全 文 ：［生化与农业］
滇龙胆ＧｒＷＲＫＹ２基因的克隆与序列分析①
路 止 飞　张 晓 东　彭 东 燕　李 文 清　胡 文 书
（玉溪师范学院 资源环境学院，云南 玉溪６５３１００）
［关键词］滇龙胆；ＧｒＷＲＫＹ２基因；基因克隆；生物信息学分析
［摘　要］以滇龙胆转录组为基础，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从滇龙胆幼叶克隆ＧｒＷＲＫＹ２基因，并进
行生物信息学分析．从分析结果看，滇龙胆ＧｒＷＲＫＹ２基因全长３６３ｂｐ，编码１２０个氨基酸，相
对分子量为１３．２４ｋＤ，ｐＩ为８．２９，其蛋白属于 ＷＲＫＹ转录因子家族成员，可能定位于细胞核，
且蛋白无信号肽，为亲水稳定蛋白，主要由α－螺旋（２８．３３％）和无规则卷曲（５９．１７％）构成，具有
ＷＲＫＹ蛋白保守结构域．从亲缘关系看，蛋白与琴叶拟南芥ＡｌＷＲＫＹ１５和白菜ＢｒＷＲＫＹ５１亲
缘关系较近．
［作者简介］路止飞，研究方向：植物分子生物学．
张晓东，博士，研究方向：植物代谢基因工程．
［中图分类号］Ｏ６５７［文献标识码］Ａ［文章编号］１００９－９５０６（２０１５）０４－００３７－０５
滇龙胆（Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ）为云南道地药材，其主要药效成分为龙胆苦苷．滇龙胆是龙胆泻肝片、苦
胆草片等２００多种中药的主要成分［１］．近年来，龙胆市场需求量剧增，使野生滇龙胆野生资源遭到极大破
坏［１］．要解决龙胆的药源问题，必须弄清龙胆苦苷生物合成途径及其调控机理，这样才能为通过基因工程
生产龙胆苦苷奠定基础．
研究表明，ＷＲＫＹ转录因子能够调控萜类的生物合成．如，在棉花中，ＧａＷＲＫＹ１通过激活（＋）－δ－
杜松烯合成酶而促进棉子酚的生物合成［２］；在拟南芥中，ＡａＷＲＫＹ１通过激活紫穗槐－４，１１－二烯合成
酶的合成进而促进青蒿素的生物合成［３］；在番茄毛状体中，ＳｌＷＲＫＹ７３主要在根中表达，能够激活萜类合
成酶基因ＳｌＴＰＳ５的表达［４］；在西洋参中，ＰｑＷＲＫＹ１是三萜人参皂苷生物合成的正调控因子［５］．此外，最
新研究表明，拟南芥中３０％（２２／７２）的 ＷＲＫＹ转录因子都对茉莉酸甲酯处理产生响应，而在长春花中该
数字为２５％（１２／４８）［６］．此前，通过对滇龙胆的根和叶进行转录组测序分析，笔者发现ＧｒＷＲＫＹ２基因在
叶中强烈上调，因此该基因可能与龙胆苦苷生物合成途径的调控有关．
此外，从目前的研究情况看，国内外学者对龙胆的研究主要集中在种子萌发［７，８］、ＤＮＡ条码［９，１０］、转录
因子功能［１１，１２］、育种［１３］等方面，而尚未对滇龙胆ＧｒＷＲＫＹ２基因进行克隆和表达分析．因此，在本研究中，
笔者根据滇龙胆转录组中的ＧｒＷＲＫＹ２基因序列，设计一对特异性引物，通过ＲＴ－ＰＣＲ技术成功从滇龙
胆幼叶中扩增到该基因，并对其进行序列分析．
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玉溪师范学院学报（第３１卷）２０１５年第０４期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｙｕｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．０４Ａｐｒ．２０１５
① 基金项目：玉溪师范学院大学生创新项目，编号：２０１４Ｂ１８；云南省大学生创新项目，编号：２０１４１１３９０００１．
１　材料和方法
１．１　材　料
本实验所用材料为滇龙胆 （Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ），其植株栽培于玉溪师范学院分子生物学实验室．
ＲＮＡ提取所用材料为滇龙胆无菌苗幼叶．
１．２　方法
（１）叶片总ＲＮＡ提取及ＧｒＷＲＫＹ２基因ＯＲＦ的克隆．按照多糖植物组织提取试剂ＲＮＡｉｓｏ（Ｔａｋａｒａ，
宝生物工程（大连）有限公司）说明书提取滇龙胆幼叶总ＲＮＡ，按照逆转录试剂盒（Ｔａｋａｒａ，宝生物工程（大
连）有限公司）说明书合成ｃＤＮＡ．根据中间表达载体ｐＥＮＴＲ２Ｂ多克隆酶切位点和滇龙胆转录组中
ＧｒＷＲＫＹ２基因序列，设计一对特异引物 ＧｒＷＲＫＹ２　ＢａｍＨＩ－Ｆ：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＧＡＣＴＣＴＡ－
ＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡＣ（下 划 线 为 ＢａｍＨＩ 酶 切 位 点），ＧｒＷＲＫＹ２　ＸｈｏＩ－ Ｒ：ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＡＴＡＣ－
ＴＡＧＧＧＴＴＴＧＧＡＴＴ（下划线为ＸｈｏＩ酶切位点，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成）．以ｃＤＮＡ为
模板进行ＰＣＲ扩增，反应体系为ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　Ｐｒｅｍｉｘ（２×，Ｔａｋａｒａ，宝生物工程（大连）有限公司）２５
μｌ，ｃＤＮＡ模板２μｌ，正反向引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μｌ，加ｄｄＨ２Ｏ补足５０μｌ．ＰＣＲ反应条件为：９８℃变性
１０ｓ，５０℃退火１５ｓ，７２℃延伸５ｓ，３０循环；７２℃加Ａ尾３０ｍｉｎ．ＰＣＲ产物经１．０％琼脂糖凝胶电泳分
离，然后割胶，使用胶回收试剂盒（Ｑｉａｇｅｎ，德国）对目的片段进行回收，将其连接到ｐＭＤ１９－Ｔ载体（Ｔａｋａ－
ｒａ，宝生物工程（大连）有限公司）．转化大肠杆菌ＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ，宝生物工程（大连）有限公司）后进行蓝
白筛选，挑取白斑摇菌；使用试剂盒提取质粒（百泰克，北京），经酶切检测正确后进行测序（上海生工，上
海），获得重组质粒ｐＭＤ１９－ＧｒＷＲＫＹ２．
（２）ＧｒＷＲＫＹ２基因的生物信息学分析．参考张晓东等［１４］的方法对ＧｒＷＲＫＹ２基因进行生物信息学
分析，其中二级结构分析网址为：ｈｔｔｐ：／／ｓｃｒａｔｃｈ．ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．ｉｃｓ．ｕｃｉ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．
２　结果与分析
２．１　滇龙胆ＧｒＷＲＫＹ２基因序列的克隆
以滇龙胆幼叶ｃＤＮＡ为模板，使用特异性引物扩增出约４００ｂｐ的片段．通过ＴＡ 克隆获得重组质粒
ｐＭＤ１９－ＧｒＷＲＫＹ２，酶切检测结果表明双酶切获得的两片段大小之和等于单酶切片段大小，与预期相符．
２．２　ＧｒＷＲＫＹ２基因的生物信息学分析
利用Ｇｅｎｅｔｙｘ、ＤＮＡＭＡＮ软件对ＧｒＷＲＫＹ２基因ｃＤＮＡ序列进行分析，结果显示ＧｒＷＲＫＹ２基因
ＯＲＦ全长３６２ｂｐ，编码１２０个氨基酸．将该序列上传至ＧｅｎＢａｎｋ数据库，获得登录号ＫＭ２１５１３７．
利用ＤＮＡＭＡＮ　７软件将ＧｒＷＲＫＹ２蛋白氨基酸序列与ＮＣＢＩ中相似性较高的部分序列进行比对分
析，结果表明ＧｒＷＲＫＹ２蛋白与已知蛋白序列保守性较高（图１）．利用 ＭＥＧＡ６．０６将ＧｒＷＲＫＹ２氨基酸
序列与其他相似性较高的 ＷＲＫＹ序列进行系统发育分析，结果显示滇龙胆ＧｒＷＲＫＹ２蛋白与琴叶拟南
芥ＡｌＷＲＫＹ１５和白菜ＢｒＷＲＫＹ５１亲缘关系较近（图２）．
使用ＥｘＰＡＳｙ　ＰｒｏｔＰａｒａｍ　ｔｏｏｌ对ＧｒＷＲＫＹ２蛋白进行分析，结果表明：ＧｒＷＲＫＹ２蛋白单体相对分
子质量为１３．２４ｋＤ，ｐＩ为８．２９；带正电氨基酸残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为１３，带负电氨基酸残基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）为
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玉溪师范学院学报
１１，其分子式为Ｃ５６７Ｈ９０７Ｎ１６１Ｏ１８８Ｓ８，不稳定指数为３８．２０，属于稳定蛋白；脂肪指数为７１．５８，总平均疏水性
（ＧＲＡＶＹ）为－０．５１８，为亲水蛋白．分析结果表明还表明，ＧｒＷＲＫＹ２蛋白含有２０种基本氨基酸，其中丝
氨酸含量最高，为１４．２％，其次是天冬酰胺，为１２．５％，色氨酸含量最低，为０．８％．
说明：黑色－相似性等于１００％；深灰色－７５％相似性＜１００％；浅灰色－５０％相似性＜７５％
图１　ＧｒＷＲＫＹ２蛋白与其他植物 ＷＲＫＹ蛋白保守区的比对结果
图２　ＧｒＷＲＫＹ２蛋白与植物中其他 ＷＲＫＹ２蛋白的系统发育分析
利用Ｓｓｐｒｏ对 ＧｒＷＲＫＹ２蛋白进行二级结构分析，结果表明：该蛋白二级结构中α－螺旋（Ｈ）占
２８．３３％，无规则卷曲（Ｃ）占５９．１７％，延伸带（Ｅ）占１２．５０％．利用Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ　Ｗｏｒｋｓｐａｃｅ，使用自动模式
预测ＧｒＷＲＫＹ２蛋白的三级结构，结果如图３．该模型以拟南芥ＡｔＷＲＫＹ４［１ｗｊ２．１］为模板，在第８９～１２０
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路止飞　张晓东　彭东燕　李文清　胡文书：滇龙胆ＧｒＷＲＫＹ２基因的克隆与序列分析
图３　ＧｒＷＲＫＹ２蛋白的三维结构预测
氨基酸处建模，序列相似度为５３．１３％．使用ＩｎｔｅｒＰｒｏ
在线工具对ＧｒＷＲＫＹ２蛋白的保守结构域进行分析，
结果表明ＧｒＷＲＫＹ２蛋白包含ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ＷＲＫＹ
（ＩＰＲ００３６５７）保守结构域．
利用ＳｉｇｎａｌＰ　４．１服务器分析ＧｒＷＲＫＹ２蛋白，未
发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白．利用 ＴＭ－
ＨＭＭ工具预测ＧｒＷＲＫＹ２蛋白的跨膜螺旋区，结果
表明ＧｒＷＲＫＹ２蛋白不含跨膜螺旋区域，为非膜蛋白．
使用 ＷｏＬＦ　ＰＳＯＲＴ软件进行亚细胞定位分析，结果为
ＧｒＷＲＫＹ２蛋白的定位系数分别为：细胞核５．０，叶绿体３．０，细胞质３．０，分泌途径２．０．
３　讨　论
ＷＲＫＹ蛋白家族的作用比较广泛，主要参与生物胁迫、非生物胁迫、种子发育、种子休眠与萌发、衰老
等过程［１５］．最近的研究结果还表明，ＷＲＫＹ蛋白还参与萜类生物合成的调控［２，３，５］．ＷＲＫＹ蛋白的最典型
特征是包含“ＷＲＫＹ”结构域，其中 Ｗ＝色氨酸、Ｒ＝精氨酸；Ｋ＝赖氨酸；Ｙ＝酪氨酸．根据该保守结构域，
笔者在滇龙胆数据库中进行搜索，发现了大量的 ＷＲＫＹ蛋白，其中ＧｒＷＲＫＹ２基因在叶中表达量远远高
于根，可能参与龙胆苦苷的生物合成．为此，本文对ＧｒＷＲＫＹ２基因进行克隆和生物信息学分析．但在基
因克隆过程中，由于受到ＤＮＡ聚合酶种类、ＰＣＲ循环数等影响，往往会导致所克隆的片段发生突变．因
此，本研究采用目前保真性最高的酶ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　Ｐｒｅｍｉｘ，并将ＰＣＲ循环数设置为３０，来最大限度
地防止所克隆片段的突变，从而使所克隆的基因序列具有很高的可信度．
使用生物信息学对所克隆的基因片段进行分析，ＢＬＡＳＴ比对结果和系统发育分析结果均表明所克
隆片段为ＷＲＫＹ 基因．亚细胞定位分析结果表明，ＧｒＷＲＫＹ２蛋白可能定位于细胞核，这与西洋参
ＰｑＷＲＫＹ１的细胞核定位结果相一致［５］．保守结构域分析结果表明，ＧｒＷＲＫＹ２蛋白包含ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ
ＷＲＫＹ（ＩＰＲ００３６５７）保守结构域，因此，笔者推测ＧｒＷＲＫＹ２蛋白可能通过该保守结构域来调控细胞核
内基因的表达．
参考文献：
［１］金航，张霁，张金渝，等．滇龙胆［Ｍ］．昆明：云南科技出版社，２０１３：１－５．
［２］Ｘｕ　Ｙ，Ｗａｎｇ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧａＷＲＫＹ１，ａ　ｃｏｔｔｏｎ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｈａｔ　ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｓｅｓｑｕｉｔ－
ｅｒｐｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ（＋）－δ－ｃａｄｉｎｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ－Ａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００４，１３５（１）：５０７－５１５．
［３］Ｍａ　Ｄ，Ｐｕ　Ｇ，Ｌｅｉ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡａＷＲＫＹ１，ａｎ　Ａｒｔｅｍｉｓｉａ　ａｎｎｕａｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｈａｔ
ｒｅｇｕｌａｔｅｓ　ｔｈｅ　ａｍｏｒｐｈａ－４，１１－ｄｉｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ，ａ　ｋｅｙ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９，５０
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［４］Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｕ　Ｅ　Ａ，Ｈａｒｉｎｇ　Ｍ　Ａ，Ｓｃｈｕｕｒｉｎｋ　Ｒ　Ｃ．ＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｎ　Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍｔｒｉｃｈｏｍｅｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ　ｔｒａｎ－
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｔｈａｔ　ａｃｔｉｖａｔｅ　ｔｅｒｐｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４，１５（１）：４０２．
［５］Ｓｕｎ　Ｙ，Ｎｉｕ　Ｙ，Ｘｕ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ＷＲＫＹ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ－
ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｍｅｔｈｙｌ　ｊａｓｍｏｎａｔｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ＰｑＷＲＫＹ１ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＰａｎａｘ　ｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，Ｔｉｓｓ　Ｏｒｇ，２０１３，１１４
（２）：２６９－２７７．
０４
玉溪师范学院学报
［６］Ｓｃｈｌｕｔｔｅｎｈｏｆｅｒ　Ｃ，Ｐａｔｔａｎａｉｋ　Ｓ，Ｐａｔｒａ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ　ａｎｄ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ＷＲＫＹ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｒｅｖｅａｌ　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｉｎ　ｊａｓｍｏｎａｔｅ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４，１５（１）：５０２．
［７］Ｚｈａｎｇ　Ｊ，Ｚｈａｎｇ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｒｅｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｎ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉ－
ｎａｌ　ｈｅｒｂ　Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ［Ｊ］．Ａｌｅｌｏｐａｔｈｙ　Ｊ，２０１２，２９（２）：３２５－３３２．
［８］Ｚｈａｎｇ　Ｊ，Ｗａｎｇ　Ｙ，Ｙａｎｇ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．Ｕｓｅ　ｏｆ　ｇｉｂｂｅｒｅｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｔｏ　ｏｖｅｒｃｏｍｅ　ｔｈｅ　ａｌｅｌｏｐａｔｈｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ａ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｎ
ｔｈｅ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｅｄｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ，ａ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　ｈｅｒｂ［Ｊ］．Ｓｅｅｄ　Ｓｃｉ　Ｔｅｃｈｎｏ，２０１２，４０（３）：４４３－４４７．
［９］Ｗｏｎｇ　Ｋ，Ｂｕｔ　Ｐ　Ｐ，Ｓｈａｗ　Ｐ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｖｅｎ　ＤＮＡ　ｂａｒｃｏｄｅｓ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ｃｌｏｓｅｌｙ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｇｅｎｔｉａｎａ
ｓｐｅｃｉｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｄｕｌｔｅｒａｎｔｓ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３，８（１）：１６．
［１０］Ｎａｋａｔｓｕｋａ　Ｔ，Ｓａｉｔｏ　Ｍ，Ｓａｔｏ－Ｕｓｈｉｋｕ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｔｈａｔ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｗｈｉｔｅ－ａｎｄ
ｂｌｕｅ－ｆｌｏｗｅｒｓ　ｉｎ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｇｅｎｔｉａｎ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２０１２，１８４（３）：３３５－３４４．
［１１］Ｎａｋａｔｓｕｋａ　Ｔ，Ｙａｍａｄａ　Ｅ，Ｓａｉｔｏ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｔｉａｎ　ＭＹＢ１Ｒｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｓｕｐｐｒｅｓ－
ｓｅｓ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｆｌｏｗｅｒｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｒｅｐ，２０１３，３２（１２）：１９２５－１９３７．
［１２］Ｎａｋａｔｓｕｋａ　Ｔ，Ｓａｉｔｏ　Ｍ，Ｙａｍａｄａ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＧｔＭＹＢＰ３ａｎｄ　ＧｔＭＹＢＰ４，ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅｓ
ｏｆ　Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｔｈａｔ　ｒｅｇｕｌａｔｅ　ｅａｒｌｙ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｉｎ　ｇｅｎｔｉａｎ　ｆｌｏｗｅｒｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｏｔ，２０１２，
６３（１８）：６５０５－６５１７．
［１３］Ｇｕ　Ｙ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｔｉａｎ　ｒｅｔｕｒｎｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｖｅｌｉｎｇ　ｂｙ　ｓｐａｃｅｃｒａｆｔ　Ｓｈｅｎｚｈｏｕ－１０ｗｈｉｃｈ　ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｐａｃｅ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｐｒｏｊｅｃｔ
ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｓｔａｒｔｅｄ　ｉｎ　Ｙｕｎｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ［ＥＢ／ＯＬ］．２０１３［ｃｉｔｅｄ　２０１３　２０１３－７－１２］；Ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｆｒｏｍ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｉｎａｎｅｗｓ．ｃｏｍ／
ｇｎ／２０１３／０７－１２／５０３７５３８．ｓｈｔｍｌ．
［１４］张晓东，李彩霞，王连春，等．滇龙胆ＧｒＳＬＳ１基因的克隆和原核表达［Ｊ］．西北植物学报，２０１４，３４（７）：１３１１－１３１７．
［１５］Ｒｕｓｈｔｏｎ　Ｐ　Ｊ，Ｓｏｍｓｓｉｃｈ　Ｉ　Ｅ，Ｒｉｎｇｌｅｒ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．ＷＲＫＹ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，２０１０，１５（５）：２４７－
２５８．
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＧｒＷＲＫＹ２Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ
ＬＵ　ＺＨｉｆｅｉ　ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏｄｏｎｇ　ＰＥＮＧ　Ｄｏｎｇｙａｎ　ＬＩ　Ｗｅｎｑｉｎｇ　ＨＵ　Ｗｅｎｓｈｕ
（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＹｕｘｉＮｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｕｘｉ，Ｙｕｎｎａｎ　６５３１００，Ｃｈｉｎａ）
Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｇｅｎｔｉａｎａｒｉｇｅｓｃｅｎｓ；ＧｒＷＲＫＹ２ｇｅｎｅ；ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｔｉａｎａｒｉｇｅｓｃｅｎｓ，ａＧｒＷＲＫＹ２ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｙｏｕｎｇ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ
Ｇｅｎｔｉａｎａｒｉｇｅｓｃｅｎｓ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ａｌｓｏ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈａｔ
ＧｒＷＲＫＹ２ｇｅｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＫＪ９１７１６９）ｈａｓ　ａ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　３６３ｂｐ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　１２０ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ＧｒＷＲＫＹ２ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　１３．２４ｋＤ　ｗｉｔｈ　ｉｔｓ　ｐＩ　ｏｆ　８．２９．ＧｒＷＲＫＹ２ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｅｌｏｎｇｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＷＲＫＹ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ
ｆａｍｉｌｙ，ａｎｄ　ｍａｙ　ｂｅ　ｌｏｃａｌｉｚｅｄ　ｉｎ　ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｉｔ　ｉｓ　ａ　ｓｔａｂｌｅ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｍａｉｎｌｙ　ｃｏｍｐｏｓｅｄ　ｏｆα－
ｈｅｌｉｘ（２８．３３％）ａｎｄ　ｒａｎｄｏｍ　ｃｏｉｌｓ（５９．１７％）．ＧｒＷＲＫＹ２ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ｃｌｏｓｅ　ｔｏ　ＡｌＷＲＫＹ１５ａｎｄ　ＢｒＷＲＫＹ５１．Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗｉｌ
ｌａｙ　ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ　ｏｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＧｒＷＲＫＹ２ｇｅｎｅ．
收稿日期：２０１５年２月５日
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路止飞　张晓东　彭东燕　李文清　胡文书：滇龙胆ＧｒＷＲＫＹ２基因的克隆与序列分析