全 文 ：麦类作物学报　２０１５，３５（１）：３０－３６
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－１０４１．２０１５．０１．０５
网络出版时间：２０１５－１－１３
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０１５０１１３．１６１７．００８．ｈｔｍｌ
华山新麦草穗发芽抗性相关基因ＡＩＰ２的克隆及其序列分析
收稿日期：２０１４－０９－１３　　　修回日期：２０１４－１０－１４
基金项目：农业部９４８项目（２０１３－Ｚ２８）；陕西省自然科学基础研究计划重点项目（２０１３ＪＺ００７）；陕西省重点科技创新团队计划支持
项目（２０１４ＫＣＴ－２５）
第一作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｚｈｅｎｚｈｅｎ１＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：陈新宏（Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｘｈ２０８９＠１２６．ｃｏｍ）
陈真真１，贺晓岚１，刘 红２，赵继新１，王亮明１，昝 凯１，武 军１，杨群慧１，陈新宏１
（１．西北农林科技大学农学院，陕西杨凌７１２１００；２．岐山县种子管理工作站，陕西岐山７２２４００）
摘　要：为了挖掘和利用华山新麦草（Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ，２ｎ＝１４，ＮｓＮｓ）的优良基因，拓宽小
麦穗发芽抗性基因资源，以华山新麦草为材料，采用同源克隆的方法克隆ＡＩＰ２基因，利用生物信息学软件分
析其基因结构及功能。结果表明，从华山新麦草中成功克隆ＡＩＰ２基因，该基因的开放阅读框为８４０ｂｐ，编码
２７９个氨基酸残基，结构域预测结果显示ＡＩＰ２蛋白含有完整的Ｒｉｎｇ保守域，属于锌指环家族成员。ＡＩＰ２的
ｇＤＮＡ含５个外显子，４个内含子，华山新麦草ＡＩＰ２氨基酸序列与感穗发芽小麦品种中优９５０７的ＡＩＰ２氨
基酸序列的相似性为８４％，与中优９５０７相比缺失了４４个氨基酸，与抗穗发芽的乌拉尔图小麦的ＡＩＰ２氨基
酸序列的相似性为８０％，华山新麦草和乌拉尔图小麦都有氨基酸缺失，推测这些缺失的氨基酸可能与华山新
麦草穗发芽抗性强有很大关系。本研究为小麦穗发芽抗性改良提供了新的候选基因。
关键词：华山新麦草；ＡＩＰ２基因；同源克隆；序列分析
中图分类号：Ｓ５１２．９；Ｓ３３２．９　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１５）０１－００３０－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｅ－ｈａｒｖｅｓｔ　Ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ　Ｒｅｌａｔｅｄ
Ｇｅｎｅ　ＡＩＰ２ｏｆ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ
ＣＨＥＮ　Ｚｈｅｎｚｈｅｎ１，ＨＥ　Ｘｉａｏｌａｎ１，ＬＩＵ　Ｈｏｎｇ２，ＺＨＡＯ　Ｊｉｘｉｎ１，ＷＡＮＧ　Ｌｉａｎｇｍｉｎｇ１，
ＺＡＮ　Ｋａｉ　１，ＷＵ　Ｊｕｎ１，ＹＡＮＧ　Ｑｕｎｈｕｉ　１，ＣＨＥＮ　Ｘｉｎｈｏｎｇ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｑｉｓｈａｎ　Ｃｏｕｎｔｙ　Ｓｅｅｄ　Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ　Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｑｉｓｈａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ　７２２４００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｐｒｅ－ｈａｒｖｅｓｔ　ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　Ｋｅｎｇ，
ｂｒｏａｄｅｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅ－ｈａｒｖｅｓｔ　ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｔｈｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ
ｔｏ　ｃｌｏｎｅｄ　ＡＩＰ２ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＰｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ（Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ，２ｎ＝１４，ＮｓＮｓ），
ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ＡＩＰ２ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ，ｔｈｅ　ＡＩＰ２
ｇｅｎｅ　ｗｉｔｈ　８４０ｂｐ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｅｎｃｏｄｅｄ　２７９ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ，
ＡＩＰ２ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ａ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ｒｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ　ｔｏ　ｂｅｌｏｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎ－
ｇｅｒ　ｒｉｎｇ．ＡＩＰ２ｇＤＮＡ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　５ｅｘｏｎｓ　ａｎｄ　４ｉｎｔｒｏｎｓ．ＨＳ－ＡＩＰ２ｈａｄ　８４％ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｗｈｅａｔ　ｖａｒｉｅｔｙ　Ｚｈｏｎｇｙｏｕ　９５０７，ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ
ｈａｒｖｅｓｔ　ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ，ａｎｄ　４４ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｍｉｓｓｉｎｇ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｏｆ　Ｚｈｏｎｇｙｏｕ　９５０７；ｂｅ－
ｓｉｄｅｓ，ｔｈｅ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ＡＩＰ２ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａａｎｄ
ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｈａｒｖｅｓｔ　ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ　ｖａｒｉｅｔｙ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｕｒａｒｔｕ　ｗａｓ　８０％，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｓｏｍｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｍｉｓｓｉｎｇ　ｉｎ
ｂｏｔｈ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　ａｎｄ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｕｒａｒｔｕ，ｉｔ　ｗａｓ　ｉｎｆｅｒｒｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｓｅ　ｍｉｓｓｉｎｇ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ
ｍｉｇｈｔ　ｈａｖｅ　ａ　ｇｒｅａｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｎｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｈａｒｖｅｓｔ　ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ
ｈｕａｓｈａｎｉｃａ．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｃｏｕｌｄ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｎｅｗ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｗｈｅａｔ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｆｏｒ　ｐｒｅ－ｈａｒｖｅｓｔ
ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ；ＡＩＰ２ｇｅｎｅ；Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
　　小麦成熟期穗发芽（ｐｒｅ－ｈａｒｖｅｓｔ　ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ，
ＰＨＳ）是指收获前小麦遇到潮湿的环境条件或阴
雨天气时籽粒在穗上萌动、发芽的现象，是一种世
界性的自然灾害［１］。穗发芽不仅降低小麦的产
量，而且严重影响小麦的品质和价值［２－４］。我国的
黄淮麦区、长江中下游、北部冬麦区和西南麦区是
小麦穗发芽危害频繁和严重的地区［５－６］。因此，对
小麦穗发芽抗性进行改良对我国乃至世界小麦育
种都具有十分重要的意义。
小麦穗发芽受多种因素调控，例如基因，酚类
物质，α－淀粉酶抑制蛋白等，但是最重要的是受基
因的调控［７］。在小麦中，许多与穗发芽抗性和种
子休眠有关的基因和 ＱＴＬ被鉴定［８－１０］。其中，
Ｖｉｖｉｐａｒｏｕｓ－１（Ｖｐ－１）基因在种子成熟、休眠、干燥
中起着重要的作用［１１－１３］。Ｖｐ－１基因最早在玉米种
子中被发现，它在玉米晚期的胚胎发育中起重要
的调节作用，ＶＰ－１基因在这个位点的失活会导致
胚胎发育受阻，进而导致穗发芽［１４］。小麦 Ｖｐ－１
基因的的三个等位基因 Ｖｐ－１Ａ、Ｖｐ－１Ｂ、Ｖｐ－１Ｄ是
Ｂａｉｌｅｙ等［１１］最先发现的，他们均存在４个氨基酸
序列保守区域，分别为 Ａ１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３区段［１１－１５］。
小麦 Ｖｐ－１基因的三个等位基因中，只有 Ｖｐ－１Ｂ的
转录本丰度在穗发芽抗、感品种间存在差异［１６］。
玉米中的 Ｖｐ－１基因和拟南芥中的 ＡＢＩ３（ａｂｓｃｉｓｉｃ－
ａｃｉｄ－ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　３）基因互为同源基因，在拟南芥
种子的发育进程中 ＡＢＩ３是一种重要的调节因子，
它可以通过调节胚对 ＡＢＡ的敏感性，进而调节
种子休眠与萌芽；ＡＢＩ３对芽休眠、质体发育和花
期延迟等方面也具有重要的调控作用［１７－２０］。
ＡＩＰ２（ＡＢＩ３ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２），ｌｅｃ２（ｌｅａｆｙ
ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ　２），ｆｕｓ３（ｆｕｓｃａ　３）等基因可以调控 ＡＢＩ３
的表达［１７，２１－２２］。ＡＩＰ２对ＡＢＡ信号的传导过程的
反式调控是通过 ＡＩＰ２使 ＡＢＩ３蛋白泛素化并通
过２６Ｓ蛋白途径的降解而实现的［１７］。ＡＩＰ２突变
体中的ＡＢＩ３蛋白含量比ＡＩＰ２基因过表达的植
物中含量高，表明ＡＩＰ２基因可能与穗发芽抗性
具有一定的联系［１７］。
华山新麦草（Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ，
２ｎ＝１４，ＮｓＮｓ）是小麦的重要野生近缘种质资源
种［２３］。因此对华山新麦草穗发芽抗性基因的克
隆有助于拓宽小麦遗传改良的资源。迄今为止，
华山新麦草ＡＩＰ２基因的序列还未见相关的报
道。ＡＩＰ２基因具有高度的保守性，推测其在华
山新麦草中也具有相似的功能。本研究通过同源
克隆法克隆华山新麦草的ＡＩＰ２基因，并通过生
物信息学软件对ＡＩＰ２基因进行分析，以期为小
麦种质资源改良提供一定的理论依据和新的候选
基因。
１　材料与方法
１．１　实验材料
试验材料为华山新麦草（Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ
ｈｕａｓｈａｎｉｃａ），种植于西北农林科技大学植物所。
１．２　实验方法
１．２．１　华山新麦草基因组ＤＮＡ的提取
使用天根ＤＮＡ提取试剂盒，参照该试剂盒
提供的方法进行ＤＮＡ提取。
１．２．２　引物设计和基因克隆
引物的设计参照胡翠花等［２４］的方法，引物由
上海生工生物工程技术服务有限公司合成。分别
以Ｆ１／Ｒ１、Ｆ２／Ｒ２为引物对华山新麦草基因组
ＤＮＡ进行扩增。以Ｆ１／Ｒ１为引物扩增出的片段
与以Ｆ２／Ｒ２为引物扩增出的片段会有一部分重
叠，最后通过ＤＮＡＭＡＮ拼接获得该基因序列全
长。２５μＬ　ＰＣＲ扩增体系含ｄＮＴＰｓ　２．０μＬ（２．５
μｍｏｌ·ｍＬ
－１）、１０×ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ、ｒ　Ｔａｑ　０．２５
μＬ、上下游引物各１．０μＬ（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１）、ＤＮＡ
１．０μＬ（１３０μｇ·μＬ
－１）、ｄｄＨ２Ｏ　１７．２５μＬ。ＰＣＲ
扩增程序：９５℃预变性４ｍｉｎ；９５℃变性４０ｓ，
５４℃退火４５ｓ（Ｆ１／Ｒ１这对引物），５２℃退火４５ｓ
（Ｆ２／Ｒ２这对引物），７２℃延伸２ｍｉｎ，３４个循环；
７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物在１５０Ｖ，２００
ｍＡ条件下，经１％琼脂糖凝胶电泳检测后，回收
并纯化目标片段，将目的片段连接于ｐＥＡＳＹ－Ｔ１
载体（购于北京全式金公司）上进行ＴＡ克隆。对
阳性克隆进行初步鉴定后，吸取１．０μＬ的菌液送
给上海生工生物工程技术服务有限公司进行
测序。
·１３·第１期 陈真真等：华山新麦草穗发芽抗性相关基因ＡＩＰ２的克隆及其序列分析
１．２．３　华山新麦草ＡＩＰ２功能预测
利用生物信息学软件对ＡＩＰ２基因进行分
析，软件来源如下：
序列的拼接和比对分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｙｎ－
ｎｏｎ．ｃｏｍ／；Ｂｌａｓｔ，ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｎ．
ｇｏｖ／）；
开放阅读框的查找（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｏｒｆ／ｏｒｆｉｇ．ｃｇｉ）；
蛋白质一级结构的分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘ－
ｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）；
蛋白质二级结构的预测（ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ－ｐｂｉｌ．
ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝／
ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿ｈｎｎ．ｈｔｍｌ）；
蛋白质三级结构的预测（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄ－
ｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）；
结构域的分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．
ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）；
信号肽的分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／
ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）；
跨膜区的分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／
ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）；
亚细胞定位 （ｈｔｔｐ：／／ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ．ｓｅｑ．ｃｂｒｃ．
ｊｐ／）。
１．２．４　华山新麦草 ＡＩＰ２氨基酸序列与其他植物
ＡＩＰ２基因编码的氨基酸序列的比较
利用Ｃｌｕｓｔａｌ软件对 ＡＩＰ２氨基酸序列与选取
的具有不同穗发芽抗性的普通小麦、二穗短柄草、
短花药野生稻、乌拉尔图小麦和拟南芥等的
ＡＩＰ２氨基酸进行多序列比对分析。
１．２．５　进化分析
在ＧｅｎＢａｎｋ数据库中查找与华山新麦草的
ＡＩＰ２氨基酸序列相似度较高的１２个物种的该基
因的氨基酸序列，利用 ＭＥＧＡ４［２５］构建系统进
化树。
２　结果与分析
２．１　华山新麦草ＡＩＰ２基因的克隆及其序列
分析
以华山新麦草基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ
扩增，ＰＣＲ产物在１％琼脂糖凝胶中进行电泳检
测（图１）。扩增到预期的２条特异性片段，对目
的条带进行切胶回收，将回收到的目的片段连接
到ｐＥＡＳＹ－Ｔ１载体上，并转入大肠杆菌 ＤＨ５α
中，菌落ＰＣＲ初步鉴定及单双酶切鉴定后，分别
选取３个阳性克隆，提交上海生物工程技术有限
公司进行测序。测序后，用ＤＮＡＭＡＮ进行拼接
得到以Ｆ１／Ｒ１为引物扩增出的片段长度为１　８０７
ｂｐ，以Ｆ２／Ｒ２为引物扩增出的片段长度为１　７６９
ｂｐ，这两段产物有３２７ｂｐ的重叠区域，最后通过
拼接得到该基因的全长序列为３　２４９ｂｐ，该基因
有５个外显子，４个内含子。将获得的基因在
ＮＣＢＩ中进行比对，结果显示与ＡＩＰ２基因高度
相似。开放阅读框预测结果显示克隆到的ＡＩＰ２
基因的编码区长为８４０ｂｐ，编码２７９个氨基酸
残基。
　　Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｋｅｒ　ＤＬ２０００；１～３：华山新麦草（Ｆ１／Ｒ１）；４和
５：华山新麦草（Ｆ２／Ｒ２）
Ｍ：ＤＮＡ　Ｍａｋｅｒ　ＤＬ２０００；１，２ａｎｄ　３：ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ
Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａ（Ｆ１／Ｒ１）；４ａｎｄ　５：ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａ
（Ｆ２／Ｒ２）
图１　华山新麦草ＡＩＰ２基因的ＰＣＲ扩增结果
Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＩＰ２ｆｒｏｍＰ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａ
２．２　华山新麦草ＡＩＰ２蛋白的结构与功能预测
ＡＩＰ２蛋白一级结构分析显示，该蛋白为不稳
定、亲水性蛋白。ＡＩＰ２蛋白的理论等电点ｐＩ为
５．３０，２８０ｎｍ处的消光系数约为０．６０７，不稳定
系数为４２．７２，脂溶指数为７６．６７，相对分子质量
为３１　２０４．５，体外半衰期为３０ｈ。
ＡＩＰ２蛋白的二级结构以不规则盘绕，α－螺旋
和延伸链为蛋白主要的结构元件，α－折叠散布于
整个蛋白质中。亚细胞定位分析可知，有１０％的
可能性存在于内质网中。结构功能域分析表明，
ＡＩＰ２蛋白属于 ＲＩＮＧ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，该蛋白含有
完整的锌指环保守域（图２）。跨膜区分析结果
（图３）表明，ＡＩＰ２无明显跨膜区，不可能是膜上
的受体或定位于膜上。信号肽在线预测结果表
明，ＡＩＰ２蛋白不含有信号肽，说明 ＡＩＰ２可能是
位于细胞质中的一个基质蛋白。
　　利用Ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ对 ＡＩＰ２蛋白的三级结构
·２３· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３５卷
进行在线预测，其立体结构如图４所示。ＡＩＰ２蛋 白的寡聚状态为同型二聚体，没有配体。
图２　华山新麦草ＡＩＰ２蛋白的功能域预测
Ｆｉｇ．２　Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　ＡＩＰ２ｐｒｏｔｅｉｎ
图３　华山新麦草ＡＩＰ２蛋白的跨膜区预测
Ｆｉｇ．３　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｉｎ
Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　ＡＩＰ２ｐｒｏｔｅｉｎ
图４　华山新麦草ＡＩＰ２蛋白三级结构的分析
Ｆｉｇ．４　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｏｆ　Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　ＡＩＰ２ｐｒｏｔｅｉｎ
２．３　华山新麦草ＡＩＰ２蛋白与其他物种ＡＩＰ２基
因编码的氨基酸序列的比较
利用Ｃｌｕｓｔａｌ软件对 ＡＩＰ２蛋白与植物中已
克隆的ＡＩＰ２基因编码氨基酸序列进行多序列比
对分析（图５）。结果表明，华山新麦草的 ＡＩＰ２与
所选取的植物 ＡＩＰ２氨基酸序列在黑色方框内差
异较大。在黑色方框内华山新麦草与普通小麦相
比缺失了４４个氨基酸，与二穗短柄草相比连续缺
失了４８个氨基酸，与短花药野生稻相比缺失了
４４个氨基酸，与乌拉尔图小麦相比缺失了２５个
氨基酸，与拟南芥相比缺失了２８个氨基酸。
２．４　华山新麦草ＡＩＰ２基因与植物中已克隆的
ＡＩＰ２基因的系统进化树分析
利用克隆到的华山新麦草的ＡＩＰ２氨基酸序
列与选择的１２种植物的ＡＩＰ２基因编码蛋白构
建该基因的系统进化树。系统进化树分析结果发
现，这１３条序列可被聚为２大类，双子叶植物聚
为一类，单子叶植物聚为一类（图６）。双子叶植
物分支中，两种不同的大豆氨基酸序列间的相似
性最高。单子叶植物分支中，本研究得到的华山
新麦草的ＡＩＰ２氨基酸序列和普通小麦的氨基酸
序列聚在一起，说明华山新麦草的ＡＩＰ２氨基酸
序列和普通小麦的氨基酸序列具有相对较近的亲
缘关系；在单子叶植物分支中，华山新麦草的
ＡＩＰ２氨基酸序列与粟、短花药野生稻和乌拉尔
图小麦等的ＡＩＰ２氨基酸序列具有相对较远的亲
缘关系。
３　讨 论
ＡＩＰ２最早是从拟南芥种子和角果的ｃＤＮＡ
文库中被Ｋｕｒｕｐ等［２６］利用酵母双杂交的方法筛
选出的与ＡＢＩ３互作的蛋白ＡＩＰＳ（ＡＢＩ３－ｉｎｔｅｒａｃ－
ｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。目前ＡＩＰ２基因已经从拟南芥、
拟斯卑尔脱粗山羊草、小麦、大麦、玉米、水稻、二
穗短柄草等植物中克隆到［２４，２６－２９］。本研究从华山
新麦草中克隆到ＡＩＰ２基因，推测该基因的表达
与穗发芽抗性有关。Ｂｌａｓｔ比对分析表明，所获得
的序列与小麦ＡＩＰ２基因具有高度的相似性，在
核苷酸水平达到９６％以上；结构功能域分析表
明，华山新麦草ＡＩＰ２基因所编码的蛋白属于
ＲＩＮＧ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，其仍具有保守的结构域。含
有锌指环结构域的蛋白在生物体内大部分为Ｅ３
连接酶，主要参与蛋白的泛素化反应［３０－３１］。泛素
化反应的作用机制已基本研究清楚：首先单个游
离的泛素的活化通过泛素的Ｃ端与Ｅ１活性中心
的Ｃｙｓ残基形成硫酯键而实现，然后活化的泛素
·３３·第１期 陈真真等：华山新麦草穗发芽抗性相关基因ＡＩＰ２的克隆及其序列分析
由Ｅ１递交给Ｅ２，最后泛素由Ｅ３介导从Ｅ２转移
到靶蛋白［３０］。泛素途径底物的特异的识别取决
于泛素连接酶 Ｅ３，细胞内的信号传导、细胞周期
调控、ＤＮＡ 修复、胞吞作用、蛋白质质量控制等
多种生理活动的调节都通过泛素化途径［３１］。对
拟南芥的研究表明：ＡＩＰ２编码Ｅ３连接酶，ＡＩＰ２
能使ＡＢＩ３多聚泛素化并通过２６Ｓ蛋白酶途径降
解，最终达到调节穗发芽性状的目的［１７，２６］；Ｒｉｎｇ
突 变 体 （２３０，２３１ 位 的 半 胱 氨 酸 突
变 成丝氨酸）是无活性的，完整的Ｒｉｎｇ基序
　　 ＡＣＭ９０５１９．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｚｈｏｎｇｙｏｕ　９５０７；ＡＣＭ９０５１８．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ；Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｐｓａｔｈｙ－
ｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ；ＸＰ＿００３５７８１６１．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ；ＸＰ＿００６６６０６５２．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｏｒｙｚａ　ｂｒａｃｈｙａｎｔｈａ；ＸＰ＿
００４９５６９１４．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍＳｅｔａｒｉａ　ｉｔａｌｉｃａ；ＥＭＳ４９５６８．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｕｒａｒｔｕ；ＸＰ＿００３５４４５７８．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ；ＸＰ＿
００３５５０２３０．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍＧｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ；ＡＧＶ５４７０８．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍＰｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ；ＡＧＶ５４２８８．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍＰｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ；ＮＰ
＿１９７５９１．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；ＣＡＢ７５５０９．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
方框内表示序列差异比较明显的区域 Ｔｈｅ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｖａｒｉａｎｔ　ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ａｒｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｏｘ
图５　华山新麦草ＡＩＰ２氨基酸序列与其他植物的ＡＩＰ２氨基酸的序列比对
Ｆｉｇ．５　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＡＩＰ２ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａ　ｗｉｔｈ　ｔｈａｔ　ｆｒｏｍ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
·４３· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３５卷
　　ＡＣＭ９０５１９．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｚｈｏｎｇｙｏｕ　９５０７；ＡＣＭ９０５１８．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ；Ｐｓａｔｈｙｒｏｓｔａｃｈｙｓ：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｐｓａｔｈｙ－
ｒｏｓｔａｃｈｙｓ　ｈｕａｓｈａｎｉｃａ；ＸＰ＿００３５７８１６１．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ；ＸＰ＿００４９５６９１４．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｓｅｔａｒｉａ　ｉｔａｌｉｃａ；ＸＰ＿
００６６６０６５２．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍＯｒｙｚａ　ｂｒａｃｈｙａｎｔｈａ；ＥＭＳ４９５６８．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｕｒａｒｔｕ；ＮＰ＿１９７５９１．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉ－
ａｎａ；ＣＡＢ７５５０９．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；ＡＧＶ５４２８８．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ；ＡＧＶ５４７０８．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍ　Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ
ｖｕｌｇａｒｉｓ；ＸＰ＿００３５４４５７８．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍＧｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ；ＸＰ＿００３５５０２３０．１：ＡＩＰ２ｆｒｏｍＧｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ
图６　华山新麦草ＡＩＰ２基因的进化树分析
Ｆｉｇ．６　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ＡＩＰ２ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｐ．ｈｕａｓｈａｎｉｃａａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
对于ＡＩＰ２的活性是必要的［１７］。本研究发现，华
山新麦草ＡＩＰ２蛋白含有完整的Ｒｉｎｇ基序，属于
锌指环家族成员，华山新麦草在其２００～２４０氨基
酸残基之间有其保守结构域，拟南芥在其２０４～
２７７氨基酸残基之间有其保守结构域。华山新麦
草和拟南芥的保守结构域虽然位置不同，但是他
们都具有完整的Ｒｉｎｇ基序，由此推测华山新麦草
的ＡＩＰ２基因和拟南芥的ＡＩＰ２基因具有相似的
功能，即具有穗发芽抗性功能。
本研究通过同源性分析发现，华山新麦草
ＡＩＰ２氨基酸序列与已知感穗发芽小麦的ＡＩＰ２
氨基酸序列的相似性为８４％，与感穗发芽小麦相
比缺失了４４个氨基酸；与抗穗发芽的短花药野生
稻ＡＩＰ２氨基酸序列的相似性为７２％，与抗穗发
芽的乌拉尔图小麦ＡＩＰ２氨基酸序列的相似性为
８０％，与抗穗发芽的拟南芥ＡＩＰ２氨基酸序列的
相似性为４９％。华山新麦草与具有穗发芽抗性
的短花药野生稻、乌拉尔图小麦和拟南芥在序列
差异明显的区域都有氨基酸的缺失。由此推测该
区域氨基酸的缺失可能对华山新麦草的穗发芽抗
性具有重要影响，具体的关于华山新麦草ＡＩＰ２
基因对穗发芽抗性调节过程中的基因表达调控功
能仍需进一步研究。在以后的研究中，我们可以
通过分析华山新麦草ＡＩＰ２序列和易感穗发芽的
小麦的ＡＩＰ２序列差异和在成熟种子中的表达特
性，在华山新麦草ＡＩＰ２序列和易感穗发芽的小
麦的ＡＩＰ２序列的差异最大处即非保守区设计引
物，开发一种新的与小麦穗发芽抗性相关的标记，
以期应用于小麦优质种质资源的筛选和分子标记
辅助育种，从中筛选出具有穗发芽抗性的品种，为
小麦育种提供优质的种质材料。
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ｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　２４７８３ｂａｒｌｅｙ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ
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