全 文 ：中国农业科学 2015,48(6):1052-1062
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.06.02

收稿日期：2014-09-25；接受日期：2014-12-04
基金项目：国家自然科学基金（31170302）、高等学校创新引智计划（B08025）、江苏省高校优势学科建设工程资助项目
联系方式：李晨旭，E-mail：2011101116@njau.edu.cn。通信作者亓增军，E-mail：zjqi@njau.edu.cn


基于 RNA-seq 的百萨偃麦草染色体特异分子标记开发与应用
李晨旭，刘志涛，庄丽芳，亓增军
（南京农业大学农学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室/江苏省现代作物生产协同创新中心，南京 210095）

摘要：【目的】百萨偃麦草（Thinopyrum bessarabicum Löve, 2n = 2x = 14, JJ 或 EbEb）是小麦改良的重
要亲缘物种，开发染色体特异分子标记对于加快其有利基因向小麦中的转移和应用有重要意义。【方法】利用百萨
偃麦草分蘖期叶片 RNA-seq 获得的 EST 序列与节节麦 D 基因组序列进行比对，鉴定出 4 957 条没有相似性的序列
作为筛选百萨偃麦草特异序列的基础序列。从这些基础序列中随机选择部分序列设计 EST-PCR 引物 507 对，通过
在普通小麦中国春、百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中的扩增分析，筛选出百萨偃麦草基因组特异标记，
然后在已经选育出的 8个小麦-百萨偃麦草异染色体系中进行染色体定位，并探讨这些标记在小麦染色体工程中的
应用潜力；根据谷类作物的共线性，以百萨偃麦草 EST 序列设计共线性引物 100 对，并比较这些引物的扩增和定
位结果。【结果】在开发的 507 对引物中，204 对（40.2%）在百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中具有特
异扩增，多态率远高于利用小麦（12%）和百萨偃麦草（14%）EST 设计的 234 对共线性引物产生的多态率，建立
了高效开发小麦亲缘物种特异标记的新方法；利用 8个中国春-百萨偃麦草异染色体系，共定位了 198 个百萨偃麦
草特异标记，分别位于染色体 1J（31）、2JS（15）、2JL（26）、3JS（20）、4JS（12）、4JL（12）、5J（27）、6JS
（13）、6JL（22）和 7JS（20），其中 189 个是根据百萨偃麦草转录组序列设计；利用定位于 1J 和 6J 的特异标记
确定了 4 个易位系的染色体身份，其中 1个涉及 1J 的大片段易位，2 个涉及 6JS 的不同区段易位，1 个为小片段
中间插入易位；利用这些易位系，将 30 个 1J 和 12 个 6J 特异标记分别定位于 2个物理区段。【结论】通过 RNA-seq
结合与小麦基因组序列比对可以获得小麦亲缘物种相对特异的 EST 序列并据此开发引物，建立了开发外源染色体
特异标记的新方法，开发的标记可应用于小麦异易位系鉴定和缺失物理图谱的绘制。
关键词：百萨偃麦草；转录组；分子标记；易位系

Development and Application of Specific Molecular Markers of
Thinopyrum bessarabicum Löve Based on RNA-seq
LI Chen-xu, LIU Zhi-tao, ZHUANG Li-fang, QI Zeng-jun
(College of Agronomy, Nanjing Agricultural University/National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement
/JCIC-MCP, Nanjing 210095)

Abstract:【Objective】Development of adequate molecular markers covering the whole genome of an alien species is becoming
more and more important in identifying the homoeology and structure of the alien chromosomes, developing small segmental
translocations, tracing target genes and physical mapping. Thinopyrum bessarabicum Löve is an important alien species with
multiple beneficial genes for wheat breeding, 8 wheat alien lines involving seven chromosomes (arm) of Th. bessarabicum have been
developed in Cytogenetics Institute, Nanjing Agricultural University, China. Recently, many small segmental translocations
involving different chromosomes of Th. bessarabicum have been induced via irradiation, gametocidal chromosomes and ph1b system.
However, the current markers are not enough to identify these translocations. To develop more specific markers, a transcriptome of
Th. bessarabicum leaves at tillering stage was sequenced and assembled.【Method】The sequences were then used to blast against the
6期 李晨旭等：基于 RNA-seq的百萨偃麦草染色体特异分子标记开发与应用 1053
D genome sequences of Aegilops tauschii and 4957 “no hits found” sequences probably representing Th.bessarabicum specific were
used for primers development.【Result】Of 507 pairs of primers, 204 produced specific amplicons in Th. bessarabicum with a
polymorphism (40.2%) quite higher than 12% showed in 134 primers developed based on wheat ESTs and 14% showed in 100
primers developed based on the transcriptome sequences of Th. bessarabicum. Of them, 64 pairs of primers had no amplification in
wheat indicating species specific. Using 8 wheat alien lines involving seven chromosomes or arms of Th. bessarabicum, total 198
including 189 markers developed based on the transcriptome sequences of Th.bessarabicum were chromosomally mapped, which
distributed on 1J, 2JS, 2JL, 3JS, 4JS, 4JL, 5J, 6JS, 6JL and 7JS, respectively, with a number of 31, 15, 26, 20, 12, 12, 27, 13, 22 and
20. Using these markers, three wheat alien translocations involved chromosomes 1J and 6J preliminarily designated as T1JS·1JL-W,
T6JS·W, T6JS-W·W and one intercalary translocation with two specific markers were identified. After analysis on these
translocations, 7 markers were mapped on the distal part of 1JL and 23 on the left part of 1J. For 6JS, 8 markers were mapped on the
distal region and 4 on the pericentric region of 6JS. 【Conclusion】Blast against wheat D genome sequences with the transcriptome
sequences of Th. bessarabicum, a high efficient way to develop markers specific for alien species of both wheat and other crops was
developed. These markers facilitate both the identification of wheat alien translocations and physical mapping.
Key words: Thinopyrum bessarabicum; transcriptome; molecular markers; translocations

0 引言
【研究意义】染色体工程可以有效转移和利用小
麦近缘物种的有利基因，拓宽栽培小麦的遗传基础，
是小麦品种改良的重要途径之一[1]。分子标记的发展
为染色体工程提供了新的辅助选择技术，大大提高了
小麦异染色体系特别是小片段易位系的选择效率，为
更好地转移和利用小麦近缘物种有利基因提供了便
利。例如，为转移和利用拟斯卑尔脱山羊草抗秆锈病
基因 Sr39，Niu等[2]通过中国春 ph1b突变体诱导小麦
染色体 2B 和拟斯卑尔脱山羊草染色体 2S 的结构变
异，通过分子标记分析结合细胞学鉴定，从 1 048个
回交后代中选育出抗 Ug99的小片段易位系，为分子
标记和染色体工程结合转移小麦近缘物种有利基因
提供了范例。在小麦-百萨偃麦草小片段易位系[3-4]、
小麦-中间偃麦草罗伯逊易位系[5]和小麦-簇毛麦小片
段易位系[6]等的选育中均采用了类似的方法，显示了
分子标记和染色体工程相结合在鉴定小麦异易位系
和转移小麦近缘物种有利基因方面中的重要应用潜
力。【前人研究进展】百萨偃麦草（Thinopyrum
bessarabicum Löve, 2n = 2x = 14, JJ或 EbEb）具有耐
盐性好并兼抗多种麦类病害的特点，是小麦改良的重
要基因资源[7-9]。为转移和利用这些基因，在小麦-百
萨偃麦草异附加系和易位系的选育与鉴定中做了大
量工作[10-14]。南京农业大学自 20世纪 90年代利用从
CIMMYT引进的普通小麦中国春-百萨偃麦草双二倍
体和中国春回交[15]，选育出一批小麦-百萨偃麦草异
染色体系[3-4,16]，并鉴定出一批特异分子标记追踪百
萨偃麦草染色体[3-4, 17]。目前，利用自发易位、电离
辐射、杀配子染色体和 ph1b 突变体等方法已经诱导
获得了一批涉及百萨偃麦草多条染色体的易位系，特
别是小片段易位系，但由于现有标记数目有限，对这
些易位染色体的身份尚未精确鉴定，同时，由于现有
分子标记和细胞学标记的局限性，在诱变后代中可能
还存在大量小片段易位系未能鉴定出来。因此，需要
开发更多的覆盖整个基因组的百萨偃麦草特异分子
标记。RNA 高通量测序为作物及其亲缘物种的分子
遗传与比较遗传研究提供了新技术。通过 RNA-seq
可以快速获得大量表达基因序列，筛选组织或胁迫诱
导差异表达基因，在分子标记开发和分子机理研究方
面得到越来越多的应用[19-22]。对于染色体工程而言，
转录组测序不但为快速开发亲缘物种特异分子标记
提供了丰富的序列信息，而且还有助于发掘亲缘物种
的重要功能基因。【本研究切入点】在之前的研究结
果中，开发或筛选的百萨偃麦草特异分子标记主要为
AFLP、RAPD 和小麦 SSR、STS 标记，多态率低、
成本高[3-4,13,18]，且目前对于百萨偃麦草转录组测序及
其基于 RNA-seq 开发百萨偃麦草的特异标记还未见
报道。【拟解决的关键问题】本研究率先通过高通
量测序，获得百萨偃麦草转录组序列，并通过拼接
获得 EST contig序列，利用这些 EST序列与已经公
开发表的小麦 D基因组框架序列[23]进行比对分析，
鉴定百萨偃麦草相对特异的基础序列，利用这些基
础序列中的部分序列设计 PCR引物、开发并定位一
批染色体特异标记，并利用这批特异标记对细胞学
鉴定出的中国春-百萨偃麦草易位系进行了分析，探
讨这些标记在鉴定易位染色体身份和缺失作图中的
应用潜力。
1054 中 国 农 业 科 学 48卷
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2013—2014 年在南京农业大学进行。中国
春-百萨偃麦草异染色体系衍生自中国春-百萨偃麦草双
二倍体和中国春的杂交后代，DS1J(1B)、T2JS-2BS·2BL、
DA6JS·2JL、DA3JS·4JL、DS5J(5A)、DA4J、DS6J(6A)
和 DA3JS·7JS 由南京农业大学细胞遗传研究所选育[3-4]
（表 1）。百萨偃麦草引自四川农业大学，中国春-百萨
偃麦草双二倍体（C.S-Th. bessarabicum amphiploid）由
国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）Mujeeb-Kazi 博
士惠赠；普通小麦中国春（T. aestivum L. cv. Chinese
Spring，CS），由南京农业大学细胞遗传研究所保存。
1.2 序列相似性比较和引物设计
所用的转录组数据来自百萨偃麦草分蘖期叶片总
RNA，经 Illumina HiSeq 2500平台测序获得，原始数
据利用 Trinity拼接，共包括 47 908条 EST contigs（未
发表资料）。百萨偃麦草与小麦、水稻基因组序列比
对分析采用 ncbi-blast-2.2.28+-win32.exe，windows操
作系统下的 blast，本地化构建过程参考 http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK52637/。通过 windows 命
令提示窗口调用子程序 makeblast 将 D genome
sequence 和 rice chromosome 5 sequence 制作成数据
库，然后利用子程序 BLASTN进行百萨偃麦草转录
组序列与数据库之间的序列相似性比较，比对结果
显示“No hits found”的序列被视为百萨偃麦草相对
特异的基础序列。选取基础序列中的部分序列设计
PCR引物。
研究表明，小麦与短柄草、水稻染色体具有很好
的共线性关系[24-25]，为定向开发百萨偃麦草染色体
1JL 特异标记，根据小麦第一部分同源群长臂与短柄
草 Bd2 13.0 M—27.7 M和水稻 R516.2 M—29.7 M区
段的共线性，利用 wheatzapper（http://wge.ndsu.nodak.
edu/wheatzapper/）分析百萨偃麦草 EST与水稻、高粱、
短柄草基因组序列之间的共线性，选择定位于上述 2
个区段内的百萨偃麦草 ESTs 设计了 50 对引物
（CINAU2877—CINAU2926）。同时，利用定位于小
麦第一部分同源群染色体的 ESTs（http://wheat.pw.
usda.gov/cgi-bin/westsql/map_locus_rev.cgi）与本研究
获得的百萨偃麦草 RNA-seq进行比对分析，筛选出与
小麦序列高度保守的百萨偃麦草 ESTs 并设计共线性
引物 50 对（CINAU2827—CINAU2876）。引物设计
利用 primer 3.0（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）在
线软件进行。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司
合成。引物编号为 CINAU，即 Cytogenetics Institute,
Nanjing Agricultural University的首字母缩写。

表 1 植物材料及其染色体组成
Table 1 Plant materials and their chromosome constitution
材料 Materials 染色体数目 Chromosome No. 染色体组成 Chromosome constitution
中国春 Chinese Spring（CS） 42 21″
百萨偃麦草 Th. bessarabicum 14 7″J
中国春-百萨偃麦双二倍体 CS-Th.bessarabicum amphiploid 56 21″+7″J
DS1J(1B) 42 20″+1″1J(1B)
T2JS-2BS·2BL 42 20″+1″2JS-2BS·2BL
DA6JS·2JL 44 21″+1″6JS·2JL
DA3JS·4JL 44 21″+1″3JS·4JL
DA4J 44 21″+1″4J
DS5J(5A) 42 20″+1″5J(5A)
DS6J(6A) 42 20″+1″6J(6A)
DA3JS·7JS 44 21″+1″3JS·7JS

1.3 分子标记分析
PCR扩增体系为 10 µL，包括模板 DNA 30 ng左
右、Primers（10 µmol·L-1）0.4 µL、10×easy Taq buffer
（Mg2+）1.0 µL、dNTP（2.5 mmol·L-1）0.8 µL、Taqase
（5 U·µL-1） 0.1 µL，加 ddH2O至 10 µL。PCR反应
程序为 94℃ 3 min；94℃ 30 s，50—60℃（根据引物
调整退火温度），45—60 s，72℃ 1 min10 s，33个循
环；72℃ 10 min，然后 4℃保存。
6期 李晨旭等：基于 RNA-seq的百萨偃麦草染色体特异分子标记开发与应用 1055
反应结束后，在每管反应液中加入 2 µL 变性
Loading Buffer，经 8%非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳后，
用硝酸银和氢氧化钠“两步法”染色，然后照相观察。
扩增片段分子量大小利用上海培清全自动凝胶成像系
统（JS-680B）中的 SensiAnsys1.0.3软件测定。
1.4 细胞遗传分析
种子于室温下置于湿润滤纸上发芽，根长至 1—2
cm时剪根，于冰水混合物中处理 24 h，用卡诺氏固定
液固定后用于染色体制片。
基因组原位杂交（genomic in situ hybridization，
GISH）所用的探针采用缺刻平移法标记，以
Fluorescein-12-dUTP 标记的百萨偃麦草基因组 DNA
为探针、中国春 DNA 为封组进行原位杂交，杂交程
序为杂交液 105℃变性 13 min，于-20℃酒精中保持 10
min；染色体制片 73℃、70%甲酰胺中变性 1 min 10 s，
然后依次在-20℃的 70%、95%、100%酒精中梯度脱
水各 5 min，气干，每张制片加 15 µL杂交液，37℃杂
交 6 h；杂交完成后，依次在 2×SSC 洗 2次，各 5 min，
50% FA洗 1次，2 min，然后再在 2×SSC洗 2次，
各 5 min；最后在室温下，用 1×PBS洗 5 min，气干，
PI（10 mg·µL-1）套染，采用 Olympus BX60荧光显微
镜观察，图片由 CCD相机经程序 Spot32拍照获得。
2 结果
2.1 小麦 EST 标记在百萨偃麦草中的多态性扩增分析
根据小麦与短柄草的共线性，徐磊[26]利用小麦第
一部分同源群染色体上的 ESTs设计了一批 EST-PCR
引物，选用其中的 134 对引物，对中国春、
CS-Th.bessarabicum 双二倍体和 DS1J(1B)3 个材料进
行了扩增分析，结果表明，134 对引物中，125 对
（93.3%）在 3 个模板上均可以稳定扩增，其中仅 15
对（12.0%）在中国春和 CS-Th.bessarabicum双二倍体
间扩增出多态位点。利用 8个中国春-百萨偃麦草异染
色体系对 15 对引物扩增出的百萨偃麦草特异片段进
行了染色体定位，8 对引物的 9 个特异扩增片段分别
定位于 1J、2JS、5J（各 1 个）、6JL（2 个）和 7JS
（4个）（表 2），其他 7对在现有异染色体系中未获
得定位信息。
2.2 基于 RNA-seq 的百萨偃麦草染色体特异标记的
开发与染色体定位
为了提高百萨偃麦草特异标记的开发效率，采用
本地 BLAST 程序，对百萨偃麦草 RNA-seq（47908
ESTs）与小麦 D基因组（Aegilops tauschii）序列进行
了相似性比较，获得了 4 957条比对结果为“No hits

表 2 在百萨偃麦草上具有特异扩增位点的小麦 STS 引物序列、扩增位点及染色体定位
Table 2 Sequences, loci and chromosome location of wheat STS markers specific to Th. bessarabicum
引物
Primers
小麦 EST
Wheat EST
上游引物
Primer-F(5′-3′)
下游引物
Primer-R(5′-3′)
特异位点
Specific loci (bp)
染色体定位
Chromosome
退火温度
Tm (℃)
1EST852 Ta#S37942296 ACAACTCCCAGCACAAAAGG GGAGGGCTTTACAACCACAA 631 - 50
1EST853 Ta#S16058227 GGTGAAGGTGGCATTTGTCT CACTTATCGTGGGGGACAAC 1840 6JL 52
1EST868 Ta#S16876279 AGCGGTTCATTCATCCTGTC GCTTGACTGCAATGCTGGTA 750 6JL;7JS 52
1EST904 Ta#S16058000 ATCATGGGGAAACCAGCATA GCAAAATCACACGAGGAGGT 795 2JS 55
1EST909 Ta#S37942627 AGTCTACAGCCATCGCATCC CCTCATGATGTTCTCCAGCA 1180 - 50
1EST912 Ta#S13567753 GCTCGGACTTCTTCAGTTGC AGGAGAGCTTCAACGAGCTG 697 7JS 55
1EST915 Ta#S17897894 GTTCCCATACACGTCGAACC CATCAGGAGTGCTGGTTGAA 750 - 50
1EST920 Ta#S17989141 TGCACTCACTGACTCCGTCT GAAGGAGGTTCCCCATGATT 500 - 50
1EST936 Ta#S13045287 GTCGAGGATGTGGCTTTGTT GATCTTGCGGATCTCCTCTG 381 - 50
1EST937 Ta#S32591407 GCCTGGGATTCACTTCTTGA ACGACTTCTCCCTCCCTTTG 2000 1J 50
1EST940 Ta#S37779640 CACGCAAAGCATTCTCCATA TGACACCTAGCCCACTTTCA 499 5J 52
1EST944 Ta#S24513325 CACTTCCCCATGGAGCTAAA ACGGGAGTTGATTTCTGCAA 1550 - 50
1EST954 Ta#S16222288 GCAGCTCATGGATCAGACAA GGACATCTCGATGTGCTTGT 1150 - 50
1EST963 Ta#S17980104 CAACGTCGTCTTGAAACTCG TCATTGAACTGGGTCGACAG 371 7JS 50
1EST966 Ta#S32654039 TGCACGCCTCAATAAAGTTG TCATTGAACTGGGTCGACAG 750 7JS 55
“-”表示利用现有的异染色体系没有明确的定位信息。下同
“-”indicates no mapping information in the current set of wheat alien lines. The same as below
1056 中 国 农 业 科 学 48卷
found”的序列，以此作为筛选百萨偃麦草特异 ESTs
的基础序列。从上述基础 EST序列中随机选取部分序
列设计了 507对 EST-PCR引物，以中国春、百萨偃麦
草和中国春-百萨偃麦草双二倍体 3 个物种的基因组
DNA 作为模板进行了扩增分析。结果在 507 对引物
中，除 68对（13.4%）在 3个物种上均无有效扩增外，
其余 439 对（86.6%）在百萨偃麦草和双二倍体上均
有稳定的扩增位点，其中 346 对（68.2%）在中国春
上也有稳定扩增。这些引物在中国春中共扩增出 425
个位点，平均每对引物扩增 1.23个，变幅 0—3；在百
萨偃麦草中共扩增出 839个位点，平均每对引物扩增
1.91 个，变幅 0—5；在中国春-百萨偃麦草双二倍体
中共扩增出 981个位点，平均每对引物扩增 2.23个，
变幅 0—4（图 1）。在 507对引物中，204对引物（40.2%）
在百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双二倍体中同时
产生了与中国春不同的扩增位点 296个，多态率明显
高于根据小麦 EST 设计的 PCR 引物。表明利用百萨
偃麦草转录组序列与小麦D组序列比对筛选出的相对
特异的基础序列确有较高的特异性，与序列比对结果
相符。
利用 8 个小麦-百萨偃麦草异染色体系进行染色
体定位分析，共定位了 157对引物在百萨偃麦草上产
生的 182个特异标记（位点），其中，在染色体 1J、2JS、
2JL、3JS、4JS、4JL、5J、6JS、6JL、7JS上分别定位了
24、14、26、20、12、12、26、13、19、16 个特异标
记（电子附表 1，图 2），其他 47对引物的特异扩增位
点在现有小麦-百萨偃麦草异染色体系中无定位信息。
2.3 百萨偃麦草 1JL 染色体特异标记开发与定位
根据小麦与短柄草、水稻染色体的共线性[24-25]，
利用定位于短柄草 Bd213.0 M—27.7 M和水稻 R516.2
M—29.7 M区段的百萨偃麦草 ESTs设计引物 50对，
同时，利用定位于小麦第一部分同源群染色体的
ESTs（http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/westsql/map_
locus_rev.cgi）与百萨偃麦草 RNA-seq进行序列比对，

A
1 2 3 1 M 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
B
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3M


M：Marker；1：中国春；2：中国春-百萨偃麦草双二倍体；3：百萨偃麦草。箭头表示百萨偃麦草的特异带
M: Marker; 1: CS; 2: CS-Th. bessarabicum amphiploid; 3: Th. bessarabicum. Arrows show the specific bands of Th. bessarabicum

图 1 部分 EST-PCR 引物在供试材料中的扩增
Fig. 1 Patterns amplified with some EST-PCR primers in the test materials

1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112
a b
250 bp 250 bp
1 2 3 M 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112
c d


M：Marker；1：中国春；2：中国春-百萨偃麦草双二倍体；3：百萨偃麦草；4：DS1J(1B)；5：T2JS-2BS·2BL；6：DA6JS·2JL；7：DA3JS·4JL；8：
DA4J；9：DS5J(5A)；10：DS6J(6A)；11：DA3JS·7JS；12：13LCX93(中间插入易位系)。箭头表示百萨偃麦草的特异带
M: Marker; 1: CS; 2: CS-Th.bessarabicum amphiploid; 3: Th. bessarabicum; 4: DS1J(1B); 5: T2JS-2BS·2BL; 6: DA6JS·2JL; 7: DA3JS·4JL; 8: DA4J; 9:
DS5J(5A); 10: DS6J(6A); 11: DA3JS·7JS; 12: 13LCX93(an intercalary translocation line). Arrows show the specific bands of Th. bessarabicum

图 2 引物 CINAU1755（a）与 CINAU1757（b）、CINAU1880（c）与 CINAU1882（d）在 8个中国春-百萨偃麦草异染色体系中
的扩增
Fig. 2 Patterns amplified with primers CINAU1755(a) and CINAU1757(b), CINAU1880(c) and CINAU1882(d) in 8 wheat - Th.
bessarabicum alien chromosome lines
6期 李晨旭等：基于 RNA-seq的百萨偃麦草染色体特异分子标记开发与应用 1057
选择同源的百萨偃麦草 ESTs设计引物 50对。这些
引物以中国春、百萨偃麦草和中国春-百萨偃麦草双
二倍体基因组 DNA为模板，通过 PCR扩增发现 97
对（占 97%）在 3 个模板上有稳定的扩增产物，其
中 14对（14%）在百萨偃麦草和中国春间有多态性
扩增，利用 8个小麦-百萨偃麦草异染色体系进行定
位分析，其中 6 对引物的特异扩增位点定位在染色
体 1J，1对引物的特异扩增位点定位在 6JL（表 3），
其他 7 对引物的特异扩增位点在现有异染色体系中
没有定位信息。
2.4 涉及 1J 和 6J 易位系的鉴定与标记物理定位
达瓦顿珠[27]利用可以追踪百萨偃麦草 1J和 6J的
分子标记 Xedm74、Xedm92和 XZ461、XZ458分析中
国春-百萨偃麦草多重附加系 DW90-8及其后代，认为
该群体可能涉及百萨偃麦草 1J和 6J染色体，谈丽君[28]
从中选出 DS1J(1B)。本研究采用基因组原位杂交和
1J、6J特异分子标记分析，在该多重异附加系自交后
代中发现了 4个纯合易位系，分别为一个大片段易位
13LCX91（T1JS·1JL-W）、一个整臂易位 12LCX45-7
（ T6JS·W）、一个顶端小片段易位 12LCX44-7
（T6JS-W·W）和一个小片段插入易位 13LCX93（图 3）。
利用定位的 1J（30个）和 6JS（12个）特异标记对
4个易位系进行了进一步鉴定，结果表明，T1JS·1JL-W
能够扩增出 23个 1J的特异标记，并定位于涉及 1J短

A B
C D
A B C D


A：13LCX91 (T1JS·1JL-W)；B： 12LCX45-7(T6JS·W)；C：12LCX44-7(T6JS-W·W)；D： 13LCX93（一个中间插入易位系）。利用 Fluoresceint-12-dUTP
标记的百萨偃麦草全基因组 DNA作为探针，绿色信号显示百萨偃麦草染色体，Bar=10 µm
A: 13LCX91 (T1JS·1JL-W); B: 12LCX45-7(T6JS·W); C: 12LCX44-7(T6JS-W·W); D: 13LCX93 (an intercalary translocation line). Total genomic DNA of Th.
bessarabicum labeled with Fluorescein-12-dUTP as a probe, the green show chromatin of Th. bessarabicum. Bar=10 µm

图 3 小麦-百萨偃麦草易位系 GISH 分析
Fig. 3 Chromosomes of wheat-Th.bessarabicum alien lines after GISH
1058 中 国 农 业 科 学 48卷
表 3 基于共线性开发的百萨偃麦草 EST-PCR 引物序列及扩增结果
Table 3 The sequences and amplified result of EST-PCR primers of Th. bessarabicum developed based on collinearity of cereal crops
引物编号
Primer No.
上游引物
Primer-F(5′-3′)
下游引物
Primer-R(5′-3′)
百萨偃麦草 EST
Th.bessarabicum
ESTs
小麦 EST
Wheat
ESTs
特异位点
Specific loci
(bp)
染色体
Chromosome
退火温度
Tm (℃)
CINAU2834 CTCATGGCCTCCTCTACCAC TTCGTCTGGAACTTCCTCGT comp6792_c0_seq1 BE494123 611 1J 55
CINAU2847 GACCGCGGAATATCATCCTA ATTTTGAGCTGCTGCCAGTT comp7995_c0_seq1 BE442818 2200 - 55
CINAU2850 TACGTGATTGCTGGCAGAAG CAATGCACACTGCTCCAGAT comp8292_c1_seq1 BE443622 598 1J 55
CINAU2864 AGCTCTGAGGGAGGTGTGAA TCCTCCAAAAGAGCAGAGGA comp9343_c0_seq1 BE446665 875 - 55
CINAU2868 AGACTCTAAAACCCGCAGCA AAGACGTTCAAGCGGAAGAA comp9393_c0_seq1 BE403669 2051 1J 55
CINAU2874 GCGGATGGTAAACTCAAGGA TCATCGACAAGCCCAACATA comp9502_c0_seq1 BE425908 247 - 55
CINAU2883 GCGACACAGACAGACGAGAG TACGTCTCGAGGCGGAAG comp702_c0_seq1 252 - 55
CINAU2885 GAACCAGAACGGTTGGAGAA CCTGCAGATGACCACTCAGA comp1253_c0_seq1 747 1J 55
CINAU2886 CGGGAGAAGAGCAAGAACC ACCGCAAGGATTTGAACTTG comp1298_c1_seq1 248 - 55
CINAU2888 TTACTCTCTCCAGGGCGTCT CTGGTGGTGCTGCTGATG comp1850_c1_seq1 176 - 55
CINAU2890 TTGCAGGCATACAAAATTCG CTTCTCGCGCAAGTACCC comp2615_c0_seq1 184 1J 55
CINAU2903 GCTGGATTTGGAACAGGTTG TAAATACACGGGCATGCTGA comp5303_c0_seq1 198 - 55
CINAU2913 TTCATCAATGCTCTCGCATC GAGGTCCACGGTCCAGTAAA comp7508_c0_seq1 375 6JL 55
CINAU2925 GCAGGTGCTGAGAACAATGA ACTGGCCCAGGATAGAGGAT comp7854_c0_seq1 561 1J 55

臂和长臂近着丝粒区段的大片段易位区段，而 7个标
记在该易位系中没有特异扩增，因此，定位于长臂近
端粒区段；定位于 6JS的 12个标记中，8个定位在 6JS
近端粒区段，4个定位在 6JS近着丝粒区段（图 4）。
利用鉴定出的 204对百萨偃麦草特异引物对小片
段中间插入易位系 13LCX93进行鉴定，仅发现 2个标
记（XCINAU2272 和 XCINAU2319）具有特异扩增位
点，但是这两个标记并没有明确的染色体定位信息，
且在模式作物上也没有找到同源序列，因此，该易位
系具体身份尚不能确定。



图 4 百萨偃麦草染色体 1J 和 6J 特异标记的物理区段定位
Fig. 4 Physical mapping of markers specific to chromosomes 1J and 6J of Th.bessarabicum

3 讨论
3.1 基于 RNA-seq 开发百萨偃麦特异标记的特点
为了提高百萨偃麦草特异标记引物的开发效率，
本研究曾探讨了 TRAP [29]、SRAP[30]技术的应用潜力，
这两种标记由于采用固定引物和随机引物，而且引物
之间可以多种组合方式进行 PCR扩增，因此大大增加
了引物数目，且扩增多态率在 50%以上（未发表资料），
但是扩增重复效率偏低，多次试验结果之间差距较大，
必需进一步回收测序开发 SCAR 标记才能更好地利
6期 李晨旭等：基于 RNA-seq的百萨偃麦草染色体特异分子标记开发与应用 1059
用。本研究结果表明，利用高通量测序获得百萨偃麦
草转录组序列，进而通过与小麦 D基因组序列比对，
筛选出可能的百萨偃麦草特异 EST序列，利用其中的
部分序列设计引物，发现 40.2%的引物在中国春和百
萨偃麦草间具有多态性扩增，远高于根据谷类作物的
共线性，利用小麦 EST设计的 134对和本文利用百萨
偃麦草转录组 ESTs 设计的 100 对共线性引物产生的
多态性（多态率分别为 12%和 14%），因此，具有多
态率高、特异性强和开发成本低的特点。值得指出的
是，由于 68对引物可能由于引物设计问题或百萨偃麦
草转录组EST拼接出现的误差而导致在中国春和百萨
偃麦草中没有稳定扩增产物，因此，如果扣除这些不
能扩增的引物，本研究开发出的引物的多态率可能更
高些。本文设计的引物中，59.2%在中国春和百萨偃
麦草间具有相同的扩增片段，但是这些片段经过酶切
后可能会出现更多的多态性，可能有助于进一步提高
引物的开发效率。
引物扩增多态率与设计引物采用的序列有直接关
系，在序列的选择过程中，应当优先选择单拷贝序列，
同时，百萨偃麦草和小麦在分类上属于近缘物种，序
列相似度应该很高，在 47 908 ESTs中只得到了 4 957
（10.3%）条与目前公布的小麦 D 基因组序列[23]相似
性为零，也证明了这一点，这样使得可选序列较少，
增加了引物设计难度。同时，D 组序列并不代表普通
小麦中国春全基因组序列。理论上可以推测小麦序列
完整度越高，通过比对得到的特异序列相对准确率越
高（当然不排除测序和拼接过程中的错误），数目也
相应减少，由此设计出的引物特异性也高。利用百萨
偃麦草的转录组序列通过wheatzapper软件（http://wge.
ndsu.nodak.edu/ wheatzapper/）与小麦的 EST 进行比
对，确实仅鉴定出 44条百萨偃麦草特异序列，其他序
列都与现有的小麦 EST具有不同程度的相似性，利用
这 44条 ESTs仅设计出 37对引物，其中 23对在百萨
偃麦草中能够稳定扩增，但仅有 7对在小麦和百萨偃
麦草中具有多态性扩增，多态率不但没有提高，反而
降低很多（未发表资料）。因此，鉴于小麦 A、B、D
3 个基因组的基因序列间存在高度的保守性，利用小
麦近缘物种转录组序列与现有的小麦D基因组序列草
图的比对，有利于筛选出较多的相对特异序列，利用
这些序列作为基础序列设计引物，可能更利于提高小
麦亲缘物种特异标记的开发效率。当然，如果以小麦
全基因组的EST为参照来筛选小麦亲缘物种的特异序
列，筛选标准要有所降低，理论上，与小麦已知基因
序列相似性很低的亲缘物种的转录组序列可能也代表
该物种相对特异的序列，也可以作为设计引物的基础
序列，值得进行探索。与以往利用小麦、大麦等物种
的EST设计的引物在百萨偃麦草中仅具有较低的多态
性扩增相比较[3-4, 17]，由于本文设计的引物序列是来自
百萨偃麦草转录组序列且经过与小麦基因组序列比对
筛选出的相对特异序列，因而多态性明显提高，利用
同样的方法，在黑麦特异标记的开发上也取得了类似
的结果（未发表资料），显示了这种方法的有效性和
通用性。由于高通量测序成本的降低，获得小麦亲缘
物种的转录组序列变得越来越简单，因此，本文建立
的这种小麦亲缘物种的标记开发方法，将可进一步用
于更多物种的标记开发，对于其他作物而言，也有很
好的借鉴意义。
本研究发现，根据小麦与短柄草等的共线性，直
接利用百萨偃麦草转录组 EST开发的 100对共线性引
物中，97对（占 97%）在中国春、百萨偃麦草和中国
春-百萨偃麦草双二倍体 3个物种中能够稳定扩增，仅
有 14对产生百萨偃麦草特异扩增位点，而利用经序列
比对后获得的相对特异的百萨偃麦草 EST设计的 507
对特异引物中，439对（86.6%）在百萨偃麦草和双二
倍体上有稳定扩增，其中 204对扩增出百萨偃麦草特
异位点，而仅 346 对（68.2%）在中国春上有稳定扩
增。说明经过序列比对后设计的引物确实能够提高特
异标记的开发效率，有利于追踪和挖掘百萨偃麦草特
异基因，但其在小麦中的可转移性明显降低。还探
讨了根据谷类作物的共线性开发百萨偃麦草 1JL 染
色体特异标记的可行性，在利用百萨偃麦草转录组
序列设计的 100 对共线性引物中，14 对（14%）在
中国春和百萨偃麦草间具有多态性扩增，其中 6 对
引物的特异性位点定位于 1J，1对定位于 6JL（表 3），
其余 7 对没有定位信息。这种多态性与前人利用小
麦与短柄草的共线性开发的小麦第一部分同源群引
物产生的多态率非常相近（12%），但是后者定位
于 1J的标记仅为 1个，由此说明利用百萨偃麦草转
录组序列开发的共线性标记尽管多态性没有提高，
但目标性更强。
3.2 百萨偃麦特异标记的应用
利用 8个小麦-百萨偃麦草异染色体系[4]将本文开
发的 198 个百萨偃麦草特异标记，分别定位于 1J 到
7J染色体或臂，涉及全部的已经鉴定的染色体或区段。
但是仍然有 61 对引物的特异扩增位点在现有异染色
体系中没有定位信息。一个比较肯定的原因是现有的
1060 中 国 农 业 科 学 48卷
异染色体系尚没有完全覆盖 J染色体组，缺乏 2JS 近
着丝粒区段、3JL和 7JL。另一个可能的原因是在远缘
杂交过程中染色体发生了结构变异[31-32]。目前，正在
利用本文开发的标记筛选本文未涉及到的染色体或区
段异染色体系，以进一步实现小麦-百萨偃麦草异染色
体系的完整配套。
利用本文开发的分子标记，分析了 4个小麦-百萨
偃麦草易位系的染色体组成，结果明确了其中 3个易
位染色体的身份，并利用这 3个易位系，对 12个 6JS
和 30个 1J特异标记进行了区段定位。上述研究表明，
本文开发的百萨偃麦草特异标记在鉴定小麦-百萨偃
麦草小片段易位系或渐渗系以及染色体物理作图中具
有很大的应用潜力。
研究还发现，本文通过序列比对开发的 204对百
萨偃麦草特异标记引物中，157 对引物的扩增位点具
有染色体定位信息，其中 132对引物仅在单条百萨偃
麦草染色体上具有单一扩增位点，5 对引物在单条百
萨偃麦草染色体上具有 2个不同扩增位点，20对引物
在 2 条百萨偃麦草染色体上具有相同或不同扩增位
点，显示了这些基因在这些百萨偃麦草染色体进化过
程的变化特点。在已明确定位的标记中，涉及所使用
的异染色体系包含的全部染色体或区段。说明通过该
方法可以开发出覆盖全基因组的百萨偃麦草
EST-PCR标记，因此很有必要对剩余的其他特异序列
设计的引物进行扩增分析，以期开发出更多的百萨偃
麦草特异标记。
虽然本文开发的百萨偃麦草特异标记可转移性有
所降低，但仍然有 346 对（68.2%）在中国春上有稳
定的扩增位点，因而也可以作为小麦的分子标记，进
一步丰富了小麦的标记基础，同时，研究还发现这些
标记在黑麦、大麦等物种上也有不同的可转移性（未
发表数据），说明其中的部分百萨偃麦草转录组序列
可能代表谷类作物中一些较为保守的基因，部分标记
也可以用于其他物种，促进对小麦及其亲缘物种的基
因组研究。
4 结论
通过转录组测序和比较遗传分析，建立了高效
开发百萨偃麦草特异标记的新方法，成功开发出 204
对百萨偃麦草特异标记引物并进行了染色体或区段
定位，并对选育出的 4 个易位系进行了鉴定，显示
了这些标记在百萨偃麦草染色体工程中的应用潜
力。
致谢：本研究所利用的普通小麦中国春-百萨偃麦草双
二倍体（C.S-Th. bessarabicum amphiploid）由国际玉米
小麦改良中心（CIMMYT）Mujeeb-Kazi 博士惠赠，百萨偃麦
草由四川农业大学提供，特此致谢！

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（责任编辑 李莉）