全 文 ：张晓东，李彩霞，王连春，等． 滇龙胆乙酰 CoA转移酶基因的克隆与表达分析［J］． 江苏农业科学，2016，44(6):94 － 98．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 06． 023
滇龙胆乙酰 CoA转移酶基因的克隆与表达分析
张晓东1，李彩霞1，王连春1，王元忠2
(1． 玉溪师范学院资源环境学院，云南玉溪 653100;2．云南省农业科学院药用植物研究所，云南昆明 650223)
摘要:根据滇龙胆转录组乙酰 CoA酰基转移酶基因 GrAACT序列设计引物，使用逆转录 PCＲ(ＲT － PCＲ)技术从滇
龙胆幼叶扩增该基因，并进行序列分析、原核表达和组织特异性分析。结果表明:GrAACT 基因(登录号 KJ917163)开
放阅读框长 1 215 bp，编码 404 个氨基酸;GrAACT蛋白相对分子质量 41． 41 ku，pI值为 6． 25，属于 AACT蛋白家族成
员，无信号肽，为疏水稳定蛋白，主要由 α －螺旋、无规则卷曲构成;GrAACT 蛋白具有 AACT 蛋白保守结构域:硫解酶
N端结构域(第 12 ～ 272 位氨基酸)、硫解酶 C端结构域(第 282 ～ 402 位氨基酸)、类硫解酶结构域(第 13 ～ 403 位氨基
酸);在硫解酶 C端结构域中，包含硫解酶保守位点(第 350 ～ 366 位氨基酸)、硫解酶活性位点(第 385 ～ 398 位氨基
酸);滇龙胆 GrAACT蛋白与长春花 CrAACT蛋白亲缘关系最近;GrAACT基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子
质量约为 67. 41 ku;组织特异性表达分析结果表明，GrAACT基因主要在茎、根中表达。
关键词:滇龙胆;乙酰 CoA酰基转移酶;基因克隆;生物信息学分析;表达分析
中图分类号:S184;Ｒ282． 71;Q785 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)06 － 0094 － 05
收稿日期:2015 － 05 － 27
基金项目:国家自然科学基金(编号:81260608);国家科技支撑计划
(编号:2011BAI13B02 － 04);云南省教育厅科学研究基金重点项
目(编号:2015Z171)。
作者简介:张晓东(1980—)，男，河南新郑人，博士，副教授，从事植物
代谢基因工程研究。E － mail:zxd95@ 126． com。
通信作者:王元忠，硕士，助理研究员，从事药用植物资源评价与利用
的研究。E － mail:boletus@ 126． com。
滇龙胆是传统中药龙胆的来源植物之一，也是云南省重
要道地药材，主要分布于中国西南部，尤其是云南省山区地
带;其根入药，用于治疗各种炎症、肝炎、风湿病和胆囊炎
等［1］。目前，医用龙胆需求量每年递增约 10%，而现有滇龙
胆产量低、品质不高，且野生滇龙胆资源遭到人为大肆采
挖［2］。为选育优质、高产、高抗新品种，2013 年 6 月云南省已
启动龙胆草航天育种工程［3］。从中医药现代化角度来看，滇
龙胆主要药效成分为龙胆苦苷，要从根本上解决龙胆草药源
问题并保护野生滇龙胆，除筛选新品种之外，还必须弄清龙胆
苦苷的生物合成途径及其调控机理，为通过基因工程手段生
产龙胆苦苷奠定基础。
龙胆苦苷为裂环烯醚萜类化合物，在植物中主要通过质
体 2 － C －甲基 － D －赤藓糖醇 － 4 －磷酸(MEP)、胞质甲羟
戊酸(MVA)途径合成［4］。乙酰 CoA 酰基转移酶(又称乙酰
乙酰 CoA硫解酶，AACT，EC 2． 3． 1． 9)是 MVA 途径中的第 1
个限速酶，能够催化 2 分子乙酰 CoA 形成 1 分子乙酰乙酰
CoA［5］。目前，乙酰 CoA 酰基转移酶基因 AACT 已从拟南
芥［5］、丹参［6］、胡萝卜［7］、白木香［8］、油茶［9］等许多植物中分
离。AACT基因表达具有组织特异性，并被生物、非生物因素
诱导。拟南芥中存在 2 个平行进化的同源基因，其中 AtA-
ACT1 主要在维管系统中表达，AtAACT2 则在根尖、幼叶、茎上
部和花药中大量表达，二者存在功能冗余;AtAACT2 的作用是
为胞质定位、MVA起源的异戊烯萜类生物合成途径合成大量
乙酰乙酰 CoA 前体［5］。在生物诱导剂(100 mg /mL酵母提取
物)、非生物诱导剂(30 mmol /L Ag + )共同诱导下，丹参
SmAACT基因在诱导后 12 h的表达量达到最高值［10］。
目前，由于龙胆基因组资源极度匮乏［11］，导致龙胆苦苷
生物合成途径并不清楚［3］。本研究根据笔者实验室滇龙胆
转录组数据库中的 GrAACT基因序列，设计特异性引物，通过
逆转录 PCＲ(ＲT － PCＲ)技术成功从滇龙胆幼叶中扩增到
GrAACT基因，并进行序列分析、原核表达和组织表达特异性
分析，以期为阐明滇龙胆龙胆苦苷生物合成途径及其调控机
理奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
滇龙胆组培苗、盆栽苗均采自玉溪师范学院分子生物学
实验室，经云南省农业科学院药用植物研究所金航研究员鉴
定为滇龙胆(Gentiana rigescens Franch． ex Hemsl)。基因克隆
所用材料为滇龙胆无菌苗幼叶，基因组织特异性表达分析所
用材料为盆栽 3 年生滇龙胆的根、茎、叶，采样日期为 2014 年
5 月 17 日。
1． 2 方法
按照多糖植物组织提取试剂 ＲNAiso(TaKaＲa，大连)说
明书提取滇龙胆幼叶总 ＲNA;按照逆转录试剂盒(TaKaＲa，大
连)说明书合成 cDNA。根据原核表达载体 pGEX － 4T － 1 多
克隆酶切位点和笔者所在实验室前期测序的滇龙胆转录组
GrAACT基因序列，设计 1 对特异引物 GrAACT BamHⅠ － F、
GrAACT XhoⅠ － Ｒ(表 1)。以 cDNA 为模板进行 PCＲ 扩增，
反应体系为:0． 5 μL TransTaq Taq DNA Polymerase High Fidel-
ity(2． 5 U /μL，北京全式金生物技术有限公司)，5 μL 10 ×
TransTaq HiFi Buffer Ⅱ，4 μL dNTP(2． 5 mmol /L，TaKaＲa，大
连) ，2 μL模板，各 1 μL正反向引物(10 μmol /L)，加 dd H2O
补足至 50 μL。PCＲ 反应条件为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，
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55． 5 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，30 个循环;72 ℃ 10 min。PCＲ 产物
经 1． 0%琼脂糖凝胶电泳分离，然后割胶，使用胶回收试剂盒
(Qiagen，德国)对目的片段进行回收，将其连接到 pMD19 － T
载体(TaKaＲa，大连)。转化大肠杆菌 DH5α(TaKaＲa，大连)
后进行蓝白斑筛选，挑取 12 个白斑摇菌;使用试剂盒提取质
粒(北京百泰克生物技术有限公司)，经酶切检测正确后进行
测序［生工生物工程(上海)股份有限公司］，获得重组质粒
pMD19 － GrAACT。
1． 2． 1 GrAACT 基因的生物信息学分析 用 NCBI 网站的
BLAST程序进行序列比对，用 Genetyx 6． 1． 8 进行翻译，用
DNAMAN 7 进行多序列比对，用 Clustal X2． 1 进行比对，然后
用 MEGA 6． 0 软件内置的 NJ 法构建系统进化树，设置 Boot-
strap = 1 000;利用在线数据库(http:/ /molbiol． edu． ru /eng /
scripts /01_11． html)进行稀有密码子分析。用 ChloroP服务器
v1． 1 进行叶绿体转运肽预测;用 Interpro 软件进行保守结构
域预测;用 ProtScalee 软件进行疏水性分析;用 PredictProtein
对二级结构进行预测;用 Phyre2(http:/ /www． sbg． bio． ic． ac．
uk /phyre2 /html /page． cgi?id = index)对三级结构进行预测;
用 Expasy中的 TMHMM工具预测蛋白的跨膜螺旋区;用在线
工具 WOLF PSOＲT预测蛋白的亚细胞定位情况。
1． 2． 2 GrAACT基因的荧光实时定量分析 分别取 3 年生滇
龙胆的根、茎、叶，提取总 ＲNA，用 DNase I 处理除去基因组
DNA。用反转录试剂盒(TaKaＲa)合成第 1 链 cDNA。以转录
组中 GrGAPDH 基因(GenBank 登录号 KM061807)作为内参
设计特异性引物(表 1)，PCＲ 条件:95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，
60 ℃ 31 s。根据 GrAACT基因开放阅读柜(OＲF)序列设计特
异性引物(表 1)，使用 SuperＲeal PreMix Plus 试剂盒［天根生
化科技(北京)有限公司］进行 qPCＲ，扩增条件为:95 ℃
3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s;每个反应重复 3 次。反应在
ABI7000 荧光定量 PCＲ 仪(Applied Biosystems)上进行扩增，
扩增曲线、溶解曲线、标准曲线由定量 PCＲ 仪软件自动生成。
使用内参基因 GrGAPDH 表达校准后，计算根、茎、叶中
GrAACT基因的相对表达量。采用比较 CT 值的“2
－ ΔΔCT”的方
法进行定量数据的分析处理。
表 1 GrAACT基因克隆和荧光定量分析的引物序列
基因 引物名称
引物序列
(5→3)
退火温度 Tm
(℃)
GrAACT基因克隆 GrAACTBam HI － F GGATCCATGGCTCCAGCAACAGC 55． 5
GrAACTXho I － Ｒ CTCGAGTTACAGAAGCTCTACAACAAGGG 55． 5
GrAACT基因 qPCＲ GrAACT － F CAGTTGAAGTGCCTGGTGGAA 60． 0
GrAACT － Ｒ ACCGCTGACCAAGACTAAAGC 60． 0
GAPDH内参基因 GrGAPDH － F AAGGGAGGTGCGAAGAAAGT 60． 0
GrGAPDH － Ｒ AAGGAGCAAGACAGTTGGTTGT 60． 0
2 结果与分析
2． 1 滇龙胆 GrAACT基因的克隆
以滇龙胆幼叶 cDNA为模板，使用表 1 中的基因特异性
引物 GrAACTBamHI － F、GrAACTBamHI － Ｒ 扩 增 出 约
1 200 bp 的片段，详见图 1。通过 TA 克隆获得重组质粒
pMD19 － GrAACT 。
2． 2 GrAACT基因的生物信息学分析
2． 2． 1 GrAACT基因的 OＲF 分析和多序列比对分析 利用
Genetyx软件对 GrAACT 基因的 OＲF 序列进行分析，结果显
示:该基因(GenBank 登录号 KJ91716)长 1 215 bp，编码 404
个氨基酸。利用 GenBank 数据库的 BLASTp 程序对 GrAACT
蛋白进行比对分析，结果表明:滇龙胆 GrAACT蛋白与长春花
CrAACT蛋白的序列相似性最高(88． 61%)，与单子叶植物玉
米 ZmAACT蛋白的相似性(78． 55%)稍低。利用 DNAMAN 7
将 GrAACT蛋白序列与 NCBI中相似性较高的部分序列进行
多序列比对分析，结果表明:GrAACT蛋白与已知蛋白序列相
比保守性较高(图 2)。利用 Mega 6． 0 将 GrAACT 氨基酸序
列与 NCBI中相似性较高的部分序列进行系统发育分析，结
果显示:滇龙胆 GrAACT 蛋白与长春花 CrAACT 蛋白处于同
一进化支(图 3)，表明二者亲缘关系较近。
2． 2． 2 GrAACT 蛋白的理化特性分析 使用 ExPASy Prot-
Param tool对 GrAACT蛋白进行分析，结果表明:GrAACT蛋白
单体相对分子质量为 41 410 u，pI 值为 6． 25，这与丹参
SmAACT蛋白［6］、油茶 CoAACT 蛋白［9］、拟南芥 ATAACT2 蛋
白［5］类似;带正电氨基酸残基(Arg + Lys)数为 36 个，带负电
氨基酸残基(Asp + Glu)数为 38 个，化学式为:C1812 H2959 N509
O562 S17;不稳定指数为 27． 92，属稳定蛋白;脂肪指数为
98. 56，总平均疏水性(GＲAVY)为 0． 178，为疏水蛋白(图 4)。
GrAACT蛋白含 20 种基本氨基酸，其中丙氨酸含量最高，为
13． 9%;其次是甘氨酸、缬氨酸，含量分别为 11． 9%、9． 9%;
色氨酸含量最低，为 0． 5%。
2． 2． 3 GrAACT 蛋白的二级结构、三级结构分析 利用
SSpro方法对 GrAACT蛋白进行二级结构分析，结果表明:该
蛋白二级结构中 α －螺旋(H)占 39． 11%，无规则卷曲(C)占
40． 10%，延伸带(E)占 20． 79%。利用 Swiss － Model Work-
space的自动模式预测 GrAACT蛋白的三级结构，结果见图 5，
该模型以人线粒体乙酰 CoA酰基转移酶［2f2s． 1． C］为模板，
在第 13—404 位氨基酸处建模，序列相似度为 52． 73%。
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2． 2． 4 GrAACT蛋白保守结构域分析 使用 InterPro 在线工
具对 GrAACT蛋白的保守结构域进行分析，结果表明:GrAACT
蛋白包含 3 个保守结构域，它们分别为硫解酶 N 端结构域
(IPＲ020616，第 12—272 位氨基酸)、硫解酶 C 端结构域
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(IPＲ020617，第 282—402 位氨基酸)、类硫解酶结构域
(IPＲ016039，第 13—403 位氨基酸)(图 6)。在硫解酶 C端结
构域中，包含硫解酶保守位点(THIOLASE_2，第 350—366 位
氨基酸)、硫解酶活性位点(THIOLASE_3，第 385—398 位氨
基酸)。
2． 2． 5 GrAACT蛋白信号肽分析 利用 ExPASy SignalP 4． 1
服务器分析 GrAACT蛋白，未发现信号肽，表明该蛋白为非分
泌型蛋白。利用 TMHMM工具预测 GrAACT蛋白的跨膜螺旋
区，结果表明:GrAACT蛋白不含有跨膜区域(图 7)。
2． 2． 6 GrAACT 蛋白亚细胞定位分析 使用 WoLF PSOＲT
软件进行亚细胞定位分析，结果表明，GrAACT 蛋白在细胞
质、叶绿体、过氧化物酶体的定位系数分别为 6． 0、4． 0、3． 0。
2． 2． 7 GrAACT 基因稀有密码子分析 使用在线软件对
GrAACT基因进行稀有密码子分析，结果表明:GrAACT基因中
稀有密码子占 1． 48%，且无二联或三联稀有密码子连续出现
的情况，因此可选用大肠杆菌表达菌 BL21 或 Ｒosetta(DE3)
进行原核表达。
2． 3 GrAACT基因原核表达载体的构建
使用酶切检测重组质粒 pGEX － 4T － 1 － GrAACT，结果表
明:BamHⅠ、XhoⅠ双酶切可切出目的基因和载体，且二者长
度之和等于 XhoⅠ单酶切产物长度(图 8)，表明 GrAACT基因
已成功插入载体 pGEX －4T － 1。
2． 4 GrAACT基因的原核表达
将重组质粒 pGEX － 4T － 1 － GrAACT 转化大肠杆菌
Ｒosetta(DE3)后，在 37 ℃、1 mmol /L IPTG(终浓度)下，分别
诱导表达 0、2、4、6 h后，提取细菌总蛋白进行 SDS － PAGE分
析。结果表明:与对照(第 1 ～ 3 泳道)相比，pGEX － 4T － 1 －
GrAACT转化菌经 IPTG诱导后，在相对分子质量 67 410 u(含
GST蛋白 26 000 u)左右有 1 条蛋白条带，并且随诱导时间增
加，其蛋白含量逐渐升高(图 9)，表明重组质粒 pGEX － 4T －
1 － GrAACT 在大肠杆菌 Ｒosetta(DE3)中成功诱导表达了
GrAACT蛋白。当温度为 37 ℃、诱导时间为 6 h时，蛋白表达
量最大(图 9)，细胞破碎后可直接用于蛋白纯化。
2． 5 GrAACT基因的组织表达分析
取 3年生滇龙胆的根、茎、叶，提取总 ＲNA，反转录成 cDNA
后，通过实时荧光定量 ＲT － PCＲ 分析 GrAACT基因在根、茎、叶
中的表达情况。图 10 结果表明:GrAACT 基因在茎中表达量最
高，分别约为叶、根的 13． 17、1． 36倍，表达量最低的是叶。
3 讨论
滇龙胆药效成分龙胆苦苷是通过 MVA、MEP 途径合成
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的，在前期笔者已经克隆了 MEP 途径关键酶 1 －脱氧 － D －
木酮糖 － 5 －磷酸还原异构酶基因 GrDXＲ［12］。为阐明龙胆苦
苷生物合成途径及其调控机理，本研究克隆了 MVA 途径中
的 GrAACT基因。AACT 是 MVA 途径的第 1 个催化酶，因此
滇龙胆中 GrAACT基因的表达情况可以直接或间接影响龙胆
苦苷的生物合成。研究表明，植物中如丹参［6］、白木香［8］、油
茶［9］AACT蛋白均包含硫解酶 N 端结构域、C 端结构域和保
守位点。本研究从滇龙胆幼叶中克隆获得 GrAACT 基因，其
编码蛋白序列比对分析结果表明，GrAACT 蛋白属于 AACT
家族蛋白，具有硫解酶 N端、C端结构域，并且在其 C 端具有
保守位点:NVHGGAVALGHPLGCSG(第 350—366 位氨基
酸)。这些结果表明，所克隆基因的确为滇龙胆乙酰 CoA 酰
基转移酶基因。
根据底物链长特异性，硫解酶被分为 2 类:第 I 类是降解
型硫解酶(EC 2． 3． 1． 16)，定位于线粒体、过氧化物酶体，在
脂肪酸氧化中催化 3 －酮脂酰 CoA 断裂产生乙酰乙酰 CoA、
缩短的酰基 CoA;第Ⅱ类是合成型硫解酶(EC 2． 3． 1． 9)，定
位于细胞质，能够催化 2 分子乙酰 CoA 形成 1 分子乙酰乙酰
CoA［13］。生物信息学分析结果表明，GrAACT 蛋白定位于细
胞质，属于Ⅱ型硫解酶，参与胞质中的 MVA 途径。在植物
中，AACT蛋白的定位还存在争议。在拟南芥中，参与 MVA
生物合成途径的 AtAACT2 蛋白定位于细胞质［14］;而对拟南
芥过氧化物酶体蛋白质组研究结果表明，该蛋白也存在于过
氧化物酶体［15］。在向日葵(Helianthus annuus)乙醛酸循环体
中，HaAACT能够催化朝向乙酰乙酰 CoA 方向的反应［16］，说
明过氧化物酶体中也存在 AACT。GrAACT 蛋白三维模型预
测结果表明，该蛋白的活性形式为四聚体。在本研究中，
GrAACT单体相对分子质量为 41 410 u，其活性形式可能是单
体，也可能是四聚体，这需要通过非变性 SDS － PAGE 进行进
一步检测。
在拟南芥中，参与 MVA 途径的 AtAACT2 基因在根尖、幼
叶、茎上部和花药中大量表达［5］。组织表达特异性检测结果
表明，GrAACT基因在根中的表达量较高，因此推测:滇龙胆根
部为龙胆苦苷生物合成的主要器官。滇龙胆用药部分为根，
因为与叶、茎相比，根中龙胆苦苷含量最高［17 － 18］，这也为上述
假说提供了证据。在拟南芥中，参与MVA途径的 AtAACT2 基
因是多效基因。首先，AtAACT2 对于胚胎形成和正常的雄性
配子传递是必需的，AtAACT2 突变体不能存活;其次，AtAACT2
基因的 ＲNAi株系表现出多效的表型，包括减弱的顶端优势、
延长的生活周期和开花时间、雄性不育、矮化、种子产量降低、
根长变短和植物甾醇类质和量的改变等;再次，当外源添加甲
羟戊酸后，AtAACT2 基因的 ＲNAi株系以上的表型和生化改变
都可逆转［5］。本研究中的 GrAACT 蛋白与 AtAACT2 蛋白相
似性高达 83． 87%，GrAACT 基因是否也为多效基因，需要进
一步试验验证。
本研究为滇龙胆的分子生物学研究提供基因资源，并为
GrAACT基因功能的解析奠定基础。下一步将对 GrAACT 蛋
白进行纯化和酶活分析，通过互补试验或过表达研究 GrAACT
基因的功能，从而为龙胆苦苷生物合成途径的阐明奠定基础。
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