全 文 ：麦类作物学报　2008 , 28(5):733-737
Journal o f T riticeae Crops
华山新麦草 (Psathyrostachys huashanica)
LMW-GS基因的克隆和序列分析＊
王建伟1 ,陈新宏1 ,赵继新1 ,武　军1 ,程雪妮2 ,
刘淑会1 ,杨群慧1 ,吉万全1
(1.西北农林科技大学农学院 ,陕西杨凌 712100;2.西北农林科技大学生命学院 ,陕西杨凌 712100)
　　摘　要:为了挖掘和利用华山新麦草(Psathy rostachy s huashanica Keng)的优良基因 ,应用 PCR技术对
华山新麦草低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因进行了分子克隆和序列分析。结果表明 , 华山新麦草
LMW-GS 基因(HS-LMW-1)长度为 866 bp , 通过提交 NCBI 进行同源性比较 , HS-LMW-1 与小麦属 LMW-
GS 基因序列的同源性在 83%以上 , 其中与 Thinop y rum intermedium 的 LMW-GS 基因序列(GenBank 登录
号:AY214454)相似性达 92%,进一步将其翻译为氨基酸序列 ,分析结果显示它具有小麦属 LMW-GS 序列的
典型特征 ,具有完整的编码区 , 能够编码 274 个氨基酸的成熟蛋白 ,与小麦属 Glu-B 3 和 Glu-D 3 位点编码的
LMW-GS 基因有很高的一致性 ,表明 HS-LMW-1 基因可能由华山新麦草的 Glu-Ns3 位点编码。
　　关键词:华山新麦草;低分子量谷蛋白亚基基因;克隆;序列分析
　　中图分类号:S512.9;S336　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1009-1041(2008)05-0733-05
Molecular Cloning and Sequence Analy sis of LMW-GS
Genes from Psathy rostachy s huashanica
WANG Jian-wei1 , CHEN Xin-hong1 , ZHAO Ji-xin1 , WU Jun1 , CHENG Xue-ni2 ,
LIU Shu-hui1 , YANGQun-hui1 , JI Wan-quan1
(1.College of Ag ron omy , Northw est A&F Universi ty , Yan gling , Shaan xi 712100 , China;2.College of Life
S cien ces , Northw est A&F Universi ty , Yangling , Shaan xi 712100 , China)
Abstract:P sathy rostachy s huashanica Keng.is an endemic species in China and has been listed as an
endangered and imperatively pro tected w ild species.In order to find and uti lize the advantageous gene s
of P.huashanica , LMW glutenin subunit(LMW-GS)gene from P .huashanica was cloned by PCR
technique and analy zed .The resul ts show ed that the leng th of the LMW glutenin subuni t g ene of P.
huashanica(HS-LMW-1)was 866 bp ,BLAST search showed that HS-LMW-1 w as over 83%homo l-
ogies in nucleo tide sequence to LMW-GS genes f rom T ri ticum , especially 92%homologies to LMW-GS
genes f rom Thinopy rum intermedium , and this proved HS-LMW-1 w as the LMW glutenin subunit
gene of P.huashanica .The amino acid sequence deduced from HS-LMW-1 has the typical character
of LMW-GS from T ri ticum , and has a comp1ete coding region encoded a mature pro tein of 274 amino
acid residues.It w as found that it was highly simi lar to tho se of Glu-B 3 and Glu-D3 locus in Tri ticum
aest ivum , this suggested that HS-LMW-1 might be Glu-N s3 locus o f P.huashanica.
Key words:P sathy rostachy s huashanica ;LMW-GS gene;Cloning;Sequence Analy sis
＊收稿日期:2008-05-02　　　修回日期:2008-07-05
基金项目:国家自然科学基金项目(30771345);国家发改委高技术产业化专项(2005-1899);教育部“新世纪人才支持计划”项目
(NCET-06-0862);西北农林科技大学科研专项(06ZR016)。
作者简介:王建伟(1982-),男 ,硕士研究生 ,主要从事作物遗传育种研究。
通讯作者:赵继新(1971-),男 , 助理研究员 ,主要从事作物遗传育种研究。 E-m ail:zh jx881@163.com。
　　华山新麦草(Psathyrostachy s huashanica
Keng , 2n=14 , NsNs)是禾本科(Poaceae)小麦族
(Tri ticeae)大麦亚族新麦草属的一种多年生草本
植物 ,分布在中国秦岭山脉华山段 ,为中国特有
种 ,是国家 Ⅰ类珍稀濒危植物和急需保护的农作
物野生亲缘物种 。Dew ey 等 [ 1] 、Wang R C 等[ 2] 、
Hsiao C 等[ 3]确认新麦草属的染色体组为 Ns ,是
赖草属(Leymus)中四倍体物种 N 染色体组的二
倍体供体种。华山新麦草是小麦重要野生近缘种
质资源种[ 4] ,具有抗寒 、抗旱 、耐瘠薄 、早熟 、优质 、
矮秆 、抗病等特点[ 5 ～ 7] 。自 20世纪 90年代以来 ,
许多研究者对华山新麦草进行了研究 。杭焱
等[ 8] 、王丽等[ 9] 、刘文献等 [ 10] 利用分子标记技术
对华山新麦草的遗传多样性 、生殖生态及濒危原
因进行了研究。Hai-qin Zhang 等 [ 11]进行了华山
新麦草与长芒猬草(H.d uthiei ssp .longearista-
ta)的杂交研究。陈漱阳等[ 12 , 13] 首先进行了普通
小麦与华山新麦草的杂交研究 ,成功获得了小麦
与华山新麦草的杂交后代材料 H8911 ,并选育出
一系列小麦-华山新麦草异附加系 。侯文胜等
[ 14] 利用 H8911与缺体小麦回交获得了小麦-华山
新麦草的 3D和 5A异代换系。赵继新等[ 15] 利用
基因组原位杂交和染色体 C-分带技术 ,鉴定出普
通小麦-华山新麦草的 3D/4N 、5A/5N 异代换系
和 5N 、6N 异附加系 。曹张军等 [ 16] 对小麦背景
中来自华山新麦草的抗条锈病基因 Yr Hua 进行
了遗传学分析和分子标记定位研究。武军等[ 17]
利用 SSR 标记和基因组原位杂交(GISH)对小
麦-华山新麦草异附加系进行了研究。
低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)对小麦品
质具有重要影响 。研究认为 , LMW-GS 大约占谷
蛋白总量的 60%左右 , 占种子贮藏蛋白的 1/3 ,
可以形成与面筋强度有关的聚合体 , 其等位变异
与面包小麦的面筋品质密切相关[ 18] 。近年来 ,小
麦 LMW-GS 基因的分子克隆逐渐受到重视。据
不完全统计 ,目前普通小麦至少获得了 114 个
LMW-GS 的基因克隆和序列(www .ncbi.nlm.
nih.gov)。通过比较 LMW-GS基因序列 ,研究者
发现 ,LMW-GS 基因的编码区都很保守 ,编码基
因两端核苷酸序列的高度保守性为采用 PCR法
分离克隆 LMW-GS新基因提供了可能[ 19] 。在小
麦亲缘种属植物中 , LMW-GS 基因克隆研究较
少 ,目前仅获得西藏半野生小麦 、新疆稻麦 、节节
麦 、钩刺山羊草 、高冰草(长穗偃麦草)和黑麦等植
物的 LMW-GS基因序列。迄今为止 ,华山新麦草
LMW-GS基因的序列尚未见报道。
本研究通过已经公布的小麦及其亲缘种属植物
的 LMW-GS基因序列 ,设计引物 ,采用 PCR方法分
离克隆华山新麦草的 LMW-GS基因 ,目的是为研究
和利用华山新麦草的优良基因提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　供试材料
华山新麦草采自陕西华山 ,种植于西北农林
科技大学试验地。
1.2　试验方法
1.2.1　华山新麦草基因组 DNA 提取　参照王关
林等主编的《植物基因工程》的SDS提取法[ 20] 。
1.2.2　引物设计及 PCR扩增　根据已发表的
LMW-GS 基因序列 ,设计了扩增低分子量谷蛋白
基因完整编码区的 PCR 引物[ 21] :上游引物
LMW-P1:5 -GACA TGA TTACGCCAGCA T-
GC-3 ,下游引物 LMW-P2:5 -TGCTG TTGAG-
G TTGT TGGAAAGA-3 , 由上海生物工程技术
有限公司合成 。
20 μL 反应体系中含模板 50 ng ,引物 P1 、
P2 各 0.2 μmo l/ L , Tag DNA 聚合酶 0.5 U ,
dN TPs 为 0.2 mmol/ L 。反应程序为:95 ℃预
变性 5 min ;94 ℃变性 1 min 、59 ℃退火 1 min 、
72 ℃延伸 3 m in ,共 36 个循环。
1.2.3　PCR 产物的克隆 、测序及序列分析　扩
增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离后 ,用 DNA 凝
胶回收试剂盒(TIAN GEN ,北京)将目的片段回
收纯化 , 连接于 pMD19-T 载体(TAKARA , 大
连)上 。将连接好的质粒热激转化已准备好的感
受态细胞 DH5α中 。通过蓝白筛选和菌落 PCR
初步鉴定及单双酶切鉴定后 ,将阳性菌落于 37 ℃
震荡培养过夜 ,次日收集菌体 ,提取质粒 ,质粒经
单双酶切鉴定后送至上海生物工程技术有限公司
完成测序 。
1.2.4 　序列分析 　将所获得的华山新麦草
LMW-GS 基因序列提交至 ht tp://www .ncbi.
nlm .nih.gov/ blast/Blast.cgi进行序列比对 ,提
交到 http:// searchlaunche r.bcm.tmc.edu/ seq-
util.html 进行翻译 ,将翻译到的氨基酸序列提交
到 http://www .ebi.ac.uk/ fasta33 进行氨基酸
同源性分析。
·734· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　第 28 卷
2　结果与分析
2.1　华山新麦草 LMW-GS基因的扩增
以华山新麦草基因组 DNA为模板进行 PCR
扩增 , PCR 产物在 1%琼脂糖凝胶中进行电泳检
测(图 1)。华山新麦草基因组 DNA 经 PCR反应
后 ,扩增得到了 3条电泳条带 ,其中 2个条带大于
1 200 bp ,亮度较弱 ,且比预期的小麦及其亲缘种
属的 LMW-GS 基因序列编码区长度偏大 ,不予
回收。而在 800 ～ 1 200 bp之间的 1个条带亮度
最亮 ,与预期的小麦及其亲缘种属的 LMW-GS
基因序列编码区的长度较为接近 ,故对该条带进
行切胶回收和克隆。
2.2　华山新麦草 LMW-GS 基因的克隆与序列
分析
将回收到的目的片段连接到 pMD19-T 载体
上 ,并转入大肠杆菌 DH5α中 ,蓝白斑筛选和菌落
PCR初步鉴定及单双酶切鉴定后 ,选出 1 个阳性
克隆 ,提交上海生物工程技术有限公司进行测序。
测序结果 ,其序列长度为 866 bp;将该序列提交
至 ht tp://www .ncbi.nlm .nih.gov/blast/
Blast.cgi进行序列比对(表 1),结果表明该序列
与普通小麦的 LMW-GS 基因序列(GenBank 登
录号分别为 EU369720 、AB062858 、AB062852 、
AB062859)相似性为 83%～ 93%,与硬粒小麦的
LMW-GS 基 因 序 列 (GenBank 登 录 号 为
DQ659333)相似性为 87%, 与 Thinopy rum in-
termedium 的 LMW-GS 基因序列(GenBank 登
录号为 AY214454)相似性为 92%,与 Aegi lops
uniaristata 和 Aegi lops long issima 的 LMW-GS
基因序列(GenBank 登录号为 EU571724 和
EU305550)相似性都为 82%。其中一致性最高
的是来自普通小麦的基因 AB062859 和来自
Thinopy rum intermed ium 基因 AY214454。初
步说明 ,克隆到的序列为华山新麦草 LMW-GS
基因 ,将其定名为 HS-LMW-1 。
　　M :为标准分子量;1 , 2:华山新麦草
M :Marker III;1 and 2:PCR p rodu ctions of P.huashanica
图 1　华山新麦草 LMW-GS基因 PCR 扩增的电泳检测
Fig.1　PCR produc of LMW-GS in P.huashanica
表 1　华山新麦草 LMW-GS基因序列的一致性比对
Table 1　Identity of LMW-GS gene sequences of Psathy rostachy s huashanica
GenBank登录号
No.of GenBank accession 来源Source 编码位点Locu s 一致性Ident ity(%) 参考文献Reference
EU369720 Tr i ticum aest ivum Glu-B 3 83 Wan g L , 2007
AB062858 Tr i ticum aest ivum Glu-B 3 87 Ikeda T M , 2001
AB062852 Tr i ticum aest ivum Glu-B 3 83 Ikeda T M , 2001
DQ659333 Tr i ticum turg idum 87 Gao S C , 2006
AY214454 Th inop yrum intermed ium 92 Xu H , 2003
AB062859 Tr i ticum aest ivum Glu-B 3 93 Ikeda T M , 2001
EU571724 Aegi lo ps uniari stata 82 Li X ,2008
EU305550 Aegi lo ps long issima 82 H uang Z , 2007
2.3　华山新麦草 LMW-GS基因氨基酸序列的同
源性分析
将得到的华山新麦草的 HS-LMW-1 基因提
交至 ht tp:// searchlauncher.bcm.tmc.edu/ seq-
util/ seq-util.html 网站进行翻译 ,根据通用三联
体密码推导的氨基酸序列显示 ,该序列具有单一
完整的开放阅读框(ORF), 其中在 3 端有 24个
碱基的非翻译区 ,在 5 端有 17 个碱基的非翻译
区 ,可编码 274个氨基酸残基的成熟蛋白 ,该序列
富含赖氨酸和脯氨酸 , 含量分别为 36.8%和
19.5%,其次是丝氨酸和亮氨酸含量较丰富 ,含量
分别为 7.4%和 6.1%。华山新麦草 HS-LMW-1
基因序列的结构包括由 22个氨基酸残基组成的
信号肽(Signal peptide), 13 个氨基酸残基组成
的 N-末端保守区(N-terminal do-main), N-末端
区之后是由重复短肽组成的重复区 (Repeti tive
domain),116个氨基酸残基组成 ,该区富含谷氨
酰胺(Q)和脯氨酸 (P),含有 14 个重复单元 、13
·735·第 5 期　　　　　王建伟等:华山新麦草(Psathy rostachys huashanica)LMW-GS 基因的克隆和序列分析
种短肽 ,其中 PPFSQQQQ 是重复次数最多的短
肽。最后是保守的 C-末端区(C-te rm inal do-
main),由 123个氨基酸残基组成 ,该区域共有 5
个半胱氨酸残基 。由于该序列与 Cassidy et al.
建立的 LMW-GS 多肽结构模型[ 2] 一致 , 即具有
保守的信号肽 、N-末端区和 C-末端区 ,重复区富含
谷氨酰胺(Q)和脯氨基酸(P)。因此 ,所得到的
HS-LMW-1 基因序列就是华山新麦草 LMW-GS
基因序列。
图 2　推导的华山新麦草 LMW-GS基因氨基酸序列 ,“ ＊”表示终止密码子
Fig.2　Deduced amino acid sequences of LMW-GS from Psathyrostachys huashanica;“ ＊” indicates stop codon
　　把翻译得到的氨基酸序列提交到 ht tp://
www .ebi.ac.uk/ fasta33/ 进行同源性分析 ,结果
(表 2)显示 ,华山新麦草 LMW-GS 氨基酸序列与
已知普通小麦 LMW-GS 氨基酸序列的相似性为
76.7% ～ 80.6%;与 Aeg ilops long issima 的
LMW-GS 氨基酸序列(GenBank登录号 A2IBJ8)
的相似性为 80.4%;与 Aegi lops tauschi i 的
LMW-GS 氨基酸序列(GenBank 登录号分别为
A7KJC4 、A 7KJC8 、A7KJC6 、A7KJC5 、A7KJC7)
的相似性为76.4%～ 77.1%;与 Thinopyrum in-
termedium 的 LMW-GS 氨基酸序列(GenBank
登录号 Q 84U16)的相似性为 78.7%。由于这些
低分子量谷蛋白基因都是由普通小麦 Glu-D3位
点表达 ,因此所得到的华山新麦草 LMW-GS 基
因应为 Glu-N s3位点表达。
表 2　LMW-GS基因推导的氨基酸序列的一致性比对
Table 2　Identity of deduced amino acid sequences of LMW glutenin
GenBank登录号
No.of GenBank accession 来源S ou rce 编码位点Locu s 一致性Ident ity(%) 相似性Smilar(%) 参考文献Referen ce
Q0GNG1 Tri ticum aest iv um 68.9 79.4 Wang Y S , 2005
Q8W3W8 Tri ticum aest iv um 70.3 80.6 Ikeda T M , 2002
A2IBJ8 Aeg ilo ps long issima 69.5 80.4 Jiang C , 2006
A7KJC4 Aeg ilo ps ta uschi i Glu-D t3 67.8 76.7 Zhao X L , 2007
A7KJC8 Aeg ilo ps ta uschi i Glu-D t3 67.8 76.7 Zhao X L , 2007
A7KJC6 Aeg ilo ps ta uschi i Glu-D t3 67.4 77.1 Zhao X L , 2007
A7KJC5 Aeg ilo ps ta uschi i Glu-D t3 67.8 76.7 Zhao X L , 2007
B2BZD0 Tri ticum aest iv um Glu-D3 67.1 76.7 H uang X Q , 2008
Q00M 55 Tri ticum aest iv um Glu-D3 67.1 76.7 Zhao X L , 2006
Q8W3X5 Tri ticum aest iv um 70.3 80.6 Ikeda T M , 2002
A7KJC7 Aeg ilo ps ta uschi i Glu-D t3 67.4 76.4 Zhao X L , 2007
Q84U16 Th inop yrum intermed ium 71.1 78.7 Xu H , 2003
3　讨论
根据小麦 LMW-GS基因设计的引物在华山
新麦草中扩增出 LMW-GS 基因 ,说明 LMW-GS
基因序列在编码区的两端不仅在小麦中具有保守
序列 ,而且在华山新麦草中也具有相同的保守序
列。本文所获得的 HS-LMW-1 基因序列与普通
小麦 LMW-GS 基因序列一致性从 83%到93%变
化 ,这可能是由于进化和选择以及杂交引起的 ,而
这些 LMW-GS 基因都是来自普通小麦 Glu-B 3
·736· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　第 28 卷
位点 ,所以推测华山新麦草中的 LMW-GS 基因
可能和普通小麦 Glu-B3 位点的 LMW-GS 基因
具有共同的起源 。同时 ,克隆到的华山新麦草的
LMW-GS 基因序列与硬粒小麦 、Thinopy rum in-
termedium 、Aegi lops uniaristata 和 Aegi lops
longissima 的一致性分别为 92%、87%、82%和
82%,说明克隆到的华山新麦草的 LMW-GS 基
因(HS-LMW-1 )属于小麦属 LMW-GS 基因。
由于普通小麦 LMW-GS 基因被定位在 Glu-A 3 、
Glu-B 3或 Glu-D3位点 ,因此 ,推测本文所获得的
华山新麦草 LMW-GS 基因(HS-LMW-1 )是由
Glu-N s3位点表达的 。
Cassidy et al 建立了 LMW-GS 多肽结构模
型 ,认为小麦属 LMW-GS 多肽结构是由保守的
信号肽 、N-末端区 、C-末端区和富含谷氨酰胺(Q)
与脯氨基酸(P)的重复区所组成 。本文获得的华
山新麦草 LMW-GS多肽结构与 Cassidy et al 建
立的 LMW-GS 多肽结构模型[ 2] 一致 ,即也具有
保守的信号肽 、N-末端区 、C-末端区和富含谷氨
酰胺(Q)与脯氨基酸(P)的重复区 。LEW et al.
[ 22] 根据 LMW-GS 的 N-末端起始氨基酸分别为
丝氨酸(S)和甲硫氨酸(M)氨基酸序列将 LMW-
GS 分为 LMW-s型和 LMW-m 型 ,其起始氨基酸
分别为丝氨酸(S)和甲硫氨酸(M)。本文所获得
的华山新麦草低分子量谷蛋白亚基 N-末端起始
氨基酸为甲硫氨酸(M),所以本研究获得的华山
新麦草 LMW-GS 属于 LMW-m 型。LMW-m 型
主要有 3 种不同的 N-末端序列 , 即 MET-
SHIPGL-、METSRIPGL-和 METSCIPGL-,而华
山新麦草 LMW-GS 的 N-末端氨基酸序列为
METGRIPSL ,与 METSRIPGL-相比 G 、S 位置
发生了互换。
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·737·第 5 期　　　　　王建伟等:华山新麦草(Psathy rostachys huashanica)LMW-GS 基因的克隆和序列分析