全 文 ：刘 延，刘华招，高增贵． 野慈姑对吡嘧磺隆抗性的分子机理［J］． 杂草科学，2015，33(3):20 － 23．
野慈姑对吡嘧磺隆抗性的分子机理
刘 延1，刘华招2，高增贵3
(1．黑龙江省农垦科学院植物保护研究所，黑龙江哈尔滨 150038;2．黑龙江省农垦科学院水稻研究所，黑龙江哈尔滨 150038;
3．沈阳农业大学植物免疫研究所，辽宁沈阳 110866)
摘要:野慈姑是我国稻田危害最严重的杂草之一。以黑龙江稻田采集的野慈姑(Sagittaria trifolia Linn．)为研
究对象，通过室内生物测定和分子克隆技术，对野慈姑的吡嘧磺隆抗性水平进行检测，并从靶标位点突变的角度
解释抗性产生原因。结果表明，采自哈尔滨稻田的 2 个野慈姑种群 N03 及 N06 均为高抗种群，抗性达到 4 倍剂量
以上。经比对 2 个抗性种群的靶标酶 ALS基因发现，Pro197 的脯氨酸分别被亮氨酸、丝氨酸取代，该位点的突变
可能是野慈姑种群对磺酰脲类除草剂产生抗药性的主要原因。
关键词:野慈姑;除草剂抗性;ALS基因;吡嘧磺隆
中图分类号:S451． 21 文献标志码:A 文章编号:1003 － 935X(2015)03 － 0020 － 04
Molecular Ｒesistance Mechanism of Sagittaria trifolia L．
to Pyrazosulfuron － methyl
LIU Yan1，LIU Hua-zhao2，GAO Zeng-gui3
(1． Plant Protection Ｒesearch Institute，Heilongiiang Academy of Land Ｒeclamation Sciences，Harbin 150038，China;
2． Ｒice Ｒesearch Institute，Heilongiiang Academy of Land Ｒeclamation Sciences，Harbin 150038，China;
3． Institute of Plant Immunity，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China)
Abstract:Sagittaria trifolia L． is one of the most serious weeds in paddy fields in China． In this study，two S． trifolia
populations collected from Heilongjiang Province were found highly resistant (resistance indexes above 4． 0)to pyrazosul-
furon － methyl in dose － response curves． The resistance mechanism was elucidated through amplifycation and cloning
sections of the ALS gene． Different mutations were found in Pro197 in the two resistant populations． In one of the popula-
tions (N03)，CCC was changed to CTC /CCC at 197，leading to the substitution of Pro by Leu /Pro． Population N06 pos-
sessed a TCC to CCC mutation，resulting in a Ser － 197 － Pro substitution． These mutations may be responsible for the re-
sistance mechanism．
Key words:Sagittaria trifolia L．;herbicide resistance;ALS gene;pyrazosulfuron － methyl
收稿日期:2015 － 03 － 20
基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项(编号:201203098);黑
龙江省农垦科学院 2011 年院长基金。
作者简介:刘 延(1978—)，女，博士，副研究员，主要研究方向为杂
草抗药性与农田杂草防控。E － mail:liuyanzb1226@ 163． com。
水稻是黑龙江省的主要粮食作物。2014 年黑
龙江省水稻种植面积突破 340 万 hm2，除北部高寒
地区外，全省 80 个市(县)中 72 个市(县)种植水
稻［1］。杂草是影响水稻产量的主要因素之一［2］，随
着除草剂的大量使用，稻田杂草的种群变化和群落
演替加速，原来处于次要防治地位的莎草科及泽泻
科杂草成为主要杂草。野慈姑(Sagittaria trifolia
L．)别称狭叶慈姑、长瓣慈姑，俗称驴耳菜，为泽泻
科多年沼生草本植物。野慈姑喜温暖湿润环境，生
长适宜温度为 20 ～ 25 ℃，既能种子繁殖也可宿生根
繁殖［3 － 4］。通过田间调查和与农民交流获知，野慈
姑近年来发生日益严重，己成为黑龙江省寒地稻区
主要恶性杂草。
磺酰脲类除草剂苄嘧磺隆和吡嘧磺隆，自 20 世
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纪 80 年代末在我国登记以来，由于其具有活性高、
用量低、杀草谱广、对作物安全及毒性低等特点，一
直是水田防除阔叶杂草的主推品种［5］。我国东北
地区水稻田使用磺酰脲类除草剂已有 20 多年历
史［6］。长期单一品种的除草剂施用极易诱导杂草
产生抗药性，造成野慈姑对磺酰脲类除草剂敏感性
降低。日本于 2014 年报道了由于 ALS 基因突变而
对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆高抗的野慈姑种群［7］。国
内也有相关报道:吴明根等在吉林省延边已发现抗
磺酰脲类除草剂苄嘧磺隆生态型慈姑［8］;陈丽丽等
在黑龙江省庆安县发现 ED50比值 4． 5 倍于敏感型
的野慈姑［9］。笔者在试验区中也发现对苄嘧磺隆、
吡嘧磺隆不敏感的野慈姑生态型。
世界范围内已有大量与 ALS抑制剂抗性相关的
报道。对于抗性机制的解释主要有 2 个方面———靶
标位点抗性(target － site － resistance，TSＲ)和非靶标
位点抗性(non － target － site － resistance，NTSＲ)。目
前已发现的 151 种 ALS 抑制剂抗药性杂草中，经证
实与 TSＲ 直接相关的 ALS 基因突变位点共有 8
个［10 － 11］。根据拟南芥中 ALS氨基酸的位置，8 个位
点分别为 Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、
Trp574、Ser653、Gly654。对于 NTSＲ 的研究主要集
中在解毒和代谢 2 个方面［12］。
目前野慈姑抗性机制的解释主要为编码靶标酶
ALS基因发生突变。本研究以吡嘧磺隆为例，主要
目的为探明黑龙江省野慈姑对磺酰脲类除草剂产生
抗性的靶标位点的抗性机制。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
采自黑龙江省哈尔滨市不同田块的野慈姑种群
(Sagittaria trifolia L．)见表 1。各种群分别取植株幼
嫩部分，冻存于 － 80 ℃。
表 1 慈姑种群采集地点及用药史
Table 1 Collection sites of Sagittaria trifolia L． seeds and their background of herbicide application
采集地点 种群名称 采集地 用药史
哈局闫家岗农场 N01 至 N08 水稻田 苄嘧磺隆、吡嘧磺隆用药 10 年以上
CK 野池塘 无
1． 2 试验方法
1． 2． 1 整株生测法 选取 4 ～ 6 叶期长势均匀的野
慈姑，进行喷雾处理。试验按照表 2 设计用量处理，
每处理重复 4 次。喷药后放在暗处吸收 6 h，然后光
暗交替 12 h继续培养。
1． 2． 2 野慈姑 ALS 基因扩增引物的设计与合成
根据已发表的野慈姑 ALS基因序列(AB301496． 1)，
设计并于生工生物工程(上海)股份有限公司合成
正反向 2 条引物(表 3)。
表 2 吡嘧磺隆试验用量设计
Table 2 Pyrazosulfuron －methyl dosages and codes
used in the experiments
处理编号 药剂
制剂用量
(g /hm2)
有效成分用量
(g a． i． /hm2)
1 /2X 10%吡嘧磺隆可湿性粉剂 22． 5 225
X 45 450
2X 90 900
4X 180 1 800
8X 360 3 600
CK 空白对照
表 3 扩增野慈姑 ALS基因的引物
Table 3 Primer used to amplify ALS in Sagittaria trifolia L．
引物名称 序列(5→3) 扩增片段长度(bp) 包含已确认的突变位点 退火温度(℃)
IF
IＲ
GCTCTGACCTCCCCTATCTTTG
GCTTCCTCCACCTCTCTCTACC 1 320
122，197，205，376
377，574 59． 0
1． 2． 3 野慈姑 ALS 基因片段的克隆及测序 对目
的条带切胶回收、纯化后连接到 pMD18 － T载体，然
后转到大肠杆菌感受态细胞中。将菌液均匀涂布于
含有 Ampicilin 和 X － gal / IPTG 的 LB 固体培养基
上，37 ℃过夜培养。从培养基上挑取 15 个白色单
菌落到含 Ampicilin的 LB培养液中，以 200 r /min的
速度在 37 ℃摇床内振荡培养 5 h，然后以菌液为模
板进行转化鉴定。25 μL 的菌液 PCＲ 组分包括
9． 5 μL ddH2O、12． 5 μL 2 × Pfu PCＲ MasterMix
(TIANGEN公司)、1 μL 菌液、上下游引物各 1 μL
(10 μmol /L)。挑选其中至少 5 个阳性克隆送公司
双向测序，引物为通用引物 M13。
1． 2． 4 生物学信息分析 用 DNAMAN V6 软件对
试验反枝苋种群 ALS 基因片段的测序结果进行比
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对，寻找 6 个突变位点的差异性。
2 结果与分析
2． 1 生物测定结果及分析
施药 7 d后，调查吡嘧磺隆对各野慈姑样本地
上鲜质量的抑制差异。随吡嘧磺隆剂量的升高，对
8 个样本的抑制率增强。其中样本 N03 和 N06 抗性
水平较高，4 倍剂量时的生长抑制率低于 50%，即对
吡嘧磺隆抗性达到 4 倍剂量以上(表 4)。对这 2 个
野慈姑抗性种群和敏感种群进行 ALS基因片段的生
物信息学分析。
表 4 吡嘧磺隆对野慈姑地上干质量的影响
Table 4 Effect of pyrazosulfuron －methyl on aerial
dry weight of Sagittaria trifolia L．
编号
不同剂量吡嘧磺隆对野慈姑地上干质量抑制率(%)
1 /2X X 2X 4X 8X
N01 45． 3 77． 2 81． 6 82． 4 89． 3
N02 37． 9 70． 8 73． 3 82． 2 83． 6
N03 4． 5 16． 3 23． 3 45． 5 85． 9
N04 36． 3 59． 6 56． 4 86． 9 84． 9
N05 31 71． 7 67． 9 76． 1 81． 9
N06 1． 9 11． 7 19． 8 36． 4 68． 8
N07 56 73． 6 73． 8 88． 3 89． 1
N08 65． 2 70． 9 73． 9 82． 3 83． 6
2． 2 野慈姑基因组 DNA的提取及目的片段扩增
3 种野慈姑取幼嫩组织在液氮中研磨成细粉，
使用快捷型植物基因组 DNA 提取系统，对基因组
DNA进行提取，电泳检测提取成功(图 1)。
PCＲ反应条件为 94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性
30 s、59 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 2 min，共进行 33 次
循环;72 ℃延伸 10 min。扩增产物点样于 1%琼脂
糖凝胶中进行电泳检测，扩增成功(图 2)。
2． 3 野慈姑 ALS基因片段的生物信息学分析
对 3 个野慈姑种群的 ALS测序片段进行比对后
发现，抗性种群 N03 和 N06 在 Pro197 位发生了导致
不同氨基酸发生取代的突变。其中，N03由CCC突
变为 CTC，亮氨酸取代了脯氨酸;N06 由 CCC 突变
为 TCC，丝氨酸取代了脯氨酸(表 5)。从测序峰图
(图 3)上来看，N03 种群的单株在编码 Ser的第 2 个
碱基处出现了套峰，N06 种群的单株无套峰出现。
由于野慈姑为二倍体［13］，因此峰图表明，N03 的 197
位点突变仅发生在野慈姑的 1 条染色体上，即 N03
种群野慈姑单株 Pro197Pro /Leu为杂合突变，而 N06
种群野慈姑单株 Pro197Ser为纯合突变。
表 5 3 个野慈姑种群 ALS基因片段及编码氨基酸的比较
Table 5 DNA and derived amino acid sequences of ALS
gene from three populations of Sagittaria trifolia L．
种群名称
氨基酸位置及对应编码的核苷酸序列
122 197 205 376 377 574
CK GCG CCC GCC GAT CGC TGG
Ala Pro Ala Asp Arg Trp
N03 GCG CTC /CCC GCC GAT CGC TGG
Ala Leu Ala Asp Arg Trp
N06 GCG TCC GCC GAT CGC TGG
Ala Ser Ala Asp Arg Trp
3 讨论与结论
本试验通过整株生物测定法，对采自 8 个地块
野慈姑的抗药性水平进行了检测，发现有 2 个地块
的野慈姑对吡嘧磺隆的敏感性降低，抗性达到 4 倍
剂量以上。对靶标酶 ALS 的部分基因片段进行扩
增、克隆、测序后发现，2 个抗性种群———N03、N06
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靶标酶 ALS的高度保守区域 Domain A 发生了基因
突变，197 位由 CCC 分别突变为 CTC /CCC、TCC，分
别导致脯氨酸被亮氨酸、丝氨酸取代。突变的发生
可能是导致野慈姑对磺酰脲类除草剂产生抗性的重
要原因之一。
基于靶标位点突变的 ALS 抑制剂抗性是杂草
产生抗性的重要机制，通常是由于 ALS 的编码基因
保守区域发生突变，导致单个氨基酸被取代［14 － 15］，
这种取代也可在多个位点同时发生。在过去 20 年
里，全球范围内在 50 个杂草种群中，共发现 8 个能
够导致抗性产生的突变位点以及 26 种氨基酸替代
方式［16］。目前野慈姑的靶标位点抗性情况已有报
道，2014 年日本 Iwakami等发现了发生 CCC /TCC杂
合突变的野慈姑种群，本研究发现的 2 种突变方式
尚未报道。
非靶标位点导致的除草剂抗性原理较复杂，可
能由除草剂代谢机制的增强或解毒酶(P450 解毒
酶，GSTs等)活性提高引起［12，17］。本次试验未对非
靶标方面机理进行研究，因此不能排除其对抗性产
生的贡献，这有待进一步证实。
参考文献:
［1］关 昕，安龙哲． 黑龙江省水稻生产概况［J］． 农机使用与维修，
2013(1):10 － 12．
［2］Florez J A，Fischer A J，Ｒamirez H，et al． Predicting rice yield losses
caused by multispecies weed competition［J］． Agronomy Journal，
1999，91(1) :87 － 92．
［3］王枝荣． 中国农田杂草原色图谱［M］． 北京:农业出版社，
1990:357．
［4］余柳青，韩逢春，玄松南，等． 东北水稻生产与杂草防除［J］． 杂
草科学，2009(4):7 － 10．
［5］李 茹，罗小娟，董立尧，等． 鳢肠种群对除草剂的敏感性［J］．
江苏农业学报，2013，29(6):1514 － 1516．
［6］吴明根，郑承志，李昕珈． 抗苄嘧磺隆慈姑 ALS 基因突变位点
［J］． 江苏农业学报，2010，26(1):222 － 224．
［7］Iwakami S，Watanabe H，Miura T，et al． Occurrence of sulfonylurea
resistance in Sagittaria trifolia，a basal monocot species，based on
target － site and non － target － site resistance［J］． Weed Biology and
Management，2014，14(1) :43 － 49．
［8］吴明根，吴松权，朴仁哲，等． 磺酰脲类除草剂对抗、感性慈姑
ALS活性的影响［J］． 农药，2007，46(10):701 － 703．
［9］陈丽丽，何付丽，范丹丹，等． 黑龙江省野慈姑对吡嘧磺隆的敏感
性测定［J］． 植物保护，2013，39(6):120 － 123．
［10］Beckie H J，Tardif F J． Herbicide cross resistance in weeds［J］．
Crop Protection，2012，35:15 － 28．
［11］Powles S B，Yu Q． Evolution in action:plants resistant to herbicides
［J］． Annual Ｒeview of Plant Biology，2010，61:317 － 347．
［12］Yu Q，Powles S． Metabolism － based herbicide resistance and
cross － resistance in crop weeds:A threat to herbicide sustainability
and global crop production［J］． Plant physiology，2014，166(3) :
1106 － 1118．
［13］李林初． 泽泻和慈姑核型的比较研究［J］． 植物科学学报，
1985，3(4):397 － 402．
［14］Ｒajguru S N，Burgos N Ｒ，Shivrain V K，et al． Mutations in the red
rice ALS gene associated with resistance to imazethapyr［J］． Weed
science，2005，53(5) :567 － 577．
［15］Shaner D L． Ｒesistance to acetolactate synthase (ALS)inhibitors in
the United States:history，occurrence，detection，and management
［J］． Weed Ｒesearch，1999，44(4) :405 － 411．
［16］Yu Q，Powles S B． Ｒesistance to AHAS inhibitor herbicides:current
understanding［J］． Pest Management Science，2014，70 (9) :
1340 － 1350．
［17］Vila － Aiub M M，Neve P，Powles S B． Ｒesistance cost of a cyto-
chrome P450 herbicide metabolism mechanism but not an ACCase
target site mutation in a multiple resistant Lolium rigidum population
［J］． New Phytologist，2005，167(3) :787 － 796．
—32—杂草科学 2015 年第 33 卷第 3 期