全 文 ：3株蒲公英内生真菌的分离鉴定及抗禽类致病菌活性的初步研究
李伟南 , 张慧茹＊　(河南工业大学生物工程学院 , 河南郑州 450001)
摘要　[目的]从蒲公英中筛选对禽类致病菌有较强抑制作用的植物内生真菌。[方法]采用形态学方法对分离菌株进行鉴定 ,以鸡致病
性大肠杆菌、沙门氏菌为指示菌对分离得到内生真菌株发酵产物进行抑菌试验。[结果]从药用植物蒲公英的根和叶中分离得到 3株内
生真菌 ,分别记为PG1、PG2和 PG4。初步鉴定 PG1属于镰孢霉属 , PG2和 PG4属于卵形孢霉属。它们的发酵产物对鸡致病性大肠杆菌
均有较强的抑制效果 ,但对沙门氏菌无抑制作用。其中 ,PG1的发酵液与PG2菌丝体丙酮提取液抑菌效果与 2种常用禽用抗生素抑菌效
果相当。[结论]蒲公英内生真菌在禽类细菌性疾病的防治中具有一定的研究价值。
关键词　蒲公英;内生真菌;发酵产物;禽类致病菌
中图分类号　S 859.79+7　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)22-09540-03
Primary Studies on Isolation and Detection of Three Strains Endophytic Fungi from Dandelion(Taraxacum mongolicum Hand-Mazz)and Its
Antimicrobial Activity of Poultry Pathgenic
LI Wei-nan et al　(Institute of bioengineering, Henan University of Industry , Zhengzhou , Henan 450051)
Abstract 　[Objective] The research aimed to select endophytic fungi from dandelion(Taraxacum mongolicum Hand-Mazz)which had obvious inhibition
to the pathogens in poultry.[Method] E.coli , Salmonella from chickenwere selected as the indicator to test the inhibitory activity of the isolated strains.
Antimicrobial tests of the fermentation products of the isolated endophytic fungi were carried out.[ Result] Three strains endophytic fungi were isolated
from the roots and leaves of medicinal plant Taraxacum mongolicum Hand-Mazz(PG1 , PG2 and PG4), and PG1 was identified as Oospora sp.and PG2
and PG4 were identified as Fusarium sp.Respectively.All of these fermentation products had inhibitory activity against chicken pathogenic E.coil , but
not against chicken pathogenic Salmonella.The antibacterial effects of PG1 and PG2 fermentation products were comparative to two kinds of common an-
tibiotics.[ Conclusion] Taraxacum mongolicum Hand-Mazz endophytic fungi could be useful for the prevention and treatment of bacterial disease in
poultry.
Key words　Dandelion(Taraxacum mongolicum Hand-Mazz);Endophytic fungi;Fermentation products;Chicken pathogenic microbial
作者简介　李伟南(1982-),男 ,辽宁沈阳人 ,硕士研究生, 研究方向:
中草药内生真菌抑菌成分。 ＊通讯作者 , 博士 , 硕士生导
师。
鸣　　谢　感谢西北农林科技大学来航线教授 、张恩平副教授 、刘林
丽研究员在试验早期工作的帮助和支持;感谢河南工业大
学微生物教研室曾实老师在菌种鉴定工作的帮助。
收稿日期　2008-05-27
　　蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand-Mazz),别名蒲公草 、
黄花地丁 、黄花三七 、婆婆丁等 ,为菊科多年生草本植物。近
几年来的研究发现 ,蒲公英同时具备“三抗作用” ,即抗病毒 、
抗感染 、抗肿瘤作用[ 1] 。蒲公英不仅是人类常用的中药材 ,
而且也在畜牧兽医上得到广泛应用。
植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部
阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌 ,被感染
的宿主植物(至少暂时)不表现出外在病症[ 2] 。植物内生菌
与宿主植物长期互惠共生 ,协同进化 ,研究表明植物中的内
生真菌能产生与宿主植物相同或相似的生理活性成分[ 3] 。
目前 ,有关蒲公英内生真菌抗禽类致病菌的研究尚未见
文献报道。为此 ,笔者根据蒲公英与植物内生真菌共生的特
点 ,对从蒲公英中分离出的 3株内生真菌及发酵产物抑制禽
类致病菌能力进行了初步研究 ,旨在筛选出能产生较强抑菌
活性物质的内生真菌 ,为发酵生产蒲公英内生真菌中抗禽类
致病菌的活性物质及蒲公英的有效利用奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物材料。蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand-Mazz)
新鲜植株 ,采于新郑歹庄农场 。
1.1.2　指示菌。鸡致病性大肠杆菌(Chicken pathogenic Esh-
erichia coli)、鸡致病性沙门氏菌(Chicken pathogenic Salmonella
lignieres)均由河南工业大学动物生理解剖实验室自病鸡中分
离 ,通过微生物形态和生理生化反应初步鉴定。
1.1.3　培养基。分离培养基:选用马铃薯葡萄糖琼脂培养
基 , 1 000 ml培养基中加入 1%医用链霉素 0.3 ml ,以抑制细
菌生长。鉴定培养基为察贝克氏培养基;指示菌培养基为牛
肉膏蛋白胨琼脂培养基;发酵培养基为马铃薯葡萄糖液体培
养基;特殊用途培养基为蒲公英浸汁培养基 ,将马铃薯培养
基中的马铃薯浸汁换成相应的蒲公英浸汁 ,蒲公英汁制作方
法参考戴传超的方法[ 4] 。
1.2　方法
1.2.1　蒲公英内生真菌的分离 。将刚采集的新鲜蒲公英在
自来水下冲洗 ,按根 、叶粗剪 。表面消毒处理:无菌操作下 ,
将根剪成 0.5cm×0.2cm小片 ,无水乙醇漂洗 1min , 6%次氯
酸钠漂洗 3min , 75%无水乙醇洗 30 s ,无菌水冲洗 3次 ,用无
菌镊子撕去表皮 ,将其斜插于分离培养基平板上 ,每板 3块 。
将叶片粗剪成 4～ 5 cm小块 , 75%乙醇浸泡 5min , 0.1%升汞
溶液漂洗 15min ,无菌水冲洗 5次 ,无菌刀将其切成 3～ 4 mm
小块平铺于分离培养基平板上 ,每板 4块 ,将以上平板 30 ℃
培养 3～ 7 d 。当样品边缘有真菌菌丝长出时 ,挑取菌丝 ,经
纯化后转接于马铃薯斜面培养基培养备用。
1.2.2　表面消毒效果检测。将表面消毒过的上述对照材料
不作任何剪切 ,直接种植于马铃薯培养基平板上 ,置于相同
条件下培养 ,多次重复 ,检查是否有菌丝长出。
1.2.3　内生真菌的形态学鉴定 。挑取纯化后的真菌菌丝 ,
转接于察贝克氏培养基上 ,点接法观察菌落特征 ,插片法进
行显微镜观察 。按《真菌鉴定手册》[ 5]鉴定菌株到属 。
1.2.4　通过平板抑菌试验选择培养基。抑菌试验选择菌块
法 ,见参考文献[6] 。
1.2.5　内生真菌摇床发酵与产物提取。待接种于特殊培养
基的内生真菌生长旺盛后 ,用 0.4 cm直径的打孔器打孔挑取
5个菌块 ,接种于发酵培养基中 ,静置 24 h ,置于转速 160
r/min ,培养温度为 28 ℃的恒温摇床上培养 7 d。将所得发酵
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2008 ,36(22):9540-9542　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　姜丽　责任校对　傅真治
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2008.22.130
产物用纱布过滤 ,分成菌丝体和发酵液。菌丝体烘干 ,称取
0.1 g研碎 ,每次用 10 ml丙酮提取 ,提取 2次 ,每次 10 min ,合
并提取液 ,留存备用。发酵液经 3次离心(3 000 r/min),弃去
沉淀 ,取上清液 ,备用。
1.2.6　抑菌能力的测定。采用平板挖洞法 ,在牛肉膏蛋白
胨培养基上均匀涂布指示菌液 ,然后在培养基上打出 3个直
径为 0.4cm的小洞 ,每个小洞滴加 15 μl发酵液及菌丝体提
取液 ,然后平板在 37 ℃下培养 24 h ,准确测量抑菌圈的直径
并记录。设置硫酸链霉素 、青霉素为阳性对照;丙酮为阴性
对照。
2　结果与分析
2.1　表面消毒效果检测结果　对照材料周围无任何菌长
出 ,证明表面消毒彻底。从而保证了所分离出的是内生真菌
而非植株表面附生菌或其他杂菌 。
2.2　内生真菌的分离结果及形态学特征　从蒲公英中分离
出 3株内生真菌 ,形态描述见表 1 ,经鉴定分别属于 2个属
(表 2)。
表1　3株内生真菌的菌落特征及细胞形态
Table 1　The colony characteristics and cell morphology of 3 strains of en-
dophytic fungi
器官
Organs
菌号
No.of
bacteria
菌落直径∥cm
Colony
diameter
颜色
Color
表面结构
Surface
structure
细胞形态
Cell morphology
根
Roots
PG1 2.6 白色 菌落呈圆形 ,菌丝体呈白色絮状 ,中心有微突起
分生孢子有隔膜 2至多个 , 呈镰刀型 , 分生孢子梗无色 ,分支
叶
Leaves
PG2 1.7 青灰色 菌落近似圆形 ,菌丝体成绒毛状
分生孢子呈球形,分生孢子由菌丝断裂而形成
PG4 2.7 褚褐色 菌落呈圆形 ,菌丝体呈褐色绒毛状
分生孢子呈圆筒形, 分生孢子由菌丝断裂形成,分生孢子梗极短
表2　3株内生真菌鉴定结果
Table 2　The identification results of 3 strains of endophytic fungi
菌号
No.of bacteria
目
Order
科
Family
属
Genus
PG1 丛梗孢目 瘤座孢科 镰孢霉属　
PG2 丛梗孢目 丛梗孢科 卵形孢霉属
PG4 丛梗孢目 丛梗孢科 卵形孢霉属
2.3　添加蒲公英浸汁的培养基对内生真菌抑菌活性的影
响　将3株内生真菌接种在蒲公英浸汁培养基与马铃薯培养
基上 ,比较其产生抑菌活力的差异(表 3)。由表 3可知 ,单纯
的蒲公英汁并没有抑菌效果 ,可以初步认定为蒲公英的 3株
内生真菌对大肠杆菌和沙门氏菌有抑菌作用。添加蒲公英
浸汁的培养基上生长的真菌所产生的抑菌能力高于马铃薯
培养基上生长的真菌 ,说明蒲公英内生真菌的抑菌能力可能
受到宿主植物的某种营养成分刺激而加强。所以为了使内
生真菌表现出更好的抑菌能力 ,将 3株内生真菌接种在蒲公
英浸汁培养基中培养 。
2.4　内生真菌的发酵产物的抑菌能力测定结果　由表 4可
知 ,3株内生真菌的发酵产物对大肠杆菌有较强的抑制作用 ,
而对沙门氏菌没有抑菌效果。
表 3　内生真菌对2种指示菌的抑菌作用
Table 3　Bacteriostasis of the endophytic fungi to 2 kinds of indicator bacte-
ria cm
菌号
No.of bacteria
培养方式
Culture method
大肠杆菌
Escherichia coli
沙门氏菌
Salmonella
PG1 PDA - -
En+PDA 0.55 0.85
En+Ta 0.75 1.40
Ta - -
PG2 PDA - -
En+PDA 0.78 1.20
En+Ta 1.30 1.70
Ta - -
PG4 PDA - -
En+PDA 1.21 1.30
En+Ta 1.60 1.50
Ta - -
　注:PDA为马铃薯葡萄糖琼脂培养基;En+PDA 为内生真菌在马铃薯
培养基上培养;Ta 为蒲公英浸汁;En+Ta 为内生真菌在蒲公英浸
汁培养基上培养。表中数据为抑菌直径平均值 ,其中“ -”表示无
抑菌作用 ,下同。
　Note:PDA , Potato dextrose agar medium;En+PDA , The culture of endophyt-
ic fungi on PDA medium;Ta , Taraxacum dipping juice;En+Ta , The
culture of endophytic fungi on Ta medium.The data in the table are the
mean bacteriostatic diameter and- stands for no inhibition.The same as
follows.
表4　内生真菌发酵产物对2种指示菌的抑菌效果
Table 4　The bacteriostatic effect of endophytic fungi fermentation products
on 2 kinds of indicator bacteria cm
产物
Products
菌号
No.of
bacteria
抑菌圈大小
Size of bacteriostatic circle
大肠杆菌
Escherichia coli
沙门氏菌
Salmonella
发酵液 PG1 2.15 -
Fermentation PG2 1.30 -
liquid PG4 1.93 -
菌丝体丙酮提取液 PG1 1.60 -
Acetone extract PG2 2.50 -
of mycelium PG4 1.52 -
　　对大肠杆菌的抑制效果 ,3株内生真菌的发酵液抑菌活
性低于菌丝体丙酮提取液(图 1)。选择 3株内生真菌中抑菌
注:A为PG1发酵液对大肠杆菌的抑菌圈大小;B为PG2菌丝体丙
酮提取液对大肠杆菌的抑菌圈大小。
Note:A is the bacteriostatic circle of PG1 fermentation liquid to E .coli
and B is the bacteriostatic circle of acetone extract of mycelium PG2
to E.coli.
图 1　蒲公英内生真菌发酵物的抑菌效果
Fig.1　The bacteriostatic effect of the fermentation products of endo-
phytic fungi in Taraxacum
954136卷 22期　　　　　　　　　　　李伟南等　3株蒲公英内生真菌的分离鉴定及抗禽类致病菌活性的初步研究
效果最好的发酵产物与 2种抗生素比较 ,其中对沙门氏菌的
抑菌活性 2种抗生素明显高于内生真菌发酵产物 ,对大肠杆
菌的抑菌活性内生真菌发酵液与硫酸链霉素抑菌活性相当 ,
强于青霉素的抑菌活性 ,菌丝体丙酮提取液活性明显强于 2
种抗生素(表 5)。
表 5　内生真菌发酵产物抑菌活性比较
Table 5　The antibacterial activity comparison of endophytic fungi fermen-
tation products
样品
Samples
抑菌圈大小∥cm
Size of bacteriostatic circle
大肠杆菌
Escherichia coli
沙门氏菌
Salmonella
PG1发酵液 2.15 -
PG1 fermentation liquid
PG2菌丝体丙酮提取液 2.50 -
Acetone extract of PG2 mycelium
硫酸链霉素Streptomycin sulfate 2.05 1.84
青霉素 Penicillin 1.47 1.36
丙酮溶液Acetone solution - -
3　结论与讨论
蒲公英素有“天然抗生素”的美称 ,常作为饲料添加剂使
用。近年来 ,从蒲公英中提取出的有效化学成分有三萜类 、
黄酮类 、香豆精类 、倍半萜内酯类 、植物甾醇类 、色素类 、挥发
油类 、乙酰酯类 、绿原酸等[ 7] 。近年来 ,植物内生菌研究的热
点在于如何从内生菌的代谢产物中得到与宿主相似或者新
的有效的生物活性物质 。蒲公英内生真菌的代谢有效物质
同样可以作为绿色 、环保 、无残留的禽类抗生素的替代产品 。
这样以来蒲公英和其内生真菌就是有待开发的宝贵资源 。
该研究的结果表明 ,蒲公英内生真菌发酵物对从禽类分
离出的 2种致病菌中的大肠杆菌有较强的抑菌能力 ,同其他
常用抗生素比较效果相同 ,甚至强于抗生素 。但不足之处在
于 , 2种发酵产物对沙门氏菌均没有抑菌效果 ,可能的原因是
打洞法准确率不高 ,对菌丝体的处理应选取几种不同极性的
溶剂提取 ,同时 ,内生真菌传代次数过多导致抑菌能力降低
所致等。蒲公英内生真菌在禽类细菌性疾病的防治中的应
用前景十分广阔 ,在今后的试验中应该进一步对内生真菌的
有效抑菌成分进行细致的研究。
参考文献
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(上接第 9402页)
　　从各处理愈伤组织的诱导率来看 ,在愈伤组织诱导率
较高的 5个培养基中 ,以 11号培养基的诱导效果最好 ,不
仅形成的愈伤组织量多 ,且诱导率高达 90%;其次是处理
14号培养基 ,诱导率达到 70%;其余各培养基的诱导率依
次为处理 9>处理 19 >处理 5 。这说明培养基 MS +6-BA
1.0 mg/L+2 ,4-D 0.8mg/L +IAA 0.2mg/L最利于重瓣铁线
莲茎段愈伤组织的诱导 。
2.2　植物激素适宜诱导茎段愈伤组织的比例　在植物的
组织培养中 ,细胞分裂素与生长素的比例影响着外植体的
器官分化及愈伤组织的形成 ,比例过高 ,促进长芽 ,过低则
促进生根 ,只有比例适中时才能诱导愈伤组织的形成 。在
该试验所使用的植物激素中 ,细胞分裂素 6-BA和 2 , 4-D能
促进细胞分裂 ,诱导愈伤组织的形成 ,生长素 IAA能促进生
根 , 由试验结果可知 ,在重瓣铁线莲的茎段培养中 ,6-BA∶2 ,
4-D∶IAA的适中比例为 5∶4∶1。
3　结论与讨论
(1)适宜重瓣铁线莲茎段愈伤组织诱导的最佳培养基
为MS+6-BA 1.0mg/L+2 ,4-D 0.8mg/L+IAA 0.2mg/L。各
培养基诱导出的愈伤组织均为致密型愈伤组织。而致密型
的愈伤组织内部由管状细胞组成维管组织 ,细胞间有果胶
质紧密地粘连 ,细胞为高度液泡化的细胞 ,很少进行分裂分
化 ,故需要加入高浓度的植物激素使其转变为松脆型的愈
伤组织 ,才有利于进一步分化诱导形成完整的植株 。这说
明该试验所设计的激素组合配方中激素浓度偏低 ,故在增
殖培养中需进一步提高植物激素的浓度。
(2)当植物激素 6-BA 、2 ,4-D和 IAA配合使用时 ,其诱导
重瓣铁线莲茎段愈伤组织的适宜比例为 6-BA∶2 , 4-D∶IAA=
5∶4∶1。
参考文献
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[ 2] 刘庆昌 ,吴国良.植物细胞组织培养[M] .北京:中国农业大学出版社 ,
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