全 文 ：应用基因芯片技术研究异紫堇碱处理后的 SiHa细胞差异基因表达谱*
梁雪霏1，简启亮2，杜 宏2，王 芳1，2＊＊
(1兰州大学第二临床医学院，兰州 730000;2兰州大学第二医院，兰州 730000)
摘 要 目的:应用基因芯片技术研究异紫堇碱处理后的 SiHa细胞差异基因表达谱改变，以寻找异紫堇碱抑制宫颈癌 SiHa
细胞 HPV基因表达的分子机理。方法:抽提经异紫堇碱处理后不同时段的 SiHa细胞和未经异紫堇碱处理的 SiHa细胞中的 mＲNA
来制备探针，经杂交、洗涤后，通过计算机扫描分析未经异紫堇碱处理的 SiHa 细胞和处理后的 SiHa 细胞基因表达谱的差异情况。
结果:在每组 60000 多个候选基因中，各筛选出 200 多条差异表达倍数在 2 倍以上的基因，在异紫堇碱处理后 12 小时的样本中下调
基因 206 条，上调基因 70 条，未知基因 217 条;24 小时后下调基因 95 条，上调基因 137 条，未知基因 166 条;48 小时后下调基因 150
条，上调基因 101 条，未知基因 159 条。结论:基于基因芯片技术的基因表达谱分析能够高通量筛选与异紫堇碱抑制宫颈癌 SiHa细
胞 HPV基因表达的分子机理相关的基因。
关键词 异紫堇碱(ICD);基因芯片;基因表达;SiHa细胞
宫颈癌是全世界仅次于乳腺癌导致妇女死亡的第二大恶
性肿瘤，GLOBOCAN(全球癌症统计组织)调查显示 2008 年全
球有 53 万宫颈癌新发病例，死亡患者超过 27 万，其中 85%发
生在发展中国家［1］。中国每年有 13． 2 万新增病例，约占全世
界宫颈癌新发病例的 24． 91%，严重危害女性健康。
异紫堇碱是存在于秃疮花中发现的一种异喹啉类生物碱
单体，可从植物中直接提取，也可以通过化学合成制得。我们前
期工作发现，异紫堇碱可以在体外抑制携带不同 HPV亚型的人
宫颈癌 Hela和 SiHa细胞株中 E6、E7 基因的表达。它可能通过
抑制 NF-κB的激活而抑制人宫颈癌细胞系 Hela、SiHa、C33A 细
胞的增殖、诱导凋亡，具备一定的抗肿瘤作用。我们通过计算机
分子对接筛选技术，对小分子抑制剂在 HPV16 E6 受体中的结
合位点进行预测(图 1)，初步筛选出异紫堇碱可以稳定地结合
HPV16E6 蛋白，从而预测到 HPV16E6 很有可能就是异紫堇碱
的作用靶点(图 2)。
图 1 HPV16 E6 蛋白的结合口袋示意图
我们的前期工作充分显示异紫堇碱具有一定的抗肿瘤和
抑制 HPV16E6 基因表达和蛋白功能的作用，具有一定的药物开
发潜力。在此基础上，我们利用 MTT检测法检测了不同浓度的
异紫堇碱对 SiHa细胞的生长抑制率以决定进行芯片实验的药
物浓度，结果如图 3 所示:
图 2 异紫堇碱和 HPV E6 蛋白质的结合模式图
绿色部分代表药物异紫堇碱，蓝色虚线代表氢键相互作用，受体用飘带
结构显示，有相互作用的残基用棍棒模型显示，小分子配体用球棍模型
显示。
基因芯片又称 DNA微阵列，是近年来兴起的一种研究基因
组学和遗传学的新技术，应用基因芯片技术在同一时间内快速、
精确地研究 ICD干预的 SiHa 细胞与未经任何处理的体外培养
的 SiHa 细胞中基因表达谱的改变，全面地了解经 ICD 处理后
SiHa细胞所伴发的基因差异表达，为在基因水平上分析 ICD 抑
制宫颈癌 HPV基因表达的抑制作用。
图 3 异紫堇碱对人宫颈癌 Siha 细胞增殖抑制作用的 MTT 检测
92中药药理与临床 2015;31(3)
* 基金项目:国家自然科学基金(NO． 81202959)，兰州大学重大需求培育项目(lzujbky － 2013 － m04) ＊＊通讯作者
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2015.03.009
1 材料与方法
1． 1 试验药物 异紫堇碱单体由中国科学院兰州化物所柳军
玺等研究员从罂粟科植物秃疮花中提取后采用大孔吸附树脂
技术 的 自 制 产 品 (批 号:20121001、20l21015、20121020、
20121103、20121115、20121125)，经鉴定，本样品中的异紫堇碱
含量均超过 90%，提取量达到克级。异紫堇碱样品将其配置成
浓度为 800μmol /L的药物溶液。
1． 2 试剂 NucleoSpin ＲNA clean-up 试剂(MACHEＲEY-
NAGEL，Germany)，ＲNeasy micro kit (Cat #74004，QIAGEN，
GmBH，Germany) ，ＲNase-Free DNase Set (Cat#79254，QIAGEN，
GmBH，Germany) ，Affymetrix WT Amplication Kit(Cat#902224，
Affymetrix，Santa Clara，CA，US) ，GeneChip WT Terminal Labe-
ling Kit(Cat#900671，Affymetrix，Santa Clara，CA，US) ，Wash and
Stain Kit (Cat#900720，Affymetrix，Santa Clara，CA，US)。
1． 3 仪器 GeneChip Human Transcriptome Array 2． 0 表达谱
芯片，Fluidics Station 450 (Cat#00-0079，Affymetrix，Santa Clara，
CA，US)。
1． 4 方法
1． 4． 1 样本的获取 本实验采用江西齐氏生物有限公司提供
的成品 10 代以内的 SiHa细胞株，经培养、传代、冷冻保存后，对
数生长期细胞长到密度达 80%时，用浓度为 800μmol /L 的 ICD
处理，收集样品。
1． 4． 2 组织总 ＲNA 提取 从液氮罐中取出样本，把细胞放入
已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，直至固体状的 Tr-
izol逐步回复到液体状态。通过异丙醇沉淀法浓缩 ＲNA，并进
一步采用 NucleoSpin ＲNA clean-up 试剂(MACHEＲEY-NA-
GEL，Germany)对总 ＲNA进行过柱纯化，最后用分光光度计定
量，甲醛变性胶电泳质检。
1． 4． 3 样品质检和芯片实验 以 Trizol法裂解后，我们将样本
裂解液分为四组(S1:未经 ICD处理的 SiHa细胞;S12:经 ICD 处
理 12 小时后的 SiHa细胞;S24:经 ICD处理 24 小时后的 SiHa细
胞;S2:经 ICD处理 48 小时后的 SiHa 细胞)送上海伯豪公司采
用 GeneChip Human Transcriptome Array 2． 0 表达谱芯片筛选
表达差异的 mＲNA。
1． 4． 3． 1 样品质检 采用 TＲIZOL Ｒeagent (Cat#15596-018，
Life technologies，Carlsbad，CA，US)并且根据生产厂商提供的
标准操作流程进行样品的 total ＲNA 抽提，抽提所得 total ＲNA
经 Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies，Santa Clara，
CA，US)电泳质检合格后使用 ＲNeasy micro kit (Cat #74004，
QIAGEN，GmBH，Germany)和 ＲNase-Free DNase Set (Cat #
79254，QIAGEN，GmBH，Germany)，纯化 total ＲNA。
1． 4． 3． 2 芯片实验 实验样品 ＲNA 采用 Affymetrix WT 芯片
推荐试剂盒［2，3］，Affymetrix WT Amplication Kit(Cat#902224，Af-
fymetrix，Santa Clara，CA，US)和 GeneChip WT Terminal Labe-
ling Kit(Cat#900671，Affymetrix，Santa Clara，CA，US)标准操作
流程对样品 total ＲNA中的 mＲNA进行放大、标记和纯化，获得
带有生物素(biotin)标记的 cDNA。按照 Affymetrix 表达谱芯片
配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，GeneChip Hybridiza-
tion，Wash and Stain Kit (Cat#900720，Affymetrix，Santa Clara，
CA，US)，在滚动杂交炉，Hybridization Oven 645 (Cat#00-0331-
220V，Affymetrix，Santa Clara，CA，US)中 45℃，16 小时滚动杂
交，杂交完成后在洗涤工作站 Fluidics Station 450 (Cat#00-0079，
Affymetrix，Santa Clara，CA，US)按照 Affymetrix提供的标准操作
流程进行芯片的洗涤。
芯片结果采用 GeneChip Scanner 3000 (Cat#00-00212，Af-
fymetrix，Santa Clara，CA，US)进行扫描，用 Command Console
Software 3． 1 (Affymetrix，Santa Clara，CA，US)读取原始数据，质
控合格的数据采用 Expression Console进行归一化处理。
2 结果
2． 1 总 ＲNA 提取结果 总 ＲNA 提取结果:未经处理的 SiHa
细胞 A260 /A280 达 1． 86，经 ICD 分别处理 12、24、48 小时之后
的 SiHa细胞的 A260 /A280 也分别达 1． 95、1． 92 和 1． 92 电泳结
果证实提取到高纯度的总 ＲNA(附电泳图:图 4)。
图 4 组织提取总 ＲNA电泳图
2． 2 各组细胞基因差异表达结果 基因芯片分析结果显示:在
差异倍数达到 2 倍以上的基因中，在 ICD处理后 12 小时的样本
中下调基因 206 条，上调基因 70 条，未知基因 217 条;24 小时后
下调基因 95 条，上调基因 137 条，未知基因 166 条;48 小时后下
调基因 150 条，上调基因 101 条，未知基因 159 条。其中包括细
胞凋亡基因、转录基因，DNA结合相关基因、细胞信号和传递蛋
白基因，甚至许多非编码 ＲNA等多种基因。
在这些差异表达的基因中，最明显的一个 mＲNA 是 NM-
012114，位于第 19 号染色体。它在 ICD 处理后 12、24、48 小时
的样本表达中的差异倍数分别是 1． 0725、54． 6156、2． 1544，差异
变化幅度明显，其中，在处理后 24 小时时的表达差异是最明显
的，这种差异表达到底是否具有实际意义，还有待我们进一步利
用实时荧光 PCＲ技术进行验证。
2． 4 差异基因表达的 GO富集分析结果如图 见图 5 ～ 7。
03 中药药理与临床 2015;31(3)
图 5 GO分析示意图(ICD处理 12 小时)
图 6:GO分析示意图(ICD处理 24 小时)
图 7:GO分析示意图(ICD处理 48 小时)
2． 4 差异基因表达的 Pathway分析 见图 8 ～ 10。
13中药药理与临床 2015;31(3)
图 8 Pathway分析示意图(ICD处理 12 小时)
图 9 Pathway分析示意图(ICD处理 24 小时)
图 10 Pathway分析示意图(ICD处理 48 小时)
2． 5 K-means聚类分析结果 利用 K-means 聚类分析时，加入 实验组内部的比较，可以看出，四个样本，任意 2 个之间差异达
23 中药药理与临床 2015;31(3)
到 2 倍即作为差异基因。差异基因数(探针数)共 1232 个，其中
包含编码基因 950 个，非编码基因 282 个，第二类基因呈明显下
调趋势。
图 11 K-means聚类分析图
3 讨论
肿瘤的发生、发展往往是细胞内外多个基因结构和遗传学
功能异常改变的结果，许多基因和信号通路控制细胞增殖、分化
和凋亡，在癌症发生中起关键作用。本研究发现经处理的三个
样本的差异表达基因达六万多条，仅就差异倍数达两倍以上的
基因，每个样本都达到 200 条以上。在差异表达基因中有细胞
凋亡基因、转录基因、DNA结合相关基因、细胞信号和传递蛋白
基因，甚至许多非编码 ＲNA等多种基因的参与，这说明，ICD 可
能从多方面影响 SiHa 细胞功能表达。由 K-means 聚类分析可
以看出，第二类基因(共包括了 239 个基因)是呈逐渐下调的趋
势，这类基因与细胞分裂有关，可以推测在 ICD 处理后，细胞分
裂速度在逐渐减慢。同时发现第四类基因也有逐渐上调的趋
势，因此，这两类基因在接下来的研究中划为重点研究对象。再
者，结合 GO富集分析和 Pathway 分析结果，差异基因主要集中
在细胞分裂分化，细胞增殖，细胞减数分裂的 G2 /M期等生物学
过程以及细胞周期、p53 信号通路、HIF-1 信号通路、细胞凋亡等
信号通路上，推测 ICD 很有可能通过影响癌细胞的分裂、增生、
凋亡以及细胞周期等过程来控制宫颈癌的发生发展。
基因芯片差异表达谱中，差异表达最为明显的 NM-012114
是一种与 CAS凋亡蛋白酶-14(caspase-14)相关的，参与半胱氨
酸类肽链内切酶活性调节的 mＲNA，它存在于细胞核、细胞质以
及角纤维蛋白中。
CAS凋亡蛋白酶是含半胱氨酸的天门冬氨酸特异蛋白酶，
它是一组对底物天门冬氨酸部位有特异水解作用、活性中心含
半胱氨酸的蛋白酶。CAS活性质子能快速诱导病变细胞自然凋
亡。凋亡调控的基因接收由信号转导途径传来的死亡信号后按
预定程序启动，并合成为执行凋亡所需的各种酶类及相关物
质［4，14］。细胞凋亡由激活的核酸内 (endogenous nuclease，
DNase)和凋亡蛋白酶(caspases)执行，前者彻底破坏细胞生命
活动所必需的全部指令，后者导致细胞结构的全面解体。实
验［5］证实 CAS活性质子通过受体作用于细胞后，使之产生一系
列复杂的生化反应，形成与细胞凋亡有关的第二信使物质如
cAMP、Ca2 +、神经酰胺等，然后通过细胞内的信号转导途径激
活后续凋亡程序。有研究发现［6］，某些细胞毒药物作用于肿瘤
细胞，通过活化 CAS 凋亡蛋白酶而促使其凋亡。目前，有些肿
瘤化疗药物［11］通过凋亡蛋白酶而诱导癌细胞凋亡，实现治疗作
用。例如肿瘤药物治疗中最常使用的顺铂在诱导肿瘤细胞凋亡
时，很大程度上依赖了 caspase-3、caspase-8 以及 caspase-9 的作
用［7，12］。NM-012114 参与了 caspase-14 的编码，caspase-14 是进
化过程中一类特殊的含半胱氨酸的天门冬氨酸特异蛋白酶，目
前发现，它主要在角化的上皮组织中表达，例如表皮、胸腺的
Hassall小体、或者啮齿动物的前胃等，并涉及到炎症反应和细胞
凋亡，与肿瘤等疾病的关系的焦点主要集中在皮肤疾病和肺鳞
状细胞癌上，最近也有研究表明它同时参与细胞的分化，但是否
参与到细胞的增殖还存在争议［8］。目前，弄清它在人类疾病中
所扮演的角色仍然是一个巨大的挑战，可以肯定的是，与其说它
是一个凋亡蛋白酶，倒不如说它更可能是弹性蛋白酶样的表皮
特异性丝氨酸蛋白酶［8］。对于以鳞状细胞癌为主的宫颈癌
来［13］说，在处理后的样本中表达明显上调，由此推测，也许 ICD
对 HPV基因的一直作用也同样是通过凋亡蛋白酶实现的，因
此，对该基因进行深入研究很有可能成为宫颈癌治疗的新靶点。
同时，如果根据这一原理设计特异性凋亡蛋白酶激活物促进肿
瘤细胞凋亡将成为肿瘤治疗值得探索的领域。
目前，ICD 仍是一种处于评估阶段的抗癌药物，复旦大学
等［9］对于 ICD在肝细胞癌的治疗中的抗癌作用相关研究显示，
ICD通过对侧群细胞(SP 细胞)在 G2 /M 期的细胞周期阻滞来
减少肝细胞癌细胞系中的 SP细胞所占的百分比，最终引起细胞
凋亡。研究同时也表明，体外经 ICD 处理的肝细胞癌细胞的抑
癌基因 PDCD4 表达明显上调。北京大学最新的研究表明［10］，
SiHa细胞系中 SP 细胞的分选比例为(0． 83 ± 0． 76)%，与 non-
SP细胞比较，致瘤潜伏期较短、肿瘤体积较大，其可能成为宫颈
癌治疗的新靶点。本实验 GO分析中显示的与 G2 /M 期细胞阻
滞相关的基因是否与 SP 细胞相关也可以成为本实验的新的研
究方向。
综上所述，ICD对 SiHa细胞表达 HPV的抑制作用涉及到许
多基因的异常表达，深入研究这些基因，可能使 ICD成为一种治
疗 HPV感染和宫颈癌的新的有效中药单体，或以其为基础设计
一类新药提供理论依据。
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Analysis of differential gene expression profiles in isocorydine-treated SiHa cell with cDNA microarray
Liang Xuefei1，Jian Qiliang2，Du Hong2，Wang Fang2
(1 Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou，Gansu 730000;2 Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730000)
Objective:Make an analysis of diferential gene expression profiles in Isocorydine-treated SiHa cell with cDNA microarray to find out the
molecular mechanism that the Isocorydine inhibit the expression HPV in SiHa cell base on． Methods:Total ＲNA was extracted from the Iso-
corydine-treated SiHa cell at different time and normal SiHa cell． The mＲNA was used to prepare probes． The mixed probes were hybridized to
the cDNA microarray． After washing，the DNA chips were scanned by laser scanner，The acquired was analyzed． Ｒesults:Among the more
than 60000 target genes of the 3 groups，more than 200 genes were identified in Isocorydine-treated SiHa cells that were either over or under-
expressed as compared to controls in each group． And about two-thirds were found in this study． Conclusion:The cDNA microarray for analy-
sis of gene expression profile is a powerful method for finding out the mecular mechanism that the Isocorydine inhibit the expression HPV in
SiHa cell base on．
Key word isocorydine(异紫堇碱);cDNA microarray ;gene expression;SiHa cell
氧化白藜芦醇体内外抑制肝癌细胞增殖的研究
黄 玥，熊 尧，周黎明
(四川大学华西基础医学与法医学院药理教研室，成都 610041)
摘 要 目的:研究氧化白藜芦醇对肝癌 SMMC-7721 细胞以及小鼠移植性肿瘤 H22 的抑制作用及其抗肝癌作用机制。方法:
采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测氧化白藜芦醇对人肝癌 SMMC-7721 细胞体外增殖的抑制效果。流式细胞术测定肝癌 SMMC-
7721细胞的凋亡率。建立小鼠 H22 肝癌细胞移植瘤模型，分为对照组、环磷酰胺组、氧化白藜芦醇 80、40、20 mg /kg剂量组，以实体
瘤瘤块生长曲线及抑瘤率为指标评价氧化白藜芦醇对小鼠移植瘤生长的抑制作用;取用不同剂量组作用后的瘤块组织，采用免疫
组织化学法检测 Bax，bcl-2，Caspase-3 蛋白表达情况。结论:MTT 结果显示，氧化白藜芦醇对肝癌 7721 肿瘤细胞的 IC50值为 58．
13μg /ml，抗肿瘤活性良好;流式细胞术结果显示氧化白藜芦醇促进肝癌 7721 细胞凋亡;体内试验显示氧化白藜芦醇对移植瘤的抑
制作用明显，80、40、20 mg /kg三个剂量组对 H22 移植瘤抑制率为 76． 88%、65． 90%和 45． 99%，呈一定量效关系，氧化白藜芦醇增加
caspase-3 表达量及 Bax /Bcl-2 比值。结论:氧化白藜芦醇具有明显的体内外抑制肿瘤作用，作用机制可能与诱导细胞凋亡有关。
关键词 氧化白藜芦醇;SMMC-7721 细胞株;肝癌 H22;细胞凋亡
氧化白藜芦醇(Oxyresveratrol)是一种天然活性物质，多从
桑科(Moraceae)植物中提取而得，具有来源广泛，提取工艺成熟
的特点［1］。作为近年来被广泛研究的反式二苯乙烯类化合物
白藜芦醇的同系物，氧化白藜芦醇的药用价值越来越受到关
注，文献已报道过的研究成果包括氧化白藜芦醇抑制酪氨酸酶
活性［2］、抗炎［3］、抗氧化［4］、抗病毒［5，6］等作用，但少有其抑制肿
瘤细胞生长作用的报道，而根据白藜芦醇具有抗肿瘤活性，我们
推断氧化白藜芦醇可能具有抑制肿瘤细胞的作用，本研究从体
内外两方面对氧化白藜芦醇抑制肝癌细胞的生长进行了相应
的研究。
1 材料与方法
43 中药药理与临床 2015;31(3)
DOI:10.13412/j.cnki.zyyl.2015.03.010