全 文 ：一九九二年六月 《天然产物研究与开发 )V ol . 4 N o. 2
生产培养基中寡糖素对滇紫草
愈伤组织培养的影响
周立刚 郑光植 王世林 甘烦远
(中国科学院昆明植物研究所 昆明 6 50 2 0 4)
摘 要 黑节草寡糖素 C一 7和 C一8 、 人参寡糖素G 一7和G 一8分别加入到培养基中 , 均
能影响滇紫草愈伤组织中色素的合成 。 C 一 7 、 C 一 8 . G 一 7和G 一8加入到培养基中 , 促
进紫草色素合成的最适浓度 分 别 为 1 . s p p m 、 2 . s p p m 、 2 . s p p m 和 2 、 s p p m , 色
素浓度分别为Z I . 3 9m g / g D W 、 2 2 . 6 8 m g / g D W 、 2 9 . 峨6 m g / g D W 和 3 6 . 7 3 m g
/ g D W
, 均明显地高于对照 ( 1 6 . 73 m g / g D W ) . 并对寡糖素的作用机 理 进 行
了讨论 .
关份润 寡塘素 , 滇紫草 , 愈伤组织 , 紫草色素
寡糖素是一类由植物多糖 (主要是结构多糖 ) 降解而 来 , 并具有多种生理功能的寡
糖片断 [ ’ ]。 近年来发现寡糖素能明显地影响多种植物培养细胞中次级代谢物 (如皂贰 、
紫草 色素 、 a 一生育酚等 ) 的合成 〔2 一 “ ]。 滇紫草 ( o n o s m a p a n i c u l a t u m )主产云南 , 其
主婆药用成分为紫草色素 a( 一蔡醒衍生物 ) , 由于不 断采挖 , 产品供不应求 , 采用组织
培养的方法生产 色素 ,具有许多优越性 , 在培养过程中发现 , 其 色素含量往往难于提高 。
作者曾发现从黑节草 ( D e n d r o b i u m c a n d i d u m ) 和人参 ( p a n a x g i n s e n g ) 中提 取 的
混合寡糖素 , 能明显地促进滇紫草愈伤组织 中色素的合成 。 本文首次报导在生产培养基
中 , 单体寡糖素对滇紫草愈伤组织培养及其 色素生产 的结果 。 为进一 步建立滇紫草细胞
培养的两步培养系统提供可靠的依据 。
材料和方法
实验材料 实验材料同前文 工` ” “ oJ
培养方法 用于实验的愈伤组织 , 继代培养 30 天转代一次 , 以 L S培养基 t 7 〕为基 本
培养基 , 培养方法同前文 。 采 用M 一 9培养基 [“ 二为生产 色素的培养基 , 并 添 加 10 “ S M的
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, 愈伤组织培养 40 天后收获 。
愈伤组织产 t 和色素含 t 的侧定 将收获的愈伤组织 , 冰冻干燥 至恒重 , 以每瓶愈
伤组织的干重代表愈伤组织的产量 , 单位为 g / f l a s k 。 将冰冻干燥的愈伤组织打成细粉 ,
含量测定同于M i z u欠 a m i等 工’ ] , 单位为m g / g D w (干重 ) 愈伤组织 , 将紫草素含 量 乘
收 稿 日 期 : 1 9 9 1年 1 0月 6日
DOI : 10. 16333 /j . 1001 -6880. 1992. 02. 007
V o l
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4 N o
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2 3份
以愈伤组织产量即得紫草素产量 , 单位为m g / f l a sk 。 文中所得结果均来自四次重 复 平
均值 。
寡糖素的制备及使用 将已制备的人参和黑节草混合寡糖素 日 ] , 经 B io 一G ” I P 一2柱
层析分离纯 化得一系列寡糖素单体 , 其化学研究将另文发表 。 C 一 7和 C 一8为黑节草 寡 糖
素 , 分别由 7个和 8个单糖组成 。 G 一 7和 G 一 8为人参寡糖素 , 亦分另}j由 7个和 8 个 单 糖 组
成 , 以上四 种寡糖素均为经筛选后具活性的寡糖素 , 各种寡糖素在灭菌前加 入 培 养 基
中 。
结 果
1
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C 一 7对愈伤组织培养的影晌
寡糖素 C 一7对滇紫草愈伤组织培养的影响如图 1所示 。 在所试浓度范围内 , C一对愈
伤组织的生长具有轻微 的抑制作 用 (P > 。 . 05 ) , 而对色素的合成均有不 同程度 的促进
作用 。 浓度为 l . s p p m 时 , 色素含量 为 Z z . 3 9m g / g D W , 明 显 高 于 对 照 ( z 6 . 7 3m s / g
D W )
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图 1 寡糖素 C一 7对滇紫草愈伤组织培养的影响
F 19
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1 E f f e e t : o r o l i g o s a e e h a r i n C 一 7 o n e a l l u s e u l t u r e o r o . p a n i e u l a t u m
2
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C 一 8对愈伤组织培养的影响
结果如图 2 所示 。 C 一 8对生 长 无 明 显影 响 , 浓度为 1 . 5一 2 . s p p m时 , 能明显地 促
进色素的合成 。 2 . s p p m时色素含量为 2 . 68 m g / g D w 明显高于对照 , 此时的色素 产 量
(综合了愈伤组织产量和色素含量两个指标 ) 也最高 , 为 .4 2m g / f l a sk 。 .
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图 2 寡糖素 C一 8对滇紫草愈伤组织培养的影响
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3
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G一 7对愈伤组报培养的影晌
结果如图 3所示 。 C一 7浓度为 2 . SP p m时能明显地抑制愈伤组织的生长 , 愈伤组织 的
产量为 0 . 1 4 9 9 / f l a s k , 明显低于对照 ( 0 . 2 5 7 9 / f l a s k ) 。 但 2 . s p pm浓度的 G 一7同 时 又
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图 3 寡糖素 G 一 7对滇紫草愈伤组织培养的影响
F 19
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3 E f f e e t s o f o l i g o s a e e h a r i n G 一 7 o n e a l l u s
e u l t u r e o f o
。
P a n i e u l a t u m
Vol
.
4 N o
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4 2生
明显地促进色素的合成 , 色素含量为 29 . 46 m g / g D w , 色素产量仍处于 最 高 , 为 4 。 38 2
m g / fl as
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。
G 一7在其它浓度下 , 对色素的合 成均有 促进作用 。
4
.
G 一 8对愈伤组织培养的影晌
结果如图 4 所示 。 G 一 8在所试浓度下对生长的影响均不明显 。 2 . SP p m的 G 一 8明显地
促进色素的合成 , 色素含量为 3 6 . 7 3 m g / g D w , 此时的色素产量 为 6 . 70 3 m g / n as k , 是
对照的 2 . 15 倍 , 其它浓度下 , 对色素合成的影响均不明显 。
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图 4 寡糖素召一 3对滇紫草愈伤组织培养的影响
F 1 9
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4 E f f e e t s o f o l i g o s a e e h a r i n G 一 5 o n e a l l u s
e u l t u r e o f o
。
P a n i e u l a t u m
讨 论
寡糖素是糖生物学 ( lG y co ib ol og y) 研究的重要内容之一 。 而其生理效应 和 机 理
的 研究又是其中最重要的一部分 。 对寡糖素的结构和功能研究发现 , 寡糖素 的 结 构 不
伺 , 其功能亦不相同 , 只有一定结构的寡糖素才具有诱导 因子的活性 , 因此有必要将混
合寡糖素分离纯化成单体寡糖素 , 进行生理效应的实验 。 从我们筛选的四种 寡 糖 素 来
看 , 在生产培养基 中 , 加入一定浓度的寡糖素 , 均能不 同程度地刺激紫草色素的合成 ,
但对生长均影响不大 , 四种寡糖素中 , C 一 7和 C一 8 , G一 7和 G一分别对 色素的合成的影响
较为一致 , 这提示它们可能有相似的作用机理 。 G 一 7 和 G 一 8促进色素合成的最适浓度均
为 2 . SP p m ,且十分明显 。 C 一7和 C一 8促进 色素合成的最适浓度分别 为 1 。 SP p m和 2 . SP p m ,
作用效果不及 G 一 7和G 一 8 。 我们曾研究黑节草多糖 f ’ “ 里加入到培养基申 , 也能促进 色素
的合成 。 以上结果表明 , 从多糖降解的寡糖 (素 ) 也具有同样的促进作用 , 且作用更为
2 4 Vo l
.
4 No
.
2
明显 , 这表明多糖 的功能与其所含的某些活性寡糖片断密切相关 , 从筛选的 活 性 片 断
看 , 其诱导次级代谢产物的活性片断是 7 糖和 8 糖 。 以上研究表明 , 这些分子 量不大的
寡糖素可以诱导植物基因的表达 , 以合成次级代谢产物 , 这说明糖类不仅参与了信息传
递 , 而且也参与了基因诱导的作用 , 是一类新发现的信息分子 。 至于寡糖素 的 作 用 机
理 , 有人认为 艺“ 」寡糖素主 要作为第一信使 , 作用于靶细胞的质膜上的专一受体 , 将信
息传到细胞质膜内侧 , 产生第二信使 , 最终导致细胞生理生化的变化 , 因此 , 认为寡糖素
在信息流的前一半中占有较重要的地位 I ` 」, 其作用机理还有待深入研究 。 滇紫草 的 两
步法培养系统 , 即第一步采用生长培养基以促进细胞的迅速增殖 , 第二步则是采用生产
培养基 , 设法极大地促进紫草 色素的合成 , 本研究采用生产培养基 , 所加入的寡糖素在
适宜的浓度下 , 能明显地促进色素的合成 , 从而验证了寡糖素在生产培养基中如同在生
长培养基 中一样也能促进色素的合成 。 这为将来采用两步培养法工业化生产紫草色素创
造 了条件 。
参考文做
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5 7
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〔了〕 L i n s m a i e r E F a n d S k o o g F . O r g a n i e g r o w t h f a e t o r r e q u i r e m e n t s o f t o b a -
c c o t i s s u e e u l t u r e s
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P h y s i o l p l a n t 1 9 6 5 ; 一s ( l ) : 1 0 0
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〔s 〕 F t j i t a Y e t a l . P r u d u e t i o n o f s h i k o n i n d e r i v a t i v e s b y e e l l s u s p e n s i o n
e u l t u r e o f L i t h o s p e r m u m e r y t h r o r h i z o n
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p l a n t C e l l R e p o r t s l o s l
:
x ( 1 )
:
5 9
卜
〔9〕 M i z u k a m i , e t a l . E f f e e t o f n u t r i t i o n a l f a c t o r s o n s h i k o n i n d e r i v a t i v e
f o r m a t i o n i n L i t h s p
e r m u m e a l l u s e u l t u r e s
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P h y t o e h e m i s t r y 2 9 7 7 ; 1 6 ( s )
:
1 1 8 3
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〔1 。〕 周立刚等 , 多糖对滇紫草培养细胞的影响 , 天然产物研究与开发 , 1 9 91 ; 3 ( 2 ) : 34
〔z , 〕 Y a m a z a k i N , e t a l , H o s t 一 P a t h o g e n i n t e r a e t i o n s , P l a n t P h y s i o l o g 定u m
1 9 5 5 ; 7 3 ( 3 )
:
8 6 4
.
V o l 一 No 。 名 43
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U C LU TR E OF N O O SM P A A NI CU A LU TM
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0 l i g o s a e e h a r i n s C 一 7 a n d C 一 8 W e r e f r o m D e n d r o b i u m e a n d i d u m , a n d
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w e r e a d d e d i n t o P i g m e n t s P r o d u e t i o n m e d i u m a l l a f f e e t e d t h e P u r P l e h e r b
p i g m e n t f o r m a t i o n o f o n o s m a p a n i e u l a t u m e a l l u s
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A n a P P r o P r i a t e e o n e e n -
t r a t i o n o f C 一 7 , C 一 8 , G 一 7 a n d G 一 8 t o s t r m u l a t e p i g m e n t s y n t h e s i s W a s
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.
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.
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