全 文 ：基金项目:国家自然科学基金项目(21272215);国家级大学生创新创业训练计划项目(201310345015)
作者简介:余文华 女，在读本科。主要从事应用微生物学研究。E-mail:1006411937@ qq． com
* 通讯作者。男，副教授，博士。研究方向为应用微生物学。Tel:0579-82286419，E-mail:ylzhang@ zjnu． cn
收稿日期:2014-04-23;修回日期:2014-06-15
濒危植物七子花内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选
余文华，陈婷婷，邹园园，朱蔓莉，王丽君，张应烙*
(浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004)
摘 要 首先从濒危植物七子花中分离到 38 株内生真菌，综合运用形态特征和分子生物学技术，明确其分类
地位。38 株植物内生真菌分属于 6 个属和 1 个无孢子群，其中交链孢属和刺盘孢属为优势菌群，葡萄座腔菌
属、镰刀菌属、赤霉菌属、拟茎点霉属和无孢子群为常见属。以大肠埃希菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌为靶
标菌对获得菌株发酵液粗提物进行抑菌试验，发现 95%以上的菌株对试测细菌具有一定的抗菌活性，表明七
子花内生真菌的抗菌活性十分普遍;其中 QZHⅡ10 对大肠埃希菌具有较好的抑菌活性，抑菌圈直径为 12． 0
mm;而 QZHⅡ07 则对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较强，抑菌圈达到 15． 5 mm。这表明七子花内生真菌具有开
发为微生物源杀菌剂的价值。
关键词 七子花;内生真菌;分离;分类鉴定;抗菌活性
中图分类号 Q93 文献标识码 A 文章编号 1005 － 7021(2015)02 － 0037 － 05
doi:10． 3969 / j． issn． 1005 － 7021． 2015． 02． 007
Separation，Identification ＆ Antimicrobial Activity of Endophytic
Fungi Isolated from Endangered Plant of Heptacodium miconioides
YU Wen-hua，CHEN Ting-ting，ZOU Yuan-yuan，ZHU Man-li，WANG Li-jun，ZHANG Ying-lao
(Coll． of Chem． ＆ Life Sci．，Zhejiang Normal Uni．，Jinhua 321004)
Abstract 38 endophytic fungal strains were isolated for the first time from an endangered plant species Heptacodium
miconioides and confirmed their taxonomical position through their morphological features and molecular biological
technology． They belonged to 6 genus and 1 asporous group． Among them Alternaria and Colletotrichum were the dom-
inant group and Botryosphaeria，Fusarium，Gibberella，Phomopsis and asporour group were common groups． The anti-
microbial test showed that over 95% endophytic fungi presented antimicrobial activity against target strains of E． coli，
Canidia albicans and Staphylococcus aureus，indicating that antimicrobial activity was very common in the endophytic
fungi of H． miconioides． Among them，QZHⅡ10 had the fine antimicrobial activity against E． coli with the inhibition
zone of 12． 0 mm;while QZHⅡ07 had good antimicrobial activity against S． aureus with the inhibition zone of 15． 5
mm． Therefore，the endophytic fungi from H． miconioides possessed the value to develop microorganisms as microbi-
cidal preparation resource．
Keywords Heptacodium miconioides;endophytic fungi;isolation;identification;antibiotic activity
七子花(Heptacodium miconioides)是我国特有
的珍稀濒危保护植物［1-2］，具有较高的经济价值和
科学研究价值。植物内生真菌是一类在其生活史
中的某阶段或全部阶段生活在植物组织内、并不
引起明显病害症状的真菌［3］，是一类多样性丰富
的微生物类群，具有宿主专一性［4］。生活在濒危
植物组织中的内生真菌极有可能因宿主植物的灭
绝而消亡，从而导致微生物多样性遭到破坏。目
73微生物学杂志 2015 年 4 月第 35 卷 第 2 期 JOUＲNAL OF MICＲOBIOLOGY Apr． 2015 Vol． 35 No． 2
前已有学者对七子花群落［5］、光合生理生态［6］、繁
殖生物学［7］以及遗传多样性［8-9］等方面进行了研
究，对其濒危现状以及机理有了初步的了解，但对
濒危植物七子花内生真菌的研究尚未见报道。因
此，对濒危植物七子花内生真菌进行分离鉴定，明
确其多样性，对与其相关的微生物资源保护具有
一定的意义。大量研究结果表明，几乎所有植物
中都有内生菌的存在，由于长期的协同进化，这些
内生菌与宿主植物形成了互惠共生的关系［10］。
植物内生菌能产生多种次生代谢产物，具有促进
植物生长、提高宿主植物抗性等生理生态功能，其
中内生菌普遍存在着抗菌活性［11］，如 Dai等［12］在
刺柏属植物 Juniperus cedre 的内生真菌 Nodulispo-
rium sp．中分离到 13 种化合物，其中有 12 种具有
抗菌活性。因此，植物内生真菌可能是新型杀菌
剂的重要来源。有文献报道濒危植物七子花具有
一定的抗菌活性［13-15］，推测七子花的抗菌活性可
能与其内生真菌有关。本文拟在明确七子花内生
真菌多样性的基础上，测试其抑菌活性，为微生物
源杀菌剂的开发奠定一定的基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 实验材料 分离内生菌所用植物材料为
生长状况良好、无病虫害症状的七子花，于 2013
年 5 月采自浙江省金华市浙江师范大学校园内。
1． 1． 2 培养基 实验采用的培养基为分离和培
养植物内生真菌常用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基
(PDA)、麦芽琼脂培养基(MEA)和马丁氏培养基
以及麦芽液体培养基(ME)。
1． 1． 3 指示菌 大肠埃希菌(Escherichia coli)
ATCC 8739、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus au-
reus)ATCC 6538、白色念珠菌(Canidia albicans)
ATCC 10231。以上 3 种测试菌均来自于浙江师范
大学微生物实验室。
1． 2 方法
1． 2． 1 内生真菌的分离和纯化 参考文献［16］
的方法，清洗植物的根、茎、叶和树皮组织。在无
菌条件下，叶组织用 75%酒精表面消毒 1 min，3%
NaClO表面消毒 3 min，无菌水冲洗 5 次;对根、
茎、树皮组织用 75% 酒精表面消毒 3 min，3%
NaClO表面消毒 5 min，无菌水冲洗 5 次，用无菌滤
纸吸干。用无菌剪刀将其剪成组织小块，接种于
培养基上，每个培养基内接 5 ～ 6 个组织小块。吸
取少量最后 1 次冲洗液于培养基上作为对照，以
检验植物组织表面是否消毒彻底。置于 28 ℃恒
温培养箱中避光培养，待菌落长出后，从菌落边缘
挑取少量菌丝，再次转接 MEA 培养基平板上，经
纯化得到单菌落菌株，将纯菌落接种到 MEA斜面
试管保存备用。
1． 2． 2 内生真菌的分类鉴定 采用形态学鉴定
和分子生物学鉴定方法相结合对纯化菌株进行分
类鉴定。按照真菌经典分类方法，采用真菌插片
培养方法对分离获得的内生真菌进行显微形态特
征的观察、分类鉴定，分类检索参照真菌鉴定手
册，再结合分子 5． 8S rＲNA 基因序列在 NCBI
Blast的结果，确定各分离菌的种属地位。具体的
DNA测序方法如下:将培养 2 d 的新鲜菌体作为
DNA提取材料，采用新型快速植物基因组 DNA提
取试剂盒提取菌株基因组 DNA，1%琼脂糖凝胶
电泳检测纯度。以上述提取的基因组 DNA 为模
板，用引物 ITS1(forward):ITS1(5-TCCGTAGGT-
GAACCTGCGG-3) ，ITS4(reverse) :ITS4(5-TC-
CTCCGCTTATTGATATGC-3)对供试菌株 5． 8S
rＲNA的 ITS区域进行 PCＲ扩增。反应液体积 50
μL，包括:1． 0 μL 模板 DNA，39． 0 μL ddH2O，4． 0
μL 10 × PCＲ buffer，4． 0 μL dNTPs，ITS1、ITS4 各
1． 0 μL，0． 2 μL Taq DNA 聚合酶。PCＲ 反应程
序:94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 1 min，55 ℃复
性 1 min，72 ℃延伸 1 min，进行 35 个循环，最后
72 ℃延伸 5 min，4 ℃保存。PCＲ产物用 1%琼脂
糖凝胶测其纯度。PCＲ扩增产物经检测后送至上
海生工生物工程有限公司进行测序，测序引物为
ITS1，将所得序列与已知序列进行 BLAST比对。
1． 2． 3 内生真菌的发酵及处理 在装有 100 mL
ME培养基的 250 mL锥形瓶中接种已活化的植物
内生真菌，28 ℃，200 r /min，摇床培养 7 d，发酵液
3 层纱布过滤后用乙酸乙酯萃取 3 次，将所得的
萃取液在旋转蒸发仪(45 ℃下减压蒸馏)中进行
浓缩，得到发酵液粗提物。
1． 2． 4 内生真菌抑菌活性测定 参考文献［17］
的方法，取新华 102 型滤纸 1 ～ 2 张，用打孔器制
成直径 6 mm 的圆形纸片，装于洁净的小培养皿
内，灭菌备用。在培养皿中倒入经灭菌后的牛肉
83 微 生 物 学 杂 志 35 卷
膏蛋白胨培养基制成平板，在平板中注入 200 μL
试供细菌(1． 0 × 108 CFU)，用涂布棒将细菌均匀
涂布于平板;用无菌镊子夹取滤纸片，同时滴加 5
μL样品溶液(6 mg /mL)于滤纸片上，将上述滤纸
片置于已涂布供试菌悬液的平板中，每皿 6 片，均
匀分布，每个样品设置 3 组重复，28 ℃恒温箱中
倒置培养 24 h，观察测量抑菌圈大小。
2 结果与分析
2． 1 七子花内生真菌的分离和鉴定
从七子花各组织中分离纯化到 38 株内生真
菌，通过形态学特征观察结合 5． 8S rＲNA基因序列
分析，初步鉴定了 38 株七子花内生真菌的所属分
类地位，它们分属于6属和 1个无孢子群(见表 1)。
从表 1中可看出，濒危植物七子花中交链孢属和刺
盘孢属为优势菌群，分别有 13 株和 7 株，占内生真
菌总数的 34． 2%和 18． 4%，葡萄座腔菌属、镰刀菌
属、赤霉菌属、拟茎点霉属和无孢子群为常见属分
别有 5株、1株、4 株、5 株和 3 株，各占内生真菌比
重的 13． 2%、2． 6%、10． 5%、13． 2%和 7． 9%。
表 1 七子花内生真菌种群组成
Table 1 The composition of endophyte fungi in H． miconioides
菌株编号 形态学鉴定 5． 8S rＲNA基因测序 标准菌编号 同源性 /%
QZH 01 Colletotrichum gloeosporioides N /T N /T N /T
QZH 02 Colletotrichum gloeosporioides N /T N /T N /T
QZH 04 Fusarium Fusarium oxysporum HQ671184． 1 99
QZH 06 Alternaria Alternaria tenuissima JX406574． 1 99
QZH 07 Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum gloeosporioides JN887350． 1 99
QZH 08 Colletotrichum gloeosporioides N /T N /T N /T
QZH 09 Colletotrichum gloeosporioides N /T N /T N /T
QZH 10 Alternaria Alternaria tenuis KF951007． 1 100
QZH 13 Alternaria N /T N /T N /T
QZH 14 Alternaria N /T N /T N /T
QZH 15 Colletotrichum gloeosporioides N /T N /T N /T
QZH 16 Alternaria Alternaria solani JF491194． 1 99
QZH 17 Gibberella N /T N /T N /T
QZH 20 Botryosphaeria N /T N /T N /T
QZH 21 Phomopsis Phomopsis sp． KC172081． 1 99
QZH 22 Gibberella N /T N /T N /T
QZH 23 Mycelia sterilia N /T N /T N /T
QZHⅡ01 Gibberela Gibberela fujikuroi KF572445． 1 99
QZHⅡ03 Phomopsis N /T N /T N /T
QZHⅡ04 Phomopsis N /T N /T N /T
QZHⅡ05 Alternaria N /T N /T N /T
QZHⅡ07 Phomopsis N /T N /T N /T
QZHⅡ08 Alternaria Alternaria tenuis HM776408． 1 100
QZHⅡ10 Botryosphaeria N /T N /T N /T
QZHⅡ11 Colletotrichum gloeosporioides Colletotrichum gloeosporioides JN887342． 1 99
QZHⅡ12 Alternaria Alternaria porri JF422727． 1 99
QZHⅡ13 Alternaria N /T N /T N /T
QZHⅡ14 Alternaria N /T N /T N /T
QZHⅡ15 Alternaria N /T N /T N /T
QZHⅡ16 Botryosphaeria N /T N /T N /T
QZHⅡ17 Botryosphaeria Botryosphaeria dothidea KC197802． 1 99
QZHⅡ18 Alternaria N /T N /T N /T
932 期 余文华等:濒危植物七子花内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选
续表 1
菌株编号 形态学鉴定 5． 8S rＲNA基因测序 标准菌编号 同源性 /%
QZHⅡ19 Botryosphaeria N /T N /T N /T
QZHⅡ21 Gibberella N /T N /T N /T
QZHⅡ22 Mycelia sterilia N /T N /T N /T
QZHⅡ23 Alternaria N /T N /T N /T
QZHⅡ24 Phomopsis N /T N /T N /T
QZHⅡ25 Mycelia sterilia N /T N /T N /T
注:N /T表示没有测试，下表同
2． 2 七子花内生真菌抑菌活性的筛选
采用滤纸片法，测试了 38 株七子花内生真菌
发酵液粗提物对供试细菌的抑菌活性(表 2)，结
果表明 37 株内生真菌对 1 株或多株供试菌有抑
制作用，占分离得到内生真菌的 95%以上，这说
明七子花内生真菌抑菌活性具有普遍性;对金黄
色葡萄球菌的抑菌圈直径大于 10 mm 的内生真
菌数有 15 株，占总数的 39． 5%，其中 QZHⅡ07 的
抑菌活性最强，抑菌圈直径达 15． 5 mm;对大肠埃
希菌的抑菌圈直径大于 9． 0 mm 的内生真菌数有
8 株，占总数的 21． 1%，其中，QZHⅡ10 对大肠埃
希菌具有较好的抑菌活性，抑菌圈直径大小为
12． 0 mm。
表 2 七子花内生真菌发酵液粗提物对试测
菌抑菌活性(抑菌圈直径:mm)
Table 2 Antimicrobial activity of endophytic fungi isolated from
H． miconioides(diameter of antimicrobial circle:mm)
菌株编号 大肠埃希菌 白色念珠菌 金黄色葡萄球菌
QZH 01 7． 3 ± 0． 5 6． 5 ± 0． 7 12． 0 ± 1． 1
QZH 02 7． 5 ± 1． 3 N /T 8． 7 ± 0． 8
QZH 04 7． 0 ± 0． 0 N /T 8． 3 ± 0． 8
QZH 06 9． 5 ± 2． 1 N /T 8． 8 ± 2． 6
QZH 07 N /T 6． 5 ± 0． 7 12． 0 ± 1． 4
QZH 08 6． 5 ± 0． 8 6． 5 ± 0． 7 13． 0 ± 1． 4
QZH 09 7． 3 ± 1． 3 N /T 11． 8 ± 1． 3
QZH 10 6． 8 ± 0． 5 N /T 10． 7 ± 2． 4
QZH 13 6． 5 ± 0． 7 6． 8 ± 0． 5 7． 5 ± 0． 7
QZH 14 7． 5 ± 1． 7 6． 8 ± 0． 4 7． 8 ± 0． 5
QZH 15 N /T N /T 11． 7 ± 2． 6
QZH 16 N /T N /T 8． 5 ± 0． 7
QZH 17 6． 5 ± 0． 7 6． 5 ± 0． 5 9． 0 ± 3． 2
QZH 20 N /T 6． 3 ± 0． 3 N /T
QZH 21 N /T N /T N /T
QZH 22 9． 8 ± 1． 3 6． 4 ± 0． 5 N /T
QZH 23 7． 0 ± 0． 0 6． 8 ± 0． 8 N /T
QZHⅡ01 9． 0 ± 0． 8 N /T 12． 5 ± 1． 6
QZHⅡ03 9． 2 ± 2． 1 N /T 13． 8 ± 2． 2
续表 2
菌株编号 大肠埃希菌 白色念珠菌 金黄色葡萄球菌
QZHⅡ04 8． 8 ± 1． 0 N /T 8． 5 ± 2． 1
QZHⅡ05 8． 0 ± 1． 2 6． 3 ± 0． 4 15． 0 ± 2． 2
QZHⅡ07 N /T 6． 3 ± 0． 4 15． 5 ± 1． 0
QZHⅡ08 7． 0 ± 0． 0 6． 5 ± 0． 7 N /T
QZHⅡ10 12． 0 ± 0． 0 7． 0 ± 0． 0 9． 2 ± 3． 8
QZHⅡ11 9． 0 ± 1． 8 7． 5 ± 0． 7 7． 5 ± 0． 5
QZHⅡ12 7． 3 ± 0． 5 N /T 9． 8 ± 1． 3
QZHⅡ13 11． 0 ± 1． 4 6． 5 ± 0． 7 8． 3 ± 1． 0
QZHⅡ14 8． 5 ± 0． 7 6． 0 ± 0． 0 9． 7 ± 1． 9
QZHⅡ15 N /T 7． 0 ± 0． 0 8． 5 ± 0． 7
QZHⅡ16 9． 5 ± 0． 7 N /T 9． 0 ± 1． 4
QZHⅡ17 7． 0 ± 1． 4 6． 8 ± 1． 0 10． 8 ± 1． 8
QZHⅡ18 8． 5 ± 2． 1 N /T N /T
QZHⅡ19 8． 3 ± 1． 7 N /T 9． 5 ± 1． 9
QZHⅡ21 7． 3 ± 1． 0 N /T 10． 5 ± 2． 2
QZHⅡ22 N /T N /T 12． 2 ± 1． 6
QZHⅡ23 8． 5 ± 0． 6 7． 0 ± 0． 0 N /T
QZHⅡ24 8． 0 ± 1． 4 N /T 11． 7 ± 3． 3
QZHⅡ25 7． 8 ± 1． 5 N /T 12． 3 ± 2． 3
硫酸庆大霉素 39． 7 ± 2． 3 － 31． 8 ± 1． 3
两性霉素 － 12． 8 ± 0． 8 －
注:硫酸庆大霉素和两性霉素为阳性对照，阳性对照浓度均为
6 mg /mL(5 μL);结果表示为抑菌圈 ± 3 个平行测量值的标准
3 讨 论
本研究从濒危植物七子花中分离纯化得到
38 株植物内生真菌，通过形态学特征观察或 5． 8S
rＲNA基因序列分析，初步鉴定了 38 株七子花内
生真菌的所属分类地位，它们分属于 6 个属和 1
个无孢子群。有文献报道从喜树中纯化出 55 株
内生真菌可归为 5 个属和 1 个无孢类群［18］;从杨
树中分离到 83 个真菌菌株，其中产生孢子的 56
个菌株归为 5 个属［19］。相比之下，本研究分离得
到的七子花的内生真菌在属的水平上具有更多的
多样性。
04 微 生 物 学 杂 志 35 卷
通过抑菌实验发现，七子花内生真菌的乙酸
乙酯提取物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌有较
好的抑菌效果，表明七子花内生真菌具有开发为
微生物源杀菌剂的潜力。至于活性菌株活性成分
的分离鉴定和作用机理等，还有待于进一步的研
究和探讨。
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76-78．
·写作常识·
本刊常用的计量单位
为了更好地执行国务院发布的《关于在我国统一实行法定计量单位的命令》的规定，根据国标(GB3100 ～ 3102 － 93)
标准，单位符号一般用英文小写(正体)，来源于人名的单位，其符号的首字母大写，只有体积单位升例外，它的符号用
“L，(l)”，推荐采用 L。现将本刊常用计量单位符号及与之容易混淆的符号介绍如下，希望作者参照执行。
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面积:公顷用 hm2，不用 ha，亩或公亩，换算因数为 1hm2 = 15 亩。
旋转速度:用 r /min，× g，不用 rpm。
蒸汽压力:用 Pa或 kPa、MPa表示，不用大气压 at，kg /m2 或 kg /cm2 等。
光密度:用 OD(斜体)表示。
生物大分子的分子量:蛋白质用 u或 ku，核酸用 bp或 kb表示。
142 期 余文华等:濒危植物七子花内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选