与智利大麦的 Hordoindoline b 基因具有
相对较近的亲缘关系。研究表明，华山新麦草含有与麦类作物差异较大的控制籽粒硬度的等位基因。该研究对保护利
用华山新麦草、丰富小麦籽粒硬度基因资源具有一定的理论意义和应用价值。
关键词: 华山新麦草;籽粒硬度;吲哚蛋白;基因分离;序列分析
中图分类号: Q 789 文献标志码: A 文章编号: 1001 － 4705(2011)12-0004-06
Isolation and Sequence Analysis on Puroindoline Genes of Grain Hardness
in Psathyrostachys Huashanica
ZHAO Ji-xin1，YAN Xin1，WANG Yu-qing1，WU Jun1，
CHEN Xin-hong1，CHENG Xue-ni2，LIU Shu-hui1，YANG Qun-hui1
(1． College of Agronomy，Northwest A＆F University，Yangling Shaanxi 712100，China;
2． College of life science，Northwest A＆F University，Yangling Shaanxi 712100，China)
Abstract:The Puroindoline a (HM 448475)and Puroindoline b (HM 448476)genes of Psathyrostachys
huashanica were isolated by AS-PCR method． Nucleotide sequence analysis showed that the similarity in these
two sequences was only 69． 25%，and the identity of these two sequences with the Puroindoline gene of rela-
tive species，such aTriticum，Aegilops，Secale，Avena，and Hordeum so on，were more than 93% ． Deduced ami-
no acid sequence analysis demonstrated that the sequence HM 448475 (Pin a)and HM 448476 (Pin b)all
had the typical structural features of Puroindoline gene in cereal crop，containing the signal peptide of 19 ami-
no acid residues，the tryptophan motif of WRWWKWWK (Pin a)or WPTKWWK (Pin b) ，and the location
fixed 10 cysteine residues． Meanwhile，compared with the amino acid sequence of Puroindoline gene in relative
species，the two sequences HM 448475 (Pin a)and HM 448476 (Pin b)had fifteen and eight major sites
difference，respectively． Phylogenetic tree analysis indicated that the sequence (HM 448475)might be a new
type of Pin a gene family，and sequence (HM 448476)might has a relatively near homologous with
Hordoindoline b gene (GU 214830)of Hordeum chilense． This result suggested that P． huashanica contain
the different Puroindoline gene alleles to control the grain hardness． The studies had important significance for
enriching and improving wheat resources of grain hardness，and for protecting and exploiting the advantageous
genes of the endangered species P． huashanica．
Key words: Psathyrostachys huashanica;grain hardness;Puroindoline;isolation;sequence analysis
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第 30 卷 第 12 期 2011 年 12 月 种 子 (Seed) Vol． 30 No． 12 Dec． 2011
DOI:10.16590/j.cnki.1001-4705.2011.12.057
籽粒硬度(Grain Hardness)是普通小麦的重要品
质性状，对小麦磨粉品质、淀粉品质、蛋白质品质和加
工品质都有显著的影响［1，2］。籽粒硬度的研究已引起
全球范围的广泛重视［3］。前人研究证明，小麦籽粒硬
度由一个位于 5 D 染色体短臂上的主效基因(Ha)和
一些分别位于 1 A、2 AL、2 DL、5 BL、6 D等染色体上的
微效基因(QTL)控制，主效基因 Ha 呈显性遗传，编码
一个 15 kD的 Friabilin 蛋白复合体，该蛋白主要存在
于小麦胚乳中，是小麦籽粒硬度的生化标记［4，5］，它主
要包括小麦吲哚蛋白 Puroindoline A (Pin a)、
Puroindoline B(Pin b)和籽粒软质蛋白(grain softness
protein，GSP)3 种［6］。Puroindoline蛋白的 Pin a和 Pin
b两类亚基基因通过色氨酸结构域，按 1∶ 1比例组成与
淀粉表面结合，共同作用于籽粒质地结构，从而影响籽
粒硬度［7］。小麦的 Pin a 和 Pin b 基因序列同源性高
达 60%，不含内含子，编码区长 447 bp，编码一类包含
148 个氨基酸，对脂类物质具有较高亲和力的碱性亲
水脂膜蛋白［8］。目前，国内外学者已分离克隆出了普
通小麦［9］、大麦［10］、燕麦和黑麦［11］，以及山羊草［12，13］
等麦类亲缘种属植物中的多个 Pin a和 Pin b基因。
华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)是
分布在我国秦岭山脉华山段的一个特有种，为国家Ⅰ
类珍稀濒危植物和急需保护的农作物野生亲缘种，具
有抗寒、抗旱、耐瘠薄、早熟、优质、矮杆、抗病等优良特
性［14，15］。前人利用普通小麦品种 7182 与华山新麦草
杂交，创制出了 1 个小麦 －华山新麦草倍半二倍体材
料 H 8911，利用 H 8911 与普通小麦和缺体小麦杂交及
回交，选育出了 5 个异附加系和 2 个异代换系及多个
易位系，将华山新麦草的抗病、优质及部分优异农艺性
状导入到了普通小麦中［16］。利用普通小麦品种 J-11
与华山新麦草杂交，F1 经组织培养、秋水仙素加倍，获
得了一个小麦-华山新麦草双二倍体植株 PHW-SA
(AABBDDNsNs)［17］。Petersen 等研究了 1 个核基因
(DMC 1)和 3 个叶绿体基因(rbcL、rpoA、rpoC 2)在华山
新麦草及其近缘植物中的分布，获得了华山新麦草的
这几个基因的序列［18］。凡星等报道了华山新麦草的
细胞色素 c成熟蛋白亚基(ccm FN)基因序列［19］。王
玉卿等对华山新麦草的 α-醇溶蛋白基因进行了原核
表达研究［20］。截止目前，国内外已获得了叶绿体
RNA聚合酶(rpo)基因、减数分裂抑制基因(DMC)、光
系统Ⅱ蛋白(psb A)基因、醇溶蛋白基因等 30 个华山
新麦草的相关基因序列，而关于华山新麦草籽粒硬度
基因的分离克隆及生物信息学的研究尚未见报道。
本研究拟采用同源克隆的方法，利用特异引物，对
华山新麦草总基因组 DNA 进行 PCR 扩增，通过 T-A
克隆，获得华山新麦草籽粒硬度基因的 DNA 序列，并
对其进行生物信息学分析，以期了解华山新麦草籽粒
硬度基因序列的结构特点和功能特征，为进一步利用
这类基因提供理论依据，为小麦品质改良提供新的候
选基因。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
供试材料为华山新麦草，由西北农林科技大学农
学院收集和保存。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 基因组 DNA的提取及 PCR扩增
采用 CTAB法提取华山新麦草的全基因组 DNA。
根据 GenBank上已经公布的小麦籽粒硬度基因序列，
参照文献［13］采用的引物，合成 2 对分别扩增 Pin a
和 Pin b基因的特异引物，其序列为:PinAF:ATGAAG-
GCCCTCTTCCTCA，PinAR:TCACCAGTAATAGCCAAT-
AGTG;PinBF:ATGAAGACCTTATTCCTCCTAGC，Pin-
BR:GATATCATCACCAGTAATAGCC。
PCR反应体系 20 μl，包含模板 DNA 约 100 ng，
dNTPS 200 μmol /L，10 × buffer 2 μl，引物 F 和 R 各
2 μmol /L，Taq 酶 1 U。PCR 扩增程序为:94 ℃变性
5 min，94 ℃ 变性 30 s，58 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸
2 min，38 个循环，72 ℃延伸 10 min。
1． 2． 2 基因克隆与序列测定
扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回
收试剂盒回收纯化目标片段，目标片段与 pMD 19-T载
体连接(TaKaRa) ，并转化至大肠杆菌 DH 5 α 感受态
细胞。转化细胞经含氨苄青霉素(Amp)100 μg /ml 的
X-gal / IPTG /LB 平板进行蓝白斑筛选，对可能的阳性
菌斑进行菌落 PCR和质粒酶切鉴定，对鉴定阳性重组
质粒送交北京六合华大基因科技股份有限公司进行
DNA测序。
1． 2． 3 序列分析
将获得的 DNA 序列提交到网站 http:/ /www． nc-
bi． nlm． nih． gov /进行序列比对和注册。提交到网站
http:/ /www． bioinformatics． org / sewer /进行氨基酸序列
推导，推导的氨基酸序列在网站 http:/ /www． cbs． dtu．
dk /services /SignalP /进行信号肽分析。利用软件
BioEdit V 7． 0． 5 的 Clustal W 算法和软件 Mega V 5． 0
的 Neighbor-Joining算法进行序列同源性分析及系统
进化树构建。
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研究报告 赵继新 等:华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基因的分离与序列分析
图 2 华山新麦草 Pin a(HM 448475)基因推导氨基酸序列比对
注:Signal peptide为信号肽，方框内为 WRWWKWWK的色氨酸结构域，阴影部分为 10 个半胱氨酸残基(C) ，
短横表示氨基酸残基的缺失，园点代表相同的氨基酸残基。下同。
2 结果与分析
2． 1 华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基因的 PCR扩增
及 DNA序列分析
分别利用引物组合 PinAF /R 和 PinBF /R，以华山
新麦草基因组 DNA为模板，经 PCR扩增，各得到 1 条
约 450 bp的 DNA片段(图 1)。将该 DNA 片段回收、
克隆和测序，分别得到序列长为 450 bp和 454 bp 基因
片段。对这 2 条序列进行比较，结果显示，这 2 条序列
的相似性仅为 69． 25%。将这 2 条序列分别提交到网
站 http:/ /blast． ncbi． nlm． nih． gov /Blast． cgi 进行同源
性搜索。结果显示，引物组合 PinAF /R 得到的 DNA
序列与普通小麦(Triticum aestivum)、卵穗山羊草
(Aegilops geniculata)、二角山羊草(Ae． bicornis)和钩刺
山羊草(Ae． triuncialis)等亲缘物种的吲哚蛋白 Pin a
基因序列，以及黑麦(Secale cereale)的 Secaloindoline-a
基因序列、燕麦(Avena sativa)的 Avenoindoline-a 基因
序列具有很高的相似性，达到 94% 以上;引物组合
PinBF /R得到的序列与普通小麦(T． aestivum)、粗山羊
草(Ae． tauschii)、西尔斯山羊草(Ae． searsii)等亲缘物
种的吲哚蛋白 Pin b基因序列，以及黑麦(S． cereale)的
Secaloindoline-b 基因序列、智利大麦(Hordeum chil-
ense)的 Hordoindoline b 基因序列具有很高的相似性，
达到 93%以上;初步推断，所获得的这 2 条序列分别
为华山新麦草籽粒硬度蛋白 Pin a 和 Pin b 的基因序
列，将这 2 条序列提交至 NCBI 网站注册，引物组合
PinAF /R 得到的 450 bp 序列的 GenBank 登录号为
HM 448475;引物组合 PinBF /R 得到的 454 bp 序列的
GenBank登录号为 HM 448476。
图 1 华山新麦草籽粒硬度基因的 PCR扩增
M． DNAMarker(DL 2000) ;1．引物组合 PinAF /R;
2．引物组合 PinBF /R。
2． 2 推导的氨基酸序列结构分析
将得到的这 2 条华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基
因的 DNA序列提交到网站 http:/ /www． bioinformatics．
org /sewer /进行氨基酸序列推导，将推导的氨基酸序列
提交到网站 http:/ /www． cbs． dtu． dk /services /SignalP /
进行信号肽预测，并利用 BioEdit 软件，将这 2 条序列
分别与已公布的普通小麦、山羊草、黑麦、燕麦等亲缘
种属植物的籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a 和 Pin b 基因序
列进行相似性比对，结果见图 2 和图 3。
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第 30 卷 第 12 期 2011 年 12 月 种 子 (Seed) Vol． 30 No． 12 Dec． 2011
由图 2 可见，DNA序列长度为 450 bp的华山新麦
草籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a基因(HM448475) ，可编码
149 个氨基酸残基，含有籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a 基因
特有的 19 个氨基酸残基的信号肽，和与脂类易于结合
的 WRWWKWWK 的色氨酸结构域，以及形成 5 个二
硫键结构所需的 10 个半胱氨酸残基(C)。与普通小
麦、山羊草、燕麦和黑麦等的吲哚蛋白 Pin a 基因氨基
酸序列相比，华山新麦草的吲哚蛋白 Pin a 基因的氨
基酸序列有 15 个主要位点发生了变异，如第 22 位的
丝氨酸(S)变异为精氨酸(R) ，第 42 位的缬氨酸(V)
变异为亮氨酸(L) ，第 58 位的丝氨酸(S)变异为苏氨
酸(T)等。另外，华山新麦草的籽粒硬度吲哚蛋白
Pin a基因的多肽序列与普通小麦等亲缘植物的 Pin a
基因相比，在第 29 位上多了 1 个甘氨酸(G)残基的插
入位点。
由图 3 可见，DNA序列长度为 454 bp的华山新麦
草籽粒硬度吲哚蛋白 Pin b基因(HM 448476) ，其编码
区长度为 447 bp，可编码 148 个氨基酸残基，含有籽粒
硬度吲哚蛋白 Pin b基因特有的 19 个氨基酸残基的信
号肽，和与脂类易于结合的 WPTKWWK的色氨酸结构
域，以及形成 5 个二硫键结构所需的 10 个半胱氨酸残
基。与普通小麦、山羊草、智利大麦和黑麦等的吲哚蛋
白 Pin b基因氨基酸序列相比，华山新麦草的吲哚蛋
白 Pin b基因的氨基酸序列主要在第 25、27、48、54、
79、103、113、119 位这 8 个位点发生了变异，如第 25
位的甘氨酸(G)变异为丝氨酸(S) ，第 54 位的缬氨酸
(V)变异为蛋氨酸(M) ，第 79 位的组氨酸(H)变异为
谷氨酰胺(Q)等。此外，在第 3、8、55、71、87、101、102、
104、108、124 位和第 144 位点上也发生了部分变异。
2． 3 系统进化分析
将得到的 2 条华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基因
序列与 NCBI 基因库中登录的普通小麦、山羊草、黑
麦、燕麦和大麦等亲缘物种的籽粒硬度吲哚蛋白基因
的 DNA序列进行同源性比对，并构建系统进化树(图
4)。结果显示，籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a和 Pin b基因
序列被分别聚为了 2 类，而且具有相对较近亲缘关系
的吲哚蛋白基因序列，均可以聚在一起，如小麦属和山
羊草属的籽粒硬度吲哚蛋白基因均聚在了一类。本研
究获得的 2 条华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基因中，
Pin a 基因序列 HM 448475 与所比对的小麦、山羊草
等亲缘物种的籽粒硬度吲哚蛋白基因序列均没有聚在
一起，说明华山新麦草的籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a 基
因与小麦、山羊草等亲缘植物的籽粒硬度基因都不具
有相对较近的亲缘关系，该基因可能为籽粒硬度基因
家族中的一个新类型;而 Pin b 基因序列 HM 448476
与智利大麦的 Hordoindoline b 基因序列(GU 214830)
聚在了一起，说明，华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白
Pin b基因与智利大麦籽粒硬度吲哚蛋白 Hordoindoline
b基因具有相对较近的亲缘关系。
图 3 华山新麦草 Pinb -Ns 1(HM 448476)基因推导氨基酸序列比较
·7·
研究报告 赵继新 等:华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基因的分离与序列分析
图 4 华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基因的系统进化树
3 讨 论
籽粒硬度(Grain Hardness)是普通小麦的重要目
标性状之一，对小麦面粉的加工品质有重要影响［1，2］。
前人已分离克隆出了普通小麦［9］、大麦［10］、燕麦和黑
麦［11］、山羊草［12，13］等麦类亲缘种属植物中的多个籽粒
硬度吲哚蛋白 Pin a和 Pin b基因，通过比较这些吲哚
蛋白 Pin a和 Pin b 基因序列研究发现，吲哚蛋白 Pin
a和 Pin b基因都不含内含子，具有很高的同源性，不
同亲缘物种的籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a 和 Pin b 基因
相差都不大，编码区两端序列都很保守［21］;Pin a 和
Pin b基因的氨基酸序列都包含 19 个氨基酸残基组成
的信号肽和与脂类易于结合的色氨酸结构域，以及形
成 5 个二硫键结构所需的 10 个半胱氨酸残基，且半胱
氨酸残基的位置都很固定等典型结构特征，吲哚蛋白
Pin a和 Pin b 基因氨基酸序列同源性很高，达到 60%
以上，其主要差异体现在色氨酸结构域上，其中，Pin a
的色氨酸结构域为 WRWWKWWK，而 Pin b 的色氨酸
结构域为 WPTKWWK［22］。本研究以华山新麦草基因
组 DNA为模板，分别利用籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a 和
Pin b基因的特异性引物，进行 PCR 扩增，各自获得了
1 条相应的 DNA 序列，通过同源性搜索及序列分析，
这 2 条序列各自具有籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a和 Pin b
基因的 19 个氨基酸残基的信号肽，与脂类易于结合的
色氨酸结构域 WRWWKWWK(Pin a)或 WPTKWWK
(Pin b) ，以及位置固定的 10 个半胱氨酸残基等典型
结构特征，由此推断，获得的这 2 条序列分别为华山新
麦草的籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a和 Pin b基因。
同时，通过将获得的 2 条华山新麦草 Pin a 和
Pin b基因与 Genbank 已经公布的普通小麦、山羊草、
大麦、燕麦和黑麦等亲缘种属植物的 Pin a 和 Pin b 基
因的氨基酸序列比对发现，华山新麦草的 Pin a 基因
(HM 448475)存在多达 15 个位点的变异，而且该序列
在第 29 位点还存在 1 个甘氨酸(G)的插入位点;系统
进化分析显示，该序列与所比较的小麦、山羊草、黑麦
和燕麦等的序列都不具有相对较近的亲缘关系，说明
华山新麦草的籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a 基因
(HM 448475)可能为 Pin a基因家族中的一个新类型。
而华山新麦草的 Pin b基因(HM 448476)与小麦、山羊
草、黑麦等亲缘植物的 Pin b 基因序列相比，变异位点
相对较少，只有 8 个主要位点的差异，系统进化分析显
示，该序列与所比较的小麦、山羊草、黑麦等的序列都
不具有相对较近的亲缘关系，而与智利大麦的 Hor-
doindoline b基因序列(GU 214830)具有相对较近的亲
缘关系。研究结果表明，华山新麦草的籽粒硬度吲哚
蛋白基因与小麦、山羊草等亲缘种属植物控制籽粒硬
度的等位基因具有较大差异，出现这些差异的原因可
能是由于华山新麦草的物种特异性所致。
近年来，以近缘野生物种为研究材料，挖掘新的种
质资源及其优异基因，已成为植物分子育种及遗传改
良的一个重要研究方向。华山新麦草为我国Ⅰ类珍稀
濒危植物和急需保护的农作物野生亲缘种，具有抗寒、
抗旱、耐瘠薄、早熟、优质、矮杆、抗病等优良特
性［14，15］。前人通过普通小麦与华山新麦草的远缘杂
交，已将其条锈病抗病基因和谷蛋白、醇溶蛋白等优质
基因转进普通小麦，并进行了遗传改良利用［16，17］;通
过系统进化和分子生物学的研究，获得了包括叶绿体
RNA 聚合酶 (rpo)基因、6-果聚糖转移酶基因
(6-SFT)、低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因和醇溶
蛋白基因等 30 个华山新麦草的相关基因序列［18 ～ 20］。
本研究获得了华山新麦草的籽粒硬度吲哚蛋白 Pin a
和 Pin b基因，为应用基因工程技术进行小麦品质性
状遗传改良提供了新的候选基因;对研究保护华山新
麦草这一珍稀濒危植物、开发利用华山新麦草的优异
基因、丰富小麦籽粒硬度基因资源具有一定的理论意
义和应用价值。
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研究报告 赵继新 等:华山新麦草籽粒硬度吲哚蛋白基因的分离与序列分析