全 文 ：南京大学学报 (自然科学 )
第 35卷　第 2期
1999年 3月 　
JOURNAL OF N AN JING UN IV ERSITY
( NATURAL SCIENCES)
　 Vol. 35, No. 2
Mar. , 1999
油菜素内酯促进滇紫草细胞
产生紫草色素初探
张　华　向阳海　杨永华
(南京大学生物科学与技术系 , 210093,南京 )
摘　要　研究了油菜素内酯 ( BR)对培养的滇紫草细胞产生紫草色素的影响 .结果表明 ,在滇紫
草细胞悬浮培养体系中加入最适浓度的 BR( 10-5μg /m L)可以显著促进紫草色素的形成 (增长
73. 4% ) ,并且在低浓度下 BR可以轻微促进细胞生长 ,但 BR并不能代替其它植物生长调节剂 ,
如 IAA、 NAA和 BAP.实验中 BR对植物次生代谢途径中的关键酶之一苯丙氨酸裂解酶 ( PAL )
的活性表现出显著的影响 .
关键词　油菜素内酯 ,滇紫草 ,紫草色素 ,苯丙氨酸裂解酶 ,细胞培养
分类号　 Q3. 343. 6
0　前　言
油菜素内酯 ( Brassinolide, BR)指一组具有很高生物活性的固醇类物质 ,发现于 1970
年 [1 ] ,其结构与动物固醇类激素结构类似 [2 ] , 1979年 Thompson完成了人工合成 [3 ] .研究表
明 , BR的立体结构对其表现高生物活性非常重要 [4 ] .迄今为止研究者已从许多不同植物的
不同器官分离到了 BR或其类似物 ,表明 BR在植物界可能分布广泛 .
BR最显著的作用是它在植物生长方面的作用 ,实验表明以纳摩尔浓度 BR处理植株时
既可以促进其细胞伸长又可以促进细胞分裂 .与生长素类似 , BR促进伸长作用伴随着对细
胞内 H+ 外渗的促进 [ 5] ,但表现出一个较长的迟滞期 [6 ] .以 BR处理植物可促进 BRU1基因的
表达 ,而生长素无此作用 [7 ] , BRU1基因与细胞壁松驰酶基因有同源性 . BR独特的化学结
构、低浓度下极高的生物学活性和在植物界的广泛分布使研究者认为它是一种新的植物激
素 .
目前 ,尽管有大量关于 BR对植物生长调节作用的实验工作 ,但都局限于整株植物或植
物切段 .关于 BR对植物培养细胞作用的研究甚少 ,特别是 BR对植物培养细胞产生次生代
收稿日期: 1998- 08- 31第一作者简介:张华 ,男 , 1971年 2月生 ,助理工程师 ,从事植物细胞组织培养研究 ,已发表“滇紫草细胞发酵培养形成紫草色素”等文章
谢产物的影响国内外均未见报导 ,本文拟就此做一些研究 .实验供试材料为培养的滇紫草
( Onosma panicula tum Bur. et Franch)愈伤组织 ,该愈伤组织培养在 M9培养基时可积累紫
草色素 ,一种红色萘醌类化合物 [8 ] .
1　材料与方法
1. 1　材料　所用愈伤组织诱导自滇紫草幼嫩根茎 ,以小团块选种法筛选得到紫草色素高产
细胞系 O P2.该细胞系以 B5琼脂培养基 25℃光照培养 ( 8h /d) ,每 18d继代一次 .将 2. 5gfw愈
伤组织接种于含 50mL M9培养基的 250mL三角烧瓶中 ,于摇床 ( 120r /min)上暗培养以形成
紫草色素 , 20d后收获 .
1. 2　试剂　 BR(由华中农业大学骆炳山教授惠赠 )先溶解于纯酒精中 ,后用水定容使最终
浓度为 30μg /mL.贮备液中少量的酒精对细胞无影响 .
1. 3　细胞生长量及含水量的测定　将培养物于 60℃烘干称取细胞干重 .
　　细胞鲜重增加倍数= (收获时鲜重-接种鲜重 ) /接种鲜重 .
　　含水量= ( 1-收获时干重 /收获时鲜重 )× 100% .
1. 4　色素含量　测定方法按宁文等的报道 [9 ] .
1. 5　 PAL活性的测定　称取 0. 5g fw 在 M9培养基上生长的细胞 ,加入 1. 5mL含有
10mmol / L二硫苏糖醇和 100mg聚乙烯吡咯啉酮 ( PV PP)的 0. 1mmo l /L磷酸钾缓冲液
( p H6. 5)于冰浴研磨 , 4℃下 10000g离心 10min, PAL存在于上清液 . PAL活性的测定采用
Kazufumi Yazaki等的方法 [10 ] ,反应终产物为肉桂酸 , PAL活性以μg肉桂酸 /g fw表示 .
1. 6　实验设计　本文所有实验均重复 3次 ,每次取 3个样本 .
图 1　在无 IAA、NAA和 BAP的 B5培养基中加入
BR对细胞生长的影响 C: 对照 (B5培养基 )
Fig. 1　 Ef fect of dif ferent BR dosages on fresh
weight increase of O. paniculatum cell cultured on
B5 medium without IAA, NAA and BAP
图 2　在 B5培养基中加入 BR对细胞生长的影响 C:
对照 (B5培养基 )
Fig. 2　 Ef fect of diff erent BR dosages on fresh
weight increase of O. paniculatum cell cultured on
B5 medium
2　实验结果
2. 1　 BR对细胞生长的影响　在仅含 BR而不含其它生长调节剂 ( IAA、 NAA和 BAP)的
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B5培养基上生长的愈伤组织在培养期间逐渐变成褐色 , BR浓度越高 ,细胞颜色越深 ,并且细
胞生长缓慢 .细胞鲜重增加情况如图 1所示 .当在正常 B5培养基中加入 BR时 ,细胞仅在高浓
度 ( 1μg /mL、 0. 1μg /mL和 0. 01μg /mL)时变成褐色 ,其它浓度时生长正常 ,并且在较低浓度
( 10- 4μg /mL和 10- 5μg /mL)时 ,细胞生长较对照稍快 (图 2) .
图 3　不同浓度的 BR对紫草色素形成的影响
C:对照 (M9培养基 )
Fig. 3　 Ef fect of diff erent BR dosages
on sh ikonin formation
2. 2　 BR对紫草色素合成的影响　不同剂量的
BR对紫草色素形成的影响不同 (图 3) ,低于
10
-2μg /mL时 ,紫草色素的产量高于对照 ( M9培
养基 ) ,最适浓度为 10-5μg /mL.最适浓度下紫草
色素形成的动态曲线如图 4( BR于培养的第 4d
时加入 ) ,可见在培养的第 8d,处理组的色素产
量已高于对照 ( M9培养基 ) ,最终处理组的色素
产 量 达到 106. 5mg /gdw , 细 胞 含水 量 为
89. 02% ,对照组的最终色素产量为 61. 43mg /
gdw ,细胞含水量为 89. 75% ,色素产量提高了
73. 4% .图 4中第 24d色素产量稍高于第 20d是
由于细胞生长停止 ,逐渐衰老 ,含水量减少所
致 .
2. 3　 BR对 PAL活性的影响　 BR于培养第
4d时加入 . BR处理 1h后 PAL活性明显提高
图 4　最适 BR浓度下紫草色素合成的动态曲线
Fig. 4　 Shikonin formation at the optimum BR
concentration ( 10-5μg /mL)
(图 5) , 3h后活性达到最高 ,之后开始
下降 .整个培养阶段 ,处理组的 PAL
活性均高于对照 ( M9培养基 ) .
3　讨论
BR最广为人知的作用是对植物
生长的促进作用 ,但以前的实验均是
以整株植物或植物切段为材料 .在培
养细胞中 , BR单独使用时并不表现
该作用 ,尤其是在高浓度下 .本实验
中 , BR在高于 10-4μg /mL时对细胞生
长产生抑制作用 ,而在烟草培养细胞
中 BR则在一个更宽的浓度范围对细
胞生长产生抑制 [11 ] .尽管 BR可在低
浓度下对培养细胞的生长有轻微的促进作用 ,但前提是必须有 IAA、 NAA和 BAP等其它
生长调节剂存在 (图 1和图 2) .这可能与 BR作用的组织特异性有关 .愈伤组织为脱分化的组
织 ,自身往往不能合成所需的生长调节物质 (如 IAA等 ) ,需由外界提供 .由图 1和图 2可见 ,
BR与其它生长调节物质之间存在相互作用 ,因此单独使用 BR处理愈伤组织并不能促进生
长 .
·153·第 2期　　　　　　　　张　华等:油菜素内酯促进滇紫草细胞产生紫草色素初探　　　　
图 5　 BR对 PAL活性的影响
Fig. 5　 Ef fect of BR on PAL
BR对培养细胞产生次生代谢物
的影响国内外至今未有报导 .我们发
现 BR可以在低于 10-2μg /mL的浓度
下促进紫草色素的形成 ,这可能与
BR对 IA A的作用有关 .大量研究表
明经 BR处理的细胞中 IAA活性有
所提高 [12 ] ,研究者提出两种假设解释
该现象: ( 1) BR通过提高组织中 IAA
受体的活性而提高组织对 IAA的敏
感性 ; ( 2) BR促进 IAA在体内的合
成、运输和解束缚状态 ,第二种假设已
被许多实验所否定 [13 ] . IAA可以降低
细胞内 Ca2+ 的水平 [ 14] ,细胞内低
Ca
2+浓度有利于紫草色素的合成 [ 15] .从图 5可见 , BR对 PAL活性有显著的促进作用 ,处理
后 3h,处理组的 PAL活性上升 ,对照组 PAL活性没有明显变化 .尽管 PAL活性并不与紫草
色素合成直接相关 ,但它是紫草色素合成途径的第一个酶 [16 ] ,其活性的提高可为其后的合
成步骤提供更多的前体 . PAL活性在培养的 0d～ 4d的升高可能是由于细胞从 B5培养基转
到 M9培养基所致 , M9培养基适于紫草色素的形成 .
参　考　文　献
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A PRELIMINARY STUDY ON ENHANCING SHIKONIN
FORMATION BY BRASSINOLIDE ADDITION IN
CULTURED ONOSMA PANICULATUM CELLS
Zhang Hua　X iang Yanghai　Yang Yonghua
( Depar tment of Biolog ical Science & Technolog y, Nanjing Univ er sity , 210093, Nanjing , PRC)
Abstract　 Th e effect o f brassinolide ( BR) on shikonin formation in Onosma paniculatum cell suspension
cultur e sy stem was studied. We find tha t added to the culture system, BR can stimulate th e shikonin
deriv ativ es formation markedly ( 73. 4% increase) , the optimum dosage is 10-5μg /m L. BR a lso can sligh tly
stimulate cell g row th a t low concent ration, but BR can t substitute o ther g row th regulato rs such as IAA,
N AA and BAP. BR show s significant effec t on Pheny lalanine ammonia-lyase ( PAL ) , the key enzyme
which connects plant primary metabo lism and seconda ry m etabo lism, in our experim ent.
Keywords　 brassino lide , Ono sma panicula tum, shikonin, pheny lalanine ammonia-lyase, cell culture
·155·第 2期　　　　　　　　张　华等:油菜素内酯促进滇紫草细胞产生紫草色素初探