全 文 ：第 22卷　第 1期
2007 年 1 月
北　京　农　学　院　学　报
JO URNA L OF BEIJING UNIVERSITY OF AGRICULT URE
Vo l. 22 , No. 1
Jan. , 2007
　　收稿日期:2006-11-29;修订日期:2006-12-25
　　基金项目:北京市教育委员会项目 (项目编号:km20031002008)
　　作者简介:葛秀秀 , 女 , 1975年出生 , 讲师 , 研究方向:分子生物技术育种 , t el:13311506527。 *通讯作者:关雪莲
4种卫矛属园林植物的 RAPD分析
葛秀秀a , 关雪莲a* , 田晔林b , 于建军b , 张　妍b , 郭　蕾a
(北京农学院 a. 生物技术系 , b . 园林系;北京 102206)
摘　要:卫矛属 (Celastraceae L.) 植物为常绿灌木或稀小乔木 , 以其对寒 、 盐 、 有害气体等逆境的强抗性而为
人们所关注。但是 , 林木品种真实性和纯度的鉴定已经成为困扰苗木质量管理最突出的问题之一。 笔者用
RAPD分子标记对 4种卫矛属植物进行基因组 DNA 遗传多样性分析 , 从 35 个随机引物中筛选出扩增谱带清晰
并呈现多态性的 20 个随机引物 , 每个引物产生 1 ～ 10 条 RAPD片段 , 多态性条带占 67. 61%。 利用 UPGMA 聚
类法对 4 种卫矛属植物的 176 条谱带进行聚类分析。结果表明 , 北海道黄杨和扶芳藤聚类成一组 , 大叶黄杨和
金心黄杨聚类成另一组。可见 , RAPD技术对卫矛属植物的分类鉴定和遗传多样性评价有效可行。
关　键　词:卫矛属;RAPD分子标记;遗传多样性;聚类分析
中图分类号:S687. 1　　文献标识码:A 　　文章编号:1002-3186(2007)01-0001-03
RAPD Analysis of 4 Species in Celastraceae
G E Xiu-xiua ,GUAN Xue-liana* , TIA N Ye-linb ,YU Jian-junb ,ZHANG Yana ,GUO Leia
(a.Depar tment o f Bio technolog y , b. Depe rtment of Landscape;Beijing Unive rsity of Ag riculture , Beijing 102206 , China)
Abstract:Species of Celastraceaeare mostly resistant to st ress conditions. But the identif ication of purity is
dif ficult. Random amplified po lymorphic DNA(RAPD) technique w as used in analyzing the biolo gical g e-
netic diversity of 4 species of Celastraceae. 20 ef fective primers f rom 35 arbi trary primer s we re used to am-
plify 176 DNA bands , of w hich po lymo rphic RAPD loci covered an average of 67. 61%. A DNA mo lecular
dendrog ram based on UPGMA cluster analy sis showed that the 4 specie s of Celastraceaecouldbe divided in-
to 2 main g roups. Group one consisted of Euonymus japonicus Thunband Euonymus f ortunei.G roup tw o
consisted of cv. aureo-variegatusand Euonymus japonicus. RA PD was valuable in studying in bio logical
genet ic diversi ty of Celastraceae.
Key words:Celastraceae;RA PD;genetic diversi ty ;cluster analy sis
　　卫矛属(Celastraceae L. )植物为常绿灌木或稀
小乔木[ 1] ,以其对寒 、盐 、有害气体等逆境的强抗性
而为人们所关注 。冬季不落叶的常绿阔叶卫矛属植
物不仅能为单调的冬季增添绿色 ,更有助于改善首
都冬季大气质量和整个城市的生态环境 。
　　从 20世纪 50 年代起 ,我国就开始进行耐寒林
木卫矛属新品种的选育工作。但是 ,林木品种真实
性和纯度的鉴定已经成为困扰苗木质量管理最突出
的问题之一。卫矛属植物为多年生木本 ,一般采用
嫁接繁殖 ,新老品种更替频繁 ,且不同地域经常交
换 ,易造成同名异物及同物异名现象。在苗期 ,即使
专业技术人员仅靠传统的形态特征和农艺性状也难
以识别。分子标记技术在品种鉴定 、遗传多样性分
析检测 、系谱分析等方面的应用价值和有效性已得
到证实[ 2 -7] 。本研究旨在利用分子标记技术进行卫
矛属种质资源鉴定和亲缘关系分析 ,为快速 、简便 、
准确鉴定种苗真实性和纯度开辟新的途径 。
1　材料和方法
1. 1　材　料
1. 1. 1　植物材料　试验所用的 4 种材料为北海道
黄杨(Euonymus japonicus Thunb)、大叶黄杨(Eu-
onymus japonicus)、金心黄杨(Euonymus japoni-
cus cv. aureo-variegatus)和扶芳藤(Euonymus for-
tunei),均为北京农学院校内种植植物 。2005年 4
月采集各植物的嫩叶叶尖(为保证试验具有普遍性 ,
2　 北　京　农　学　院　学　报 第 22卷
采集时每种样品 3株以上),在 - 70 ℃的低温冰箱
内储存备用。
1. 1. 2　试 　剂 　Taq DNA 聚合酶 , dNTPs , PCR
引物等购自上海生物工程技术有限公司 。其他生化
试剂和常规试剂均为超纯或分析纯 。
1. 2　方　法
1. 2. 1　基因组 DNA 的提取　采用改良的 CTA B
法。取北海道黄杨 、大叶黄杨 、金心黄杨 、扶芳藤样
品各 0. 1 g 加液氮在研钵中研成粉末 ,加 2×CTA B
600 μL 、巯基乙醇 20 μL 混匀 , 60 ℃水浴振荡 45
min。加 620 μL 氯仿 ∶异戊醇(24∶1)混合液混
匀 ,10 000 r /min离心 10 min 。取上清液加异丙醇
300 μL ,轻轻搅拌后 - 20℃放置 60 min , 10 000 r /
min离心 5 min ,吸弃上清和水分 ,加入 500 μL TE
使沉淀物溶解。加 500 μL 酚∶氯仿(1∶1),圆盘震
荡器搅拌 10 min ,4 ℃, 10 000 r /min ,离心 10 min 。
取上清液加入 40 μL 醋酸钠(3 mol /L , pH 5. 2),再
加入 100μL 无水乙醇 ,放置冰箱中冷冻过夜;次日
在0 ℃,12 000 r /min ,离心10 min , 70%乙醇清洗沉
淀 ,干燥后用 T E缓冲液溶解 ,保存于 4 ℃备用 。
1. 2. 2　PCR扩增　PCR扩增在 PCR仪上进行。反
应总体积为 25 μL ,含 2. 6 mmol /L MgCl2 ,20 mmol /L
Tris-HCl(pH 8.0), 50 mmol /L KCl , 0. 2 mmol /L
dNTP ,1μmol/L引物 ,1. 5 U Taq DNA聚合酶。扩增
过程为 94 ℃预变性4 min ,1个循环;94 ℃变性20 s ,36
℃退火30 s ,72 ℃延伸90 s ,进行42个循环 ,最后72 ℃
延伸4 min ,1个循环;4 ℃保温。每次PCR反应均设置
空白对照。
1. 2. 3扩增产物检测 　RAPD产物经 1. 4%琼脂糖
凝胶电泳(电压为 6 ～ 9 V /cm),溴化乙锭染色后于
紫外灯下观察拍照。
1. 2. 4数据的统计与分析　按琼脂糖凝胶同一位置
上 DNA 带的有无进行统计 ,有带的记为“ 1”(含弱
带),无带的记为“0” ,利用 UPGMA(Unweighted
Pair Group Mean Average)统计软件对所得数据进
行统计分析。
2　结果与分析
2. 1　DNA提取结果　4个样品中提取的 DNA 溶
液琼脂糖凝胶电泳结果如图 1. 由图 1可见 , DNA
的片段大小基本均一 ,4种样品基因组 DNA的主带
清晰 ,适于 RAPD分析。
2. 2　引物的筛选及扩增结果　根据扩增多态性引
物的条带强度 ,扩增条带数 ,多态性及重复性原则 ,
北:北海道黄杨;大:大叶黄杨;金:金心黄杨;扶:扶芳藤
图 1　4 种卫矛属植物 DNA电泳检测图谱
Fig. 1　DNA electrophoresis of 4 species
in Celastraceae
从 35个 10碱基随机引物中筛选出 20个有效引物。
20个有效引物在 4种卫矛属植物中共扩增出 176
条带 ,多态性条带为 119 条 ,多态性条带百分比为
67. 61%,20个有效引物及所得 DNA带型统计如表
1 ,引物扩增得到 PCR图谱(部分)见图 2。
表 1　20 个有效引物对 4 种卫矛属植物 DNA的扩增情况
Tab. 1　Amplifications of 20 effective primers
on 4 species in Celastraceae
引物号 序列 扩增条带
多态
性条带
多态性条带
占百分比 /%
S367 AGCGAGCAAG 12 6 50. 00
S301 C TGGGCACGA 10 4 40. 00
S384 GACTGCACAC CATCGCCGCA 8 6 75. 00
S282 CTATGCCGAC TCACCAGCCA 8 6 75. 00
S243 CTGCGCTGGA GTAGCACTCC 10 8 80. 00
S252 TGACCCGCCT CCGCCTAGTC 8 6 75. 00
S256 GGTGCT CCGT 10 8 80. 00
S461 CCCG TTGCCT 9 6 66. 67
S477 GTGGGCTGAC ACCTCGGCAC 10 8 80. 00
S164 GGCTGCGACA 8 5 62. 50
S440 GGGCGGTACT 6 4 66. 67
S508 GGACACCACT 8 4 50. 00
S466 CCGCTACCGA 10 5 50. 00
S250 AGGCTGGGTG 10 7 70. 00
S285 C TGCT TAGGG 6 3 50. 00
S392 10 9 90. 00
S359 7 5 71. 43
S304 10 8 80. 00
S498 8 4 50. 00
S356 8 7 87. 50
总数 176 119 67. 61
平均 9 6 67. 61
　注:表内空白处保密
2.3　卫矛属植物 RAPD聚类分析　利用 UPGMA 统
计软件对20个有效引物在4种卫矛属植物 DNA中扩
增产生的条带进行分析 ,得到的 4种卫矛属植物间的
遗传距离矩阵如表 2 ,DNA分子聚类结果如图 3。
　　从遗传距离可以看出 ,4种卫矛属植物可以分为两
大组:第一组为北海道黄杨和扶芳藤 ,第二组为大叶黄
杨和金心黄杨。大叶黄杨与金心黄杨的遗传距离最近
2007 年第 1 期 葛秀秀 等:4 种卫矛属园林植物的 RAPD 分析 3　
为0.72 ,大叶黄杨与扶芳藤遗传距离最远为0. 30。
图 2　卫矛属 4 种样品 DNA的 PCR扩增图谱
Fig. 2　PCR products of 4 species in Celastraceae
表 2　4 种卫矛属植物间遗传距离矩阵
Tab. 2　Genetic distance matrix among 4 species in Celastraceae
北海道黄杨 大叶黄杨 金心黄杨 扶芳藤
北海道黄杨 1
大叶黄杨 0. 33 1
金心黄杨 0. 37 0. 72 1
扶芳藤 0. 44 0. 30 0. 42 1
图 3　卫矛属 4种植物的分子聚类图
Fig. 3　DNAmolecular dendrogram of 4 species in Celastraceae
3　讨论
3. 1　卫矛属植物基因组 DNA的提取问题　基因组
DNA 的获得是 RAPD 分析的关键 ,本试验采用改
良的 CTAB 法提取卫矛属植物 DNA ,经电泳检测
后 ,证明所提取的 DNA纯度 ,大小和长度适合用于
RA PD 分析 。只是在提取 DNA 过程中未加入
RNA 酶去除 RNA ,故在电泳图中能看到明显的
RNA 痕迹 ,但并不影响 PCR结果。
3. 2　RAPD标记的稳定性问题　RAPD标记涉及
的 PCR动力学和扩增特征复杂 ,扩增带的多少和强
弱会受反应系统诸多成分和扩增程序的影响 ,在
PCR反应过程中变性 、退火 、延伸的温度和时间 ,反
应循环数 ,反应体系中模板 DNA 的纯度和浓度 ,各
种试剂的来源和浓度等诸多因素都会对其结果产生
影响[ 4] 。因此 ,在试验过程中尽量保持各个环节的
稳定性和一致性 ,获得稳定重复的结果 。
3. 3　RAPD用于卫矛属植物分析的可行性　本试
验选用 4种卫矛属植物 ,结果显示 ,供试材料的基因
组 DNA 扩增谱带多态性为 67. 61%,材料之间多态
性较强。不同的样品进行 RAPD分析 ,必须使用一
定数量的引物 ,目前绝大多数研究至少用 13 个引
物[ 2] 。陈亮[ 3]等在进行聚类分析时发现 ,引物数量
不一定多 , 但多态性要高 。本研究对 4 个样品作
RA PD分析 ,所采用的 20个引物都能扩出一个或几
个供试材料的特异谱带 ,从分子生物学方面为卫矛
属植物的多样性研究提供材料和基础 。植物形态上
的多样性 ,如果是遗传多样性上的表现 , 可以通过
RA PD-PCR技术高效检测出来。本研究用 RAPD
技术采用 20个引物客观揭示卫矛属植物的遗传多
样性 。可见 , RAPD 分析是一种有效可行的品种分
类鉴定 、品种名称登记注册 、专利保护及种子纯度测
定的理想方法 。
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