全 文 ：第 38 卷 第 2 期
2014 年 3 月
南京林业大学学报(自然科学版)
Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition)
Vol． 38，No． 2
Mar．，2014
doi:10． 3969 / j． issn． 1000 － 2006． 2014． 02． 032
收稿日期:2013 － 01 － 26 修回日期:2013 － 10 － 12
基金项目:国家自然科学基金项目(30972409)
第一作者:吕秀立，高级工程师。* 通信作者:张春英，高级工程师，博士。E-mail:mayzhang55@ 163． com。
引文格式:吕秀立，魏翔莺，尹丽娟，等． 大叶常绿杜鹃叶片离体培养及不定芽再生［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，2014，38
(2):165 － 168．
大叶常绿杜鹃叶片离体培养及不定芽再生
吕秀立1，魏翔莺2，尹丽娟1，黄 芳1，张春英1*
(1．上海市园林科学研究所，上海 200232;2．福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002)
摘要:以大叶常绿杜鹃无菌苗的嫩叶为试验起始材料，研究了其离体培养和不定芽再生的过程。结果表明:培养
基为 MS + ZT(1． 0 mg /L)+ NAA(0． 1 mg /L)时，大叶常绿杜鹃叶片可直接诱导再生不定芽，诱导率达 70%;也可
以通过愈伤组织途径间接诱导出不定芽，愈伤组织诱导培养基为MS +2，4 －D(2． 0 mg/L)+KT(0． 2 mg/L)，增殖最
佳培养基为MS +ZT(0． 5 mg/L)+ IBA(0． 1 mg/L)，愈伤组织分化的最佳培养基为 MS + ZT(0． 04 mg/L)+ NAA(0． 01
mg/L);分化率最高为 70%，分化苗数为 6 ～10株;生根培养基为 MS +NAA(0． 2 mg/L)+ IBA(0． 4 mg/L)时，生根率可
达 90%。腐殖土、黄沙、珍珠岩配比为 4∶ 1∶ 1的混合基质较适合常绿杜鹃试管苗的炼苗移栽，成活率为 90%。
关键词:大叶常绿杜鹃;离体培养;不定芽再生系统
中图分类号:Q948 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2006(2014)02 － 0165 － 04
In vitro leave culture of broad leaf evergreen rhododendron and its
regeneration of adventitious buds
LYU Xiuli1，WEI Xiangying2，YIN Lijuan1，HUANG Fang1，ZHANG Chunying1*
(1． Shanghai Landscape Gardening Ｒesearch Institute，Shanghai 200232，China;
2． College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China)
Abstract:Using the young leaves of aseptic broad leaf evergreen rhododendron seedling as the starting materials for this
experiment，the culture conditions in vitro and regeneration of adventitious budswere studied． The results showed that:the
best medium composition inducing adventitious buds directly from leaf explants were MS + ZT 1． 0 mg /L + NAA 0． 1
mg /L，which made the induction rate reach to 70% ． The adventitious buds could also be induced from the callus indi-
rectly，the best medium composition for which was MS + 2，4 － D 2． 0 mg /L + KT 0． 2 mg /L，the best multiplication me-
dium for callus was MS + ZT 0． 5 mg /L + IBA 0． 1mg /L，the best medium for callus differentiation was MS + ZT 0． 04
mg /L + NAA 0． 01 mg /L，which made differentiation rate reach to 70% and the differentiation number of seedlings 6 －
10． The rate of rooting could reach to 90% by the medium of MS + NAA 0． 2 mg /L + IBA 0． 4 mg /L． The mixed com-
post contained four parts of humus soil，and one part of yellow sand，one part of perlite，which was quite suitable for ev-
ergreen rhododendron seedlings transplanting in vitro，and the survival rate was 90% ．
Key words:broad-leaf evergreen rhododendron;in vitro culture;regeneration system of adventitious buds
杜鹃花是我国十大传统名花之一，也是欧美第
二大木本花卉，为著名的盆栽花卉和庭院绿化美化
植物。我国是杜鹃花的主要分布中心，也是杜鹃花
生物多样性最富集的地区，世界上约 70%的杜鹃
花物种资源聚集在我国。大叶常绿杜鹃是杜鹃花
中观赏价值较高的类群，其中云锦杜鹃(Ｒhododen-
dron fortunei)花大如碗、粉红色，花时灿若云霞，有
时一棵树开花可达千余朵，素有“千花杜鹃”之美
称，是一种观赏价值高、开发潜力大的园林树种，且
具有抗性强、花大有香味、结实率高等优点，因而成
为欧美国家 20 世纪杜鹃花育种最著名的亲本之
一［1］，它的许多杂交品种被誉为当时最好的品种
群［2］。该研究中的试验材料 Ｒhododendron‘Scintil-
lation’即为云锦杜鹃杂交优良品种之一。
杜鹃组培快繁的研究报道较多［3 － 4］，对云锦杜
鹃［5］、西洋杜鹃［6］、桃叶杜鹃［7］实现了叶片离体培
养诱导出再生植株，但杂交品种 Ｒhododendron
‘Scintillation’特性与其母本不同，无性繁殖困难，
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 38 卷
笔者以其叶片为外植体，对叶片离体培养和不定芽
再生进行研究，以期建立大叶常绿杜鹃的不定芽再
生体系，满足繁育良种试管苗的需求，使得叶片培
养植株再生体系为下一步的体细胞无性系变异、体
细胞融合，以及开展基因工程培育新品种做准备。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
供试杜鹃为上海市园林科学研究所盆栽 2 ～ 4
年生大叶常绿杜鹃(引自德国)，2010 年取其带腋
芽茎段以直接器官发生方式建立了离体培养体系，
2011 年在此基础上，取无菌苗形态学上端第 4 对
叶片进行不定芽诱导。
1． 2 不定芽的产生
直接发生时，将大叶常绿杜鹃叶片边缘剪去，
以远轴面朝下接种于不定芽诱导培养基上，以 MS
为基础培养基，ZT、BA分别设置 0． 1、0． 5、1． 0、2． 0
mg /L 4 个梯度，并添加 0． 1 mg /L NAA，分别暗培
养 1、5、10、15 d。
愈伤组织途径诱导分化分 3 个步骤:
(1)愈伤组织诱导。将大叶常绿杜鹃叶片边缘
剪去，以远轴面朝下接种于愈伤组织诱导培养基 MS
+2，4 － D(2． 0 mg /L)+ KT(0． 2 mg /L)，暗培养。
(2)愈伤组织继代增殖。将形成的愈伤组织
从叶片上剥离，接种于愈伤组织增殖培养基，以 MS
为基础培养基，ZT、BA 分别设置 0． 1、0． 5、1． 0
mg /L 3 个梯度，并添加 0． 1 mg /L IBA，完全黑暗条
件下培养，每 4 周继代 1 次。
(3)再生芽的诱导。在不定芽诱导阶段，需要
将黑暗条件下培养出的愈伤组织转入光下进行不
定芽的诱导，诱导培养基以 MS 为基础培养基，ZT、
BA分别设置 0． 01、0． 02、0． 04、0． 08 mg /L 4 个梯
度，并添加 0． 01 mg /L NAA。
以上各种培养基 pH为 5． 7 ～ 5． 8，蔗糖 3%，琼
脂 0． 64%，分装后在高压灭菌锅中 121 ℃条件下
保持 17 min，放置待用。
1． 3 生根培养及移栽
将生根试管苗开瓶炼苗 3 ～ 4 d 后，洗净培养
基，移栽于不同配比的基质中，注意保湿，20 ～ 25 d
可以成活，45 d后可移植于田间。
1． 4 数据统计及处理
每种处理调查 30 个，重复 3 次，统计出芽外植
体数、增殖苗数、愈伤组织增重倍数和生根条数。
诱导率 =出芽外植体数 /接种数;增殖系数 =
增殖芽数 /接种数;愈伤组织增重倍数 =(愈伤组
织培养后质量 －愈伤组织培养前质量)/愈伤组织
培养前质量;生根率 =生根株数 /接种数;平均生根
数 =生根总条数 /生根株数。
所有试验数据采用 DPS 进行方差分析，Dun-
can检测方法，0． 05 检测水平。
2 结果与分析
2． 1 大叶常绿杜鹃不定芽的直接发生
大叶常绿杜鹃叶片在添加 BA、ZT 的培养基上
都可诱导出芽(图 1)，但 ZT诱导效果显著(表 1)。
BA质量浓度小于 2． 0 mg /L时，需要 1 个月的时间
才能形成不定芽，且数量很少，诱导率低。ZT
在0. 5 ～ 2． 0mg /L的范围内，接种10 d即可观察到叶
图 1 大叶常绿杜鹃叶片离体培养和植株再生
Fig． 1 Callus induction from leaf explants of Ｒhododendron‘Scintillation’and the plant regeneration
注:A，B．叶片初代培养;C．叶片不定芽直接发生;D．叶片诱导形成的愈伤组织;E．愈伤组织发生的不定芽;F．生根。
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第 2 期 吕秀立，等:大叶常绿杜鹃叶片离体培养及不定芽再生
表 1 不同激素及其水平对大叶常绿杜鹃叶片的不定芽
发生的影响
Table 1 Effects of different hormone and hormone
concentrations on bud regeneration directly
from leaves
处理 /(mg·L －1)
treatment
接种数
bud inoculation
number
出芽外植体数
explants
number
诱导率 /%
induction
rate
MS + BA0． 1 + NAA 0． 1 30 4d 13． 33d
MS + BA0． 5 + NAA 0． 1 30 7c 23． 33c
MS + BA1． 0 + NAA 0． 1 30 9bc 30bc
MS + BA2． 0 + NAA 0． 1 30 10b 33． 33b
MS + ZT0． 1 + NAA 0． 1 30 9bc 30bc
MS + ZT0． 5 + NAA 0． 1 30 17a 56． 67a
MS + ZT1． 0 + NAA 0． 1 30 18a 60a
MS + ZT2． 0 + NAA 0． 1 30 17a 56． 67a
注:表中数字后不同的字母表示 0． 05 水平差异显著性(p ＜
0. 05)，下同。
片边缘卷曲，逐渐形成瘤状突起(图 1B)，20 d成为
可见的不定芽，诱导率最高达到 60%，与其他激素
处理组的诱导率差异显著(p ＜ 0． 05)。
将叶片置于 MS + ZT(1． 0 mg /L)+ NAA(0． 1
mg /L)培养基上，培养初期分别暗培养 1、5、10、
15 d，再转至光下培养，结果如表 2 所示。初期暗
培养能显著提高叶片不定芽的分化率，随着暗培养
时间的延长，分化率也在逐渐提高，但差异不显著
(p ＞ 0. 05)，但当暗培养时间超过 10 d 时，分化率
呈现下降趋势，并且分化的不定芽叶色嫩黄甚至出
现白化苗。综上所述，大叶常绿杜鹃叶片直接诱导不
定芽发生时，培养基以 MS + ZT(1． 0 mg /L)+ NAA
(0． 1 mg /L)，初期暗培养时间以5 d为最佳，诱导率可
达 73. 33%，叶色浓绿，植株生长旺盛(图 1C)。
表 2 暗培养时间对大叶常绿杜鹃叶片不定芽发生的影响
Table 2 Effects of different culture days in dark on
bud regeneration
暗培养时间 /d
culture days
in dark
接种数
inoculation
number
出芽外植体数
explants
number
诱导率 /%
induction
rate
1 30 20ab 66． 67ab
5 30 22a 73． 33a
10 30 20ab 66． 67ab
15 30 19b 63． 33b
2． 2 愈伤组织途径诱导分化不定芽
将叶片接种于愈伤组织诱导培养基 MS + 2，4
－ D(2． 0 mg /L)+ KT(0． 2 mg /L)培养，第 8 天在
边缘切口处开始产生白色粒状的愈伤组织，随着培
养时间的延长，愈伤组织逐渐增多，培养至 30 d 时
可以切下进行愈伤组织的增殖培养。
将初代培养得到的愈伤组织用镊子将其分成
约 5 mm大小，接种在新鲜的愈伤组织增殖培养基
上继代培养。在所设计的培养基上，愈伤组织都能
够进行增殖生长，经 30 d 培养，愈伤组织体积膨
大，质量增加为原来的 1. 1 ～ 2. 5 倍(表 3)，其中在
MS + ZT(0. 5 mg /L)+ IBA(0. 1 mg /L)培养基上，
愈伤组织增殖速度最快且差异显著(p ＜ 0. 05)，呈
乳黄色，致密(图 1D)，后期培养证明更易产生不定
芽，因此选作常绿杜鹃愈伤组织的增殖培养基。
表 3 不同激素及其水平对愈伤组织增殖的影响
Table 3 Effects of different hormone and hormone
concentrations on calli multi propagation
处理 /(mg·L －1)
treatment
接种数
number of
inoculated
explants
增重倍数
increase
multiple
颜色和状态
color and
condition
MS + BA0． 1 + IBA 0． 1 30 1． 1d 黄绿色，易碎
MS + BA0． 5 + IBA 0． 1 30 1． 5c 黄绿色，松软
MS + BA1． 0 + IBA 0． 1 30 2． 0b 白绿色，松软
MS + ZT0． 1 + IBA 0． 1 30 1． 3cd 黄绿色，致密
MS + ZT0． 5 + IBA 0． 1 30 2． 5a 乳白色，致密
MS + ZT1． 0 + IBA 0． 1 30 2． 1b 乳白色，致密
不定芽的诱导结果表明，将大叶常绿杜鹃叶片
愈伤组织转入无任何激素的 MS 基本培养基上，
25 ～ 30 d后可分化出苗，但分化率仅为 6． 67%，且
为单苗。若将愈伤组织转到含低浓度激素的培养
基上，能不同程度地分化出丛生芽，经筛选发现在
MS + ZT(0. 04 mg /L)+ NAA(0. 01 mg /L)培养基上
分化率最高为 70%，出苗数量最多，平均出苗数为 6
株，与其他组处理效果差异基本显著(p ＜ 0. 05)。
表 4 不同激素及其水平对大叶常绿杜鹃愈伤组织上
不定芽再生的影响
Table 4 Effects of different hormone and hormone
concentrations on bud regeneration from callus
处理 /
(mg·L －1)
treatment
接种数
explants
number
出芽外
植体数
bud explants
number
诱导率 /%
induction
rate
平均出
苗数
average
budding
MS0 30 2e 6． 67e 1e
MS + BA0． 01 + NAA 0． 01 30 4e 13． 33e 2d
MS + BA0． 02 + NAA 0． 01 30 7d 23． 33d 3cd
MS + BA0． 04 + NAA 0． 01 30 11c 36． 67c 3cd
MS + BA0． 08 + NAA 0． 01 30 9cd 30． 00cd 3cd
MS + ZT0． 01 + NAA 0． 01 30 9cd 30． 00cd 3d
MS + ZT0． 02 + NAA 0． 01 30 15b 50． 00b 4c
MS + ZT0． 04 + NAA 0． 01 30 21a 70． 00a 6a
MS + ZT0． 08 + NAA 0． 01 30 19a 63． 33a 5b
在不定芽诱导阶段，需要将黑暗条件下培养出
的愈伤组织转入光下培养，如果一直处于黑暗状
态，不容易形成芽点更不会形成再生芽，原因是光
照通过调节糖代谢中关键酶的活性来调节糖代谢
水平，使其协同参与对愈伤组织分化的调节［8］。
2． 3 大叶常绿杜鹃试管苗生根培养及移栽
大叶常绿杜鹃试管苗始发见根时间为 25 d，在
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南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 38 卷
所试验的培养基中，以 MS + NAA(0． 2 mg /L)+
IBA(0． 4 mg /L)为最佳(表 5)，40 d 后生根率达到
90%，比其他处理组差异显著(p ＜ 0． 05)，平均生根
数为 6． 0条，根细长，根部无愈伤组织产生，有利于
移栽(图 1E，1F)。当 NAA和 IBA配合使用时，可以
大大提高生根率和平均根数以及生根质量，两种生
长素相互作用产生的效果比单独使用一种要好。
表5 不同激素及其水平对大叶常绿杜鹃试管苗生根的影响
Table 5 Effects of different hormone and hormone
concentrations on root propagation
处理/(mg·L －1)
treatment
生根株数
root
number
生根率/%
rooting
rate
生根条数
rooting
number
平均生根数
mean No．
of roots
愈伤程度
callus
development
1 /2MS + NAA 0． 2 5e 16． 7e 20e 4． 0b 无
1 /2MS + NAA 0． 4 12c 40． 0c 72d 6． 0a 少量
MS + NAA 0． 2 2fg 6． 7fg 5g 2． 5cd 无
MS + NAA 0． 4 14c 46． 7c 90c 6． 4a 少量
MS + NAA 0． 6 12c 40． 0c 72d 6． 0a 中量
MS + NAA 0． 8 14c 13． 3ef 12f 3． 0bc 大量
MS + IAA 0． 4 8d 26． 7d 20e 2． 5cd 少量
MS + IBA 0． 2 0g 0． 0g 0g 0． 0e 无
MS + IBA 0． 6 3ef 10． 0ef 5g 1． 7d 中量
MS + NAA0． 2 + IBA0． 4 27a 90． 0a 162a 6． 0a 无
MS + NAA0． 4 + IBA 0． 2 23b 76． 7b 131b 5． 7a 少量
注:接种数均为 30。
大叶常绿杜鹃幼苗保水力不强，1 ～3 d后即萎蔫，
如果经过1 ～3 d不萎蔫，则可继续存活，30 d后统计其
存活率。杜鹃根系的生长需要土壤有良好的通透性，如
果土壤空气含量不足，会影响根的发育和生长。黄沙、
珍珠岩、腐殖土是杜鹃种植中常用的基质，该研究结果
表明:混合基质比单一基质移栽效果好，试管苗存活率
也较高。试验中腐殖土、黄沙、珍珠岩配比为4∶ 1∶ 1时试
管苗存活率最高，可达 90%，与其他基质相比差异显著
(p ＜0．05)。黄沙的透气性、腐殖土的营养，以及珍珠岩
的保温作用大大提高了移栽存活率，改善试管苗根的生
长环境。黄沙与珍珠岩配比为 1∶ 1时以及纯腐殖土条
件下移栽效果不好，试管苗存活率明显低于其他基质组
栽培效果(p ＜0．05)(表6)。
表 6 不同基质及其配比对试管苗移栽成活率的影响
Table 6 Effects of different medium and medium
concentrations on bud transplanting
基质
matrix
配比
ratio
移栽数
transplant
number
成活数
survival
number
成活率 /%
survival rate
腐殖土 +黄沙 +珍珠岩 1∶ 1∶ 1 30 20b 66． 67b
腐殖土 +黄沙 +珍珠岩 4∶ 1∶ 1 30 27a 90． 00a
黄沙 +珍珠岩 1∶ 1 30 10c 33． 33c
纯腐殖土 30 9c 30． 00c
3 讨 论
大叶常绿杜鹃是杜鹃花属中观赏价值最高的
类群，但是由于其抗逆性较差，在我国几乎没有露
地推广栽培的品种。培育适应性良好的大叶常绿
杜鹃花品种并在城市绿地中推广应用是我国园艺
专家多年的夙愿。分子育种是现代杜鹃花育种的
重要技术之一，采用基因工程手段，转入耐盐或耐热
基因，提高抗逆能力，是其推广的前提。在基因工程
育种过程中，良好受体的建立是遗传转化的关键，通
过叶盘法、愈伤组织再分化建立的受体系统，易接受
外源基因，转化率较高。因此建立大叶常绿杜鹃花
的叶片再生体系是利用基因工程育种的基础。
该研究选择的试验材料观赏价值高，综合性状
表现良好，是大叶常绿杜鹃品种培育的优良母本材
料。根据试验结果:以杂交品种 Ｒhododendron
‘Scintillation’幼嫩叶片为外植体，即可直接诱导成
苗，也可以通过愈伤组织途径成苗。MS 培养基为
基本培养基，添加 ZT(1． 0 mg /L)+ NAA(0． 1
mg /L)，暗培养 5 d，叶片可直接诱导再生不定芽;
培养基 MS +2，4 － D(2． 0 mg /L)+ KT(0． 2 mg /L)
诱导愈伤组织效果较好，增殖培养基与初代诱导不
同，最佳培养基为 MS + ZT(0． 5 mg /L)+ IBA(0． 1
mg /L);诱导成苗时，添加的激素浓度大大降低，最
佳培养基为 MS + ZT(0． 04 mg /L)+ NAA(0． 01
mg /L)，分化率最高可达 70%。生根培养基为 MS
+ NAA(0． 2 mg /L)+ IBA(0． 4 mg /L)时，生根率达
到 90%，平均生根数为 6． 0 条。腐殖土、黄沙、珍
珠岩配比为 4 ∶ 1 ∶ 1的混合基质较适合常绿杜鹃试
管苗的炼苗移栽，存活率可达 90%。
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(责任编辑 郑琰燚)
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