全 文 ：第 39 卷 第 3 期
2015 年 5 月
南京林业大学学报(自然科学版)
Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition)
Vol． 39，No． 3
May，2015
doi:10． 3969 / j． issn． 1000 － 2006． 2015． 03． 007
收稿日期:2014 － 05 － 12 修回日期:2014 － 07 － 02
基金项目:国家林业公益性行业科研专项重大项目(201304102);国家自然科学基金项目(31270711);江苏高校优势学科建设工程
资助项目(PAPD)
第一作者:马秋月，博士生;廖卓毅，硕士生。* 通信作者:李淑娴，研究员。E-mail:shuxianli@ njfu． com． cn。
引文格式:马秋月，廖卓毅，张得芳，等． 碧桃花瓣转录组微卫星特征分析［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，2015，39(3):34 －38．
碧桃花瓣转录组微卫星特征分析
马秋月，廖卓毅，张得芳，戴晓港，陈赢男，李淑娴*
(南京林业大学南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037)
摘要:为开发碧桃转录组微卫星信息，利用 454 高通量测序技术，对其花瓣转录组序列进行 SSＲ 位点发掘，结果
发现含 SSＲ的序列 4 705 条，共得到 5 668 个 SSＲ，平均每 3． 49 kb出现 1 个 SSＲ。微卫星序列主要以三碱基重复
为主，约占总数的 42． 66%。笔者共发现 516 种碱基重复基元，所占比例最高的为(AG/CT)n(18. 34%)，其次是
(AAG/CTT)n(12. 42%)。微卫星多为重复长度小于 20 bp 的短序列，长度大于 20 bp 的微卫星仅占总数的
12. 13%。研究还发现碧桃花瓣微卫星的频率和长度呈显著负相关(P ＜ 0. 05)，相关系数为 － 0. 246。
关键词:碧桃;微卫星;SSＲ;转录组;高通量测序
中图分类号:Q948;Q78 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2006(2015)03 － 0034 － 05
Deep sequenced-based transcriptome analysis of microsatellites in peach
(Prunus persica cv． duplex)flowers
MA Qiuyue，LIAO Zhuoyi，ZHANG Defang，DAI Xiaogang，CHEN Yingnan，LI Shuxian*
(Co-Innovation Center for the Sustainable Forestry in Southern China，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China)
Abstract:To obtain information of Prunus persica cv． duplex，the transcriptome of peach flowers were sequenced by 454
high-throughput sequencing technology． A total of 5 668 SSＲs were identified in 4 705 sequences，with an average den-
sity of one SSＲ per 3． 49 kb． Tri-nucleotide repeats were the most abundant，accounted for 42． 66% of all SSＲs． Among
all the 516 SSＲ motifs，(AG/CT)n was the most frequent repeat motif (18. 34%)，followed by the(AAG/CTT)n
(12. 42%)． The microsatellites in length below 20 bp were in maximum proportion，while the microsatellites over 20 bp
were only 12． 13% ． There were significant negative correlation (P ＜ 0． 05)between the frequency of microsatellites and
the length，the correlation coefficient was － 0． 246．
Keywords:Prunus persica cv． duplex;microsatellites;SSＲ;transcriptome;high-throughput sequencing
微卫星又称简单序列重复(SSＲ)，是真核生物
基因组中由少数几个核苷酸组成的串联重复序
列［1］，其长度一般较短。SSＲ广泛分布于各类真核
生物、原核生物以及病毒基因组中［2 － 4］，具有可重
复性、数量丰富和对基因组有很好覆盖性等特点，
现已成为生物遗传特性研究的一种重要分子标记，
并被广泛应用在分子生物学、遗传学、育种学等研
究领域［5 － 6］。根据序列性质不同，SSＲ标记主要分
为基因组 SSＲ(genomic SSＲ，gSSＲ)和表达序列标
签 SSＲ(expressed SSＲ，EST-SSＲ)两种。由于 EST-
SSＲ标记源于基因的转录区，与 gSSＲ标记相比，其
多态性与基因功能有直接联系，因此比 gSSＲ 标记
具有更高的通用性［7］。近年来，随着高通量测序
技术的发展，通过对转录本进行高通量测序，能产
生较 EST 测序更为海量的转录组数据，因此更具
有信息量大和通用性好的特点，在矫正连锁图谱和
比较作图方面也具有更强的优势［8］，对功能基因
组学研究有重要的应用价值。目前已有不少研究
者对 Camellia sinensi［7］、Nymphoides peltata (Men-
yanthaceae)［9］、松树［10］等很多物种转录组中的微
卫星进行了分析，结果表明，其在不同物种中的分
布特征存在较大差异。
碧桃(Prunus persica cv． duplex)是蔷薇科(Ｒo-
saceae)李属的木本观赏植物，起源于中国，因其花
多为重瓣，花色艳丽，具有极高的观赏价值，在园林
绿化中得到广泛应用。近年来，不少研究者在桃树
第 3 期 马秋月，等:碧桃花瓣转录组微卫星特征分析
生理生化以及分子水平等领域开展了相关研
究［11 － 12］。2013 年桃树基因组测序工作完成
后［13］，桃树分子标记的开发日益受到重视［14］，如
曹珂等［15］利用多种分子标记以桃“红垂枝”与碧
桃“白花山”为亲本，构建了一张包含 206 个标记
的遗传图谱，并对雌蕊发育和单瓣 /重瓣性状进行
了定位;Verde等［13］对 56 个桃树品种进行重测序，
从中检测到 1 022 354 个 SNP。但是相对于拟南
芥、水稻、小麦等模式植物来说，桃树功能基因组
SSＲ标记的开发还非常有限。该研究利用 Ｒoche
－ 454 FLX 高通量测序平台对碧桃花瓣转录组进
行测序，并对微卫星序列特征和组成开展分析，以
期为后续桃品种鉴别、功能基因组 SSＲ 标记的开
发、桃树基因表达调控、基因组进化、QTL定位等提
供一定的理论依据。
1 材料与方法
1． 1 试验材料及数据来源
碧桃花瓣于 2013 年 3 月采自南京市情侣园，
采后用液氮迅速冷冻，置于 － 80 ℃冰箱保存备用。
用 Ｒoche － 454 FLX 测序仪对花瓣测序后，共获得
1 556 684条 reads，平均读长 446 bp，得到 695． 34
Mb的数据量。去除低质量序列后，1 492 289条
reads被组装成 22 762 个 contig。测序原始数据已
上传至美国国家生物技术信息中心(national center
for biotechnology information，NCBI)，登 录 号
为 SＲＲ1037160。
1． 2 简单重复序列(SSＲ)的分析方法
SSＲ位点的搜索主要是利用 Perl 操作平台下
的 MISA软件(misa-microsatellite identification tool，
MISA，http:/ / pgrc． ipk-gatersleben． de /misa /)搜索
所得到的 contig，参数设置为:单碱基、二碱基、三
碱基、四碱基、五碱基、六碱基的最短重复分别为
12、6、4、3、3、2。复合 SSＲ 两个位点间最大间隔碱
基数(maximal number of bases interrupting 2 SSＲs
in a compound microsatellite)为 100。
2 结果与分析
2． 1 碧桃花瓣转录组序列中 SSＲ重复的分布
Weber在 1990 年按照微卫星重复序列结构的
不同，将微卫星分为完整型 SSＲ、不完整型 SSＲ 以
及复合型 SSＲ［16］。完整型 SSＲ是由一种串联重复
序列以不间断的重复方式构成的单一重复类型的
微卫星;不完整型 SSＲ是指 3 个或 3 个以下的非重
复碱基将 2 个或 2 个以上的同种重复序列分隔开
的现象;复合型 SSＲ指 3 个或者 3 个以上连续的非
重复碱基将 2 个或 2 个以上的串联核心序列间隔，
并且连续性的核心序列重复数不得少于 5。该研
究利用 MISA软件分析了 22 762 个 contig 中 SSＲs
的特征，序列拼接的总长度为 19 803 kb，其中含不
同重复基元 SSＲs的序列有 4 705 条，共得到5 668
个 SSＲs，完整型 SSＲs 5 075 个，平均每 3. 49 kb 出
现 1 个 SSＲ 序列，SSＲ 序列的出现频率为 0. 286
SSＲ /kb。经对碧桃花瓣转录组中 1 ～ 6 碱基完整
型 SSＲ进行分析，部分微卫星信息见表 1。
表 1 碧桃花瓣转录组中微卫星数据库的部分结果
Table 1 SSＲ database of the peach flower transcriptome
重叠群
contig name
SSＲ类型
SSＲ type
重复单元
repeat motif
SSＲ长度 /bp
SSＲ length
＞ contig00764 (CT)6 二碱基 dinucleotide 12
＞ contig00797 (AG)21 二碱基 dinucleotide 42
＞ contig00845 (GCT)5 三碱基 trinucleotide 15
＞ contig01106 (ACA)4 三碱基 inucleotide 12
＞ contig00854 (TTGG)4 四碱基 tetranucleotide 16
＞ contig01030 (GACC)3 四碱基 tetranucleotide 12
＞ contig00269 (TGCCT)4 五碱基 pentanucleotide 20
＞ contig01835 (T)14 单碱基mononucleotide 14
2． 2 碧桃花瓣转录组中优势重复单元碱基组成
分析
在所有碱基重复类型中，三碱基重复单元的
SSＲ含量最多，约占总数的 42． 66%，其次分别为
二碱基(22． 78%)、四碱基(19． 68%)、五碱基
(7. 43%)、单碱基(7. 00%)和六碱基(0. 45%)。
研究中还发现 516 种重复基元(motif)中，(A/T)n、
(AG/CT )n、(AAG/CTT )n、(AAAT /ATTT )n、
(AAAAT /ATTTT)n、(AACCCG/CGGGTT)n 分别在
单、二、三、四、五和六碱基中出现频率最多，它们在
各自重复基元类型中的比例分别是 84. 51%、
79. 15%、28. 50%、20. 22%、15. 95%、8. 70%(表 2)。
在碧桃 516 种碱基重复基元中，单、二、三、四、
五及六碱基重复基元分别有 4、11、60、187、228、26
种，从出现的频率来看，所占比例最高的是(AG /
CT)n(18. 34%)，其次是(AAG /CTT)n(12． 42%)、
(AGC /CTG)n(6． 77%)、(A /T)n(5． 90%)、(ATC /
ATG)n(5． 90%)等。不同类型重复基元 SSＲs分布
见图 1。
53
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 39 卷
表 2 碧桃花瓣转录组中不同微卫星优势重复基元出现的频率
Table 2 Occurrence frequency of different advantage repeat motifs of the peach flower transcriptome
重复类型
repeat type
类型数量
number of type
频率 /%
frequency
最多重复基元
maximum repeat motif
基元数量
number of motif
比例 /%
proportion
单碱基
mononucleotide 355 7． 00 A /T 300 84． 51
二碱基
dinucleotide 1 156 22． 78 AG /CT 1 172 79． 15
三碱基
trinucleotide 2 165 42． 66 AAG /CTT 617 28． 50
四碱基
tetranucleotide 999 19． 68 AAAT /ATTT 202 20． 22
五碱基
pentanucleotide 377 7． 43 AAAAT /ATTTT 60 15． 95
六碱基
hexnucleotide 23 0． 45 AACCCG /CGGGTT 2 8． 70
图 1 不同类型重复单元的微卫星分布
Fig． 1 Microsatellites distribution on different repeat
motifs
注:此结果考虑了碱基互补作用。others 表示频率小于
0. 80%的重复基元类型。
Note:The figure considered sequence complementary． others
denote the repeat motifs with frequency below 0. 80% ．
图 2 碧桃花瓣转录组中微卫星的长度分布
Fig． 2 Length distribution of microsatellites in peach
flower transcriptome
2． 3 碧桃花瓣转录组序列中微卫星的长度分布
在碧桃花瓣转录组中所发现的 5 075 个完整
型 SSＲs中，微卫星长度存在极显著变异，从 12 ～
197 个碱基不等，平均长度为 15． 86 个碱基。如图
2 显示，碧桃花瓣微卫星中多为重复长度小于 20
bp 的短微卫星重复序列，其中 12 ～ 15 bp的数量最
多，其次为 16 ～ 20 bp，长度大于 20 bp 的长序列重
复仅占微卫星总数的 12． 13%。进一步利用 SPSS
软件 Person分布进行相关性分析，结果显示微卫
星出现的频率和其长度呈显著负相关(P ＜ 0． 05)，
相关系数为 － 0． 246。
碧桃花瓣转录组中 SSＲ 的数量与其长度的关
系见图 3。从图 3 可以看出，随着重复次数的增
加，SSＲ数量呈明显下降趋势，仅当其他碱基类型
的重复数从 3 次(1 172 个)增加到 4 次(1 546 个)
时，碧桃花瓣的 SSＲ 数量出现了增加。从图 3 中
还可以看出，碱基的重复次数越少，其数量下降的
速率就越快。当单碱基和二碱基的重复次数为 16
次，其他碱基重复次数为 12 次时，SSＲ的下降速率
降低，最终进入平台期。
图 3 碧桃花瓣转录组中 SSＲ数量随重复次数的变化
Fig． 3 Changes with the number of peach flower
transcriptome of SSＲ with repeat
注:Others 表示三、四、五、六碱基重复 SSＲ的总和。
Note:Others denote the total number of Tri －，Tetra －，Penta
－，and Hex-nucleotides repeats．
3 讨 论
微卫星序列对基因的功能会产生重要的影响，
63
第 3 期 马秋月，等:碧桃花瓣转录组微卫星特征分析
其序列特征是了解不同物种基因组差异的重要指
标。碧桃花瓣转录组中，微卫星序列主要以三碱基
重复为主，约占总数的 42． 66%。微卫星多为重复
长度小于 20 bp 的短重复序列，长度大于 20 bp 的
微卫星仅占总数的 12． 13%。研究中还发现微卫
星的频率和长度呈显著负相关(P ＜ 0． 05)，相关系
数为 － 0． 246。
3． 1 碧桃花瓣转录组中 SSＲ微卫星分布特征
以往的研究表明，微卫星的形成可能与 DNA
复制滑脱、核酸交替以及重组不平衡有关［3］。Biet
等［17］研究发现 CA、GA、GT 等重复可以通过影响
DNA的结构而影响 DNA 重组，因此微卫星中重复
单元碱基组成在很大程度上会影响生物的生命活
动。该研究利用 Ｒoche － 454 FLX 高通量测序平
台，对碧桃花瓣进行转录组测序，并利用 Misa 软件
在该转录组序列中搜索到 5 668 个微卫星，这些微
卫星分布在 4 705 条序列中，SSＲ 的出现频率为
0. 286 个 /kb，平均每 3． 49 kb 出现 1 个 SSＲ 序列。
Wang等［18］对不同品种桃树的叶子、花瓣、果实的
转录组进行分析时发现，SSＲ 分布密度为 0． 313
个 /kb，与此次对碧桃的研究结果相近。另外，茶
树(0． 272 个 /kb)［7］、拟南芥(0． 357 个 /kb)和葡萄
(0． 247 个 /kb)中 SSＲ 的分布密度与之也比较相
近，但是这个分布密度却低于单子叶植物，如水稻
(0． 739 个 /kb)、高粱(0． 646 个 /kb)［19］。此次研
究还发现，碧桃花瓣三碱基重复单元的 SSＲ 数量
最多，约占总数的 42． 66%，这与对桃树、小麦、柑
橘、百合等的研究结果一致［20 － 22］。但是也有学者
发现，茶树、白桦、核桃、猕猴桃、杨树等以二碱基重
复类型为主［23 － 27］，因此不同物种中优势重复类型
有所不同。另外，不同优势碱基单元在不同物种中
也呈现出很大的差别。此次研究中，碧桃花瓣优势
碱基 单 元 中 所 占 比 例 最 高 的 是 (AG /CT)n
(18. 34%)，这与王丽鸳等［23］在茶树花(Camellia
sinensis)、袁阳阳等［9］在莕菜(Nymphoides peltata)、
Aggarwal等［28］在咖啡(Coffea arabica)转录组分析
中的结果一致［25］。碧桃花瓣三碱基重复中，AAG /
CTT最多(占总 SSＲ 的 12． 42%)，对莕菜［9］、西葫
芦［29］、红豆杉［30］等的报道中也是如此，而在水稻、
高粱、玉米等作物中却是 GGC /CCG为三碱基重复
类型中最多［31］，袁阳阳等［9］认为这可能与不同物
种中相应编码蛋白的使用频率有关。
GC重复基元在水稻、玉米、大豆等植物中很
难见到［32］，小麦、油菜中虽有发现，但相对频率却
比较低［33 － 34］。此次碧桃花瓣转录组中 GC 重复基
元也比较少，仅在三碱基重复类型中发现 89 个，四
碱基中有 5 个，五碱基中有 1 个，因此 GC 碱基重
复在植物中有一定的偏倚性。产生这一现象的原
因可能是由于基因组 DNA 中 CpG 岛的甲基化造
成的［32］，甲基化的胞苷酸 C 很容易经过脱氨基作
用转变成胸腺嘧啶 T，同时基因组 DNA 中 CpG 的
甲基化会成为突变的热点，但少量的 GC 又是维持
DNA热力学稳定性所必需的，这可能是导致 GC含
量偏少的原因［3］。
3． 2 碧桃花瓣转录组序列中 SSＲ长度变异情况
SSＲ分子标记的多态性是判断其可用性的重
要依据，而其长度和重复次数又是影响其多态性高
低的重要因素。多数研究者认为这种多态性起因
于复制过程中的滑动［35］。根据 Tenmykh 等［36］的
研究，当 SSＲ 长度大于等于 20 bp 时多态性较高，
长度在 12 ～ 20 bp之间的 SSＲ多态性中等，长度在
12 bp以下时多态性极低。该研究在 SSＲ 筛选过
程中已经将多态潜能很低的(12 bp 以下)SSＲ 过
滤掉，最终发现碧桃花瓣转录组中长度为 12 ～ 197
个碱基不等，平均长度为 15． 86 bp，以重复长度
12 ～ 15 bp的短重复序列为最多，其次为 16 ～ 20 bp
(12 ～ 20 bp占 87． 87%)，具有中等多态性;长度大
于 20 bp 的长序列重复仅占微卫星总数的
12. 13%，此类具有高度多态性，可以预计这部分多
态性潜能高的 SSＲ在桃树上应具有较高的利用价
值［7］。笔者在研究中还发现，微卫星的频率与长度
呈显著负相关(P ＜0． 05)，相关系数为 －0． 246。Sa-
madi等［37］的模拟分析认为，微卫星重复单位长度的
变化与其选择压力有关，长度越长所受的选择压力
将会越大，拷贝数就越少，因此基因组中长度较短的
微卫星变异速率较快，而较长的变异速率会较慢，相
对较为稳定。尽管基因序列中的微卫星增加了基因
的不稳定性，但这样的不稳定性也为基因的变异提
供了动力。
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(责任编辑 刘昌来)
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