全 文 ：中国药房 2009年第 20卷第 15期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.15 · 1151·
·中药分析与鉴定·
RP -HPLC 法测定竹节参药材中齐墩果酸的含量 Δ
袁 丁 1 , 2* ,何毓敏 2 ,鲁科明 2 ,张长城 2 ,刘焱文 1(1.湖北中医学院中药资源与中药化学湖北省重点实验室 ,武
汉市 430061;2.三峡大学医学院 ,宜昌市 443002)
中图分类号 R284.1;R927.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)15-1151-03
摘 要 目的:建立以反相高效液相色谱法测定竹节参药材中齐墩果酸含量的方法。方法:色谱柱为 YM C-pack ODS-AQ(250
mm×4.6 mm ,5μm),流动相为甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90∶10∶0.04∶0.02),检测波长为 210 nm 。结果:齐墩果酸进样量在
4.72 ～ 23.60 μg 范围内与峰面积积分值呈良好线性关系(r =0.999 9);平均回收率为 99.87%, RSD =1.84%(n=6)。结论:本
法快速 、准确 、灵敏度高 、重现性好 ,可用于竹节参药材的质量控制 。
关键词 竹节参;齐墩果酸;反相高效液相色谱法;含量测定
Determination of Oleanolic Acid in Panax japonicus by RP-HPLC
YUAN Ding , LIU Yan_wen(Key Lab.o f N atural Resources and Chemistry of Chinese M edicinal M aterials of
Hubei College of Tradi tional C hinese M edicine , Wuhan 430061 , China)
YUAN Ding ,HE Yu_min , LU Ke_ming ,ZHANG Chang_cheng(Medical College o f Th ree Gorges University ,
Yichang 443002 , China)
ABSTRACT OBJECTIVE:T o establish a RP-HPLC method for the dete rmination of oleanolic acid(OA)in Pana x japon_
icus.M ETHODS :The chromatog raphic separation w as perfo rmed on YM C-pack ODS-AQ (250 mm×4.6 mm , 5μm).The
m obile phase w as a mix ture o f methanol-w ate r -g lacial acetic acid - trie thy lamine(90∶10∶0.04∶0.02)w ith detection
w aveleng th set a t 210 nm.RESU LTS:The linear range of OA w as 4.72 ～ 23.60μg(r =0.999 9)w ith it s average recovery at
99.87%(RSD =1.84%, n =6).CONCLUS ION :The established method w as p roved to be rapid , accurate , sensitive , repro-
ducible and applicable fo r t he quality con tro l of Panax japonicus.
KEY WORDS Pana x japonicus;Oleanolic acid;RP -HPLC ;Content determination
Δ湖北省自然科学基金资助项目(2006ABA 204);湖北省科技攻
关计划项目(2005AA301C06)
*副教授 ,博士 ,硕士研究生导师。研究方向:天然药物分子药理 ,
天然药物活性成分筛选、提取、成分分析及开发。电话:0717-6392254
表 3 方差分析结果
Tab 3 Results of analysis of var iance
指标 方差来源 离差平方和 自由度 均方 F P
干浸膏收率 A 4.108 7 2 2.054 3 5.385 2 >0.05
B 0.762 9 2 0.381 5
C 5.273 7 2 2.636 8 6.912 2 >0.05
D 101.659 3 2 50.829 6 133.244 1 <0.01
总变异 111.804 6 8
和厚朴酚含量A 0.77×10-3 2 0.385×10-3 15.98 >0.05
B 2.16×10-4 2 0.108×10-3 4.48 >0.05
C 1.28×10-3 2 0.640×10-3 26.56 <0.05
D 4.82×10-5 2 2.410×10-3
总变异 0.252 8
厚朴酚含量 A 0.686×10-3 2 0.343×10-3 18.05 >0.05
B 0.206×10-3 2 0.103×10-3 5.42 >0.05
C 1.184×10-3 2 0.059×10-3 31.05 <0.05
D 0.038×10-3 2 0.019×10-3
总变异 2.114×10-3 8
注:F 0.0 1(2 , 2)=99.00;F0.0 5(2, 2)=19.00
note:F0.01(2 , 2)=99.00;F 0.0 5(2 , 2)=19.00
100 mL -1 , 表明按最佳提取工艺制得的健脾化食口服液 , 其干
浸膏收率和和厚朴酚 、厚朴酚的含量基本稳定 , 最佳提取工艺
基本可行 。
3 讨论
本制剂组方中的君药为厚朴和焦白术 , 因白术的含量测定
方法尚不成熟 , 而厚朴的有效成分和厚朴酚、厚朴酚的含量测
定方法已较为成熟 , 且干浸膏的收率对成品的质量和产量也有
较大影响 ,故以干浸膏收率、和厚朴酚含量 、厚朴酚含量为优选
工艺的指标 。
和厚朴酚 、厚朴酚属于联苯类木脂类化合物 ,偏脂性 ,能溶
于三氯甲烷 、乙醇 、甲醇等溶剂 [4 ] ,在含量测定时采用甲醇超声
提取 ,可将绝大部分的和厚朴酚及厚朴酚提取出来 。
参考文献
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(收稿日期:2008-11-15 修回日期:2009-02-15)
· 1152· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.15 中国药房 2009年第 20卷第 15期
表 1 不同水解条件对齐墩果酸含量的影响
Tab 1 Effects of d ifferent hydrolytic conditions on OA
content f in Rhizoma Panac is Japonici
水解条件 项目内容 齐墩果酸峰面积 最佳水解条件
水解酸种类 15%盐酸 4 739 952 -
25%盐酸 6 998 028 25%盐酸浓盐酸 6 361 218 -
5%硫酸 89 982 -
10%硫酸 249 739 -
20%硫酸 589 376 -
水解时间 0.5 h 6 205 902 -
1.0 h 6 323 428 1.0 h
1.5 h 6 333 646 -
2.0 h 6 314 820 -
竹节参系五加科植物竹节参 Panax japonicus C.A.Mey.
的干燥呈竹鞭状根茎 ,具有滋补强壮 、散瘀止痛的功效 ,临床常
用于病后虚弱 、劳嗽咯血等证的治疗 [1 ]。现代药理研究表明 ,皂
苷类成分是竹节参的主要活性成分 , 具有抗炎 、抗氧化 、降血糖
等药理作用 [2 , 3 ]。对竹节参的生药学和化学成分研究表明 , 皂苷
类成分主要是以齐墩果酸苷元组成的三萜皂苷 [2 ,3 ]。齐墩果酸具
有抗炎 、保肝、降糖 、抗 H IV 以及抗肿瘤等多种生物学活性 [4 ] 。
本试验中 ,笔者采用反相高效液相色谱(RP -HPLC)法测定了
湖北五峰 、恩施地区以及四川峨嵋地区 5批竹节参中齐墩果酸
的含量 ,为竹节参药材的品质评价及质量控制提供了依据 。
1 仪器与试药
2690型 HPLC 仪及柱温箱 、 Millennium32色谱工作站 、
996型二极管阵列检测器 (美国Waters公司);KQ -250B型
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);AB204-N 型电子
天平(瑞士Mettler Toledo公司)。甲醇为色谱纯 ,其余试剂均
为分析纯 ,水为重蒸馏水;齐墩果酸对照品(中国药品生物制品
检定所 ,批号:110709-200304);竹节参药材从湖北五峰 、恩施
地区以及四川峨嵋地区采集 , 由湖北宜昌市药品检验所中药室
鉴定为竹节参 Pana x japonicus C.A.Mey.的干燥根茎 ,药材
阴干后拣除泥沙 ,打粉过筛 ,备用。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:YMC -pack ODS-AQ(250 mm×4.6 mm , 5
μm);流动相:甲醇-水-冰醋酸-三乙胺 (90∶10∶0.04∶
0.02);检测波长:210 nm;流速:1.0 mL · min -1;柱温:30
℃。理论塔板数按齐墩果酸峰计算应不低于 4 000。
2.2 供试品溶液的制备
取竹节参药材粉末(过 4号筛)1.0 g ,精密称定 ,置于具塞
锥形瓶中 ,精密加入甲醇 50mL ,称定质量 ,超声处理(功率 250
W , 频率 50 kH z)40 min , 再称定质量 , 用甲醇补足减失的质
量 ,摇匀 ,滤过;精密量取续滤液 10 mL ,回收溶剂至干 ,残渣加
25%盐酸 20 mL 、三氯甲烷 25 mL , 加热水解 1.0 h , 水解物用
三氯甲烷振摇提取 2次 ,每次 25 mL ,合并提取液 ,回收溶剂至
干 , 残渣加甲醇溶解并转移至 10 mL量瓶中 , 加甲醇至刻度 ,
摇匀 ,滤过 ,取续滤液 ,即得 。
2.3 水解条件的确定
在制备供试品溶液的过程中 , 水解条件中的酸种类 、酸浓
度以及水解时间可直接影响齐墩果酸含量 , 故本试验采用单因
素试验法对其进行考察:取竹节参药材粉末(过 4号筛)适量 ,
称定后按“2.2”项下方法操作 ,至水解时 ,分别独立考察6种酸
种类(15%盐酸 、25%盐酸 、浓盐酸、5%硫酸 、10%硫酸 、20%硫
酸)和 4个时间水平(0.5 、1.0 、1.5 、2.0 h),通过比较峰面积积
分值 , 得到最佳水解条件 。不同水解条件对齐墩果酸含量的影
响见表 1。
2.4 样品的定性分析
将竹节参皂苷提取液经彻底水解后进行 HPLC分析 , 在
相同色谱条件下进样对照品 , 以保留时间和紫外吸收光谱对色
谱峰进行归属 , 确定水解样品中主要含有齐墩果酸 (峰 1);将
水解前 、后的竹节参供试品溶液进行 HPLC 对比分析 , 发现未
水解的供试品溶液中几乎不见齐墩果酸的色谱峰 , 表明竹节参
样品中游离型齐墩果酸含量很少。色谱见图 1。
2.5 方法学考察
2.5.1 标准曲线的绘制:精密称取齐墩果酸对照品适量 , 置
于 10 mL 量瓶中 , 以甲醇制成每 1 mL含 1.18 mg 的对照品溶
液 。在“2.1”项下色谱条件下 ,分别精密吸取该对照品溶液 4 、6 、
8 、10 、15 、20μL进行测定。以峰面积积分值(Y)对进样量(X)进行线性回归 , 得回归方程为 Y =444 293.609X +17 052.413
(r =0.999 9)。结果表明 ,齐墩果酸进样量在 4.72 ～ 23.60μg
范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系 。
2.5.2 精密度试验:取“2.5.1”项下齐墩果酸对照品溶液 ,精
密吸取 10μL ,在“2.1”项下色谱条件下重复进样 6次 ,测定 。结果 , RSD =0.77%,表明仪器精密度良好 。
2.5.3 重现性试验:取采自湖北恩施的竹节参药材 (批号:
05051501)粉末(过 4号筛)1.0 g ,精密称定 ,按“2.2”项下方法
平行制备 6份供试品溶液 ,在“2.1”项下色谱条件下 ,分别进样
10μL进行测定 。结果 , 齐墩果酸的平均含量为 64.31 mg ·
g
-1 , RSD =1.43%,表明方法重现性良好 。
2.5.4 稳定性试验:任意取上述供试品溶液 , 常规保存。在
“2.1”项下色谱条件下 ,分别于放置 0 、2 、4 、6 、8 h后进样 10μL
进行测定 。结果 , RSD =1.01%, 表明供试品溶液在 8 h内稳
定 。
2.5.5 加样回收率试验:取已知含量的竹节参药材 (批号:
05051501)粉末(过 4号筛)约 0.5 g ,共 6份 ,精密称定 ,置于具
塞锥形瓶中 ,分别加入齐墩果酸对照品适量 ,按“2.2”项下方法
制得供试品溶液 。分别取该溶液及对照品溶液各 10μL 进行测
定 ,计算加样回收率 ,结果见表 2。表 2 加样回收率试验结果(n=6)
Tab 2 Results of recovery test(n=6)
称样量/g 样品含量/g 加入量/ g 测得量/ g 回收率/% x/% RSD/ %
0.498 6 0.032 1 0.031 9 0.064 6 101.99
0.500 4 0.032 2 0.035 2 0.067 1 99.20
0.499 7 0.032 1 0.036 7 0.067 9 97.45 99.87 1.84
0.495 8 0.031 9 0.031 2 0.063 2 100.37
0.499 3 0.032 1 0.031 8 0.063 4 98.40
0.499 1 0.032 1 0.033 4 0.066 1 101.81
中国药房 2009年第 20卷第 15期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.15 · 1153·
青阳参分散片溶出度测定 Δ
李魏林 1 * ,何 军 2 ,何 1 ,钱一鑫 1(1.贵州大学贵州省生化工程中心 ,贵阳市 550025;2.贵州教育学院 ,
贵阳市 550003)
中图分类号 R283.64;R927.1 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)15-1153-03
摘 要 目的:建立青阳参分散片溶出度的测定方法 ,为其质量控制提供方法和参数 。方法:以水为溶出介质 ,转速为 100 r ·min -1 ,
以高效液相色谱法在 259 nm 波长处测定每片样品中青阳参苷元的溶出量 。结果:3批青阳参分散片的溶出度基本一致 , 45 min累
积百分溶出总量均能达到 90%以上 ,且重现性良好 。结论:青阳参分散片的质量能达到 2005年版《中国药典》要求 。
关键词 青阳参分散片;青阳参苷元;溶出度;高效液相色谱法
Determination of the Dissolution of Qingyangshen Dispersible Tablets
LI Wei_lin , HE Jun , QIAN Yi_x in(Guizhou Provincial Research Cente r of Bio chemistry Eng ineering ,
Guizhou University ,G uiyang 550025 ,China)
HE Jun(Guizhou Educat ion College , Guiyang 550003 ,China)
ABSTRACT OBJECT IVE:T o establish a method fo r the dete rmination o f the dissolution of Qingyangshen dispersible
table ts so as to prov ide met hod and parameters for quality contro l of this kind of table ts.M ETHODS:With water as dissolution
m edium in a ro ta ting speed of 100 r ·min -1 , the dissolution of Qingyangshen dispersible t ablets w as de te rmined by HPLC at a
w aveleng th of 259 nm.RESU LTS:Simila r dissolution ra tes w ere obt ained fo r 3 batches o f Qingyangshen dispersible t ablets ,
w ith accumula tive dissolution rates of all samples at 45 minutes reached above 90%, and a good reproducibility w as no ted.
CONCLUS ION :T he quality o f Qingyangshen dispersible table ts is up to the standard sta ted in Chinese Pharm acopoeia (2005
Edition).
KEY WORDS Qingyangshen dispersible table ts;Qingyangshengenin;Dissolution;HPLC
Δ贵州省教育厅自然科学研究项目(黔教科 2007065);贵州省科
技计划课题(黔科合高 G 字(2007)4007)
*硕士研究生。研究方向:药物化学 。E-mail:weilin li@ya-
hoo.cn
#通讯作者:讲师 ,硕士。研究方向:药物新制剂与新剂型。电话:
0851-8297499。E-mail:qianyixin@gmail.com
2.6 样品含量测定
对来源于多个产地不同批次的竹节参药材各取 3份 , 按
“2.2”项下方法制备供试品溶液 ,在“2.1”项下色谱条件下进行
测定 ,按外标法以峰面积计算齐墩果酸的含量 ,结果见表 3。
表 3 竹节参中齐墩果酸的含量测定结果(n=3)
Tab 3 Content of OA in Panax japonicus(n=3)
样品批号 产地 含量/mg· g -1 RSD /%
05051501 湖北恩施 64.36 1.38
05051502 湖北恩施 63.21 1.46
05051701 湖北五峰 65.26 2.07
05051702 湖北五峰 64.07 1.53
06041101 四川峨嵋 59.12 1.81
07022801 云南昭通 61.28 1.09
3 讨论
五加科人参属植物竹节参根茎中的主要有效成分是五环
三萜类皂苷 ,其已知的苷元主要有齐墩果酸 、20(s)-原人参二
醇和 20(s)-原人参三醇 [5 ]。本试验将竹节参皂苷提取液经彻
底水解后进行 HPLC 分析 , 发现不同产地的竹节参根茎中所
含皂苷元均以齐墩果酸为主;进一步将水解前、后的竹节参皂
苷提取液进行 HPLC 对比分析 , 发现竹节参中游离型齐墩果
酸很少 , 结合型齐墩果酸占总齐墩果酸的 99%以上 , 表明竹节
参中的齐墩果酸主要以皂苷的形式存在 。齐墩果酸具有与竹节
参一致的抗炎 、降糖 、抗肿瘤等药理活性 ,因此可以将齐墩果酸
作为竹节参药材质量评价的指标(即为指标性成分)。
目前 , 对齐墩果酸的含量测定多采用比色法 、薄层扫描
(T LCS)法和 HPLC 法。其中 ,HPLC 法以其操作快速 、准确性
高 、重现性好等特点 ,近年来在天然产物研究中应用较多[ 6 ]。本
试验对以 HPLC法测定竹节参中齐墩果酸含量的方法进行了
初步研究 , 选择氯仿-25%盐酸溶剂体系对竹节参皂苷提取液
进行水解后制备供试品溶液;选用甲醇-水-冰醋酸-三乙胺
作为流动相体系 , 既能使齐墩果酸峰形对称 , 又能使其与其它
组分达到基线分离 。方法学考察结果表明 ,本方法快速 、准确 、
灵敏度高 、重现性好 ,可用于竹节参药材的质量控制 。
参考文献
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(收稿日期:2008-06-10 修回日期:2008-08-27)