全 文 ：　　收稿日期: 2000-10-26
　　基金项目: 湖南省教育委员会资助项目 ( 97B028)
　　作者简介: 于晓英 ( 1968-) ,女 ,汉族 ,湖南绥宁人 ,湖南
农业大学讲师 ,在读硕士 .
　　文章编号: 1007-1032( 2001) 01-0041-03
萱草种质资源扩增片段长度
多态性鉴别与分类的研究
Ⅰ .萱草 DNA模板的制备
于晓英 ,吴铁明 ,彭尽晖 ,吕长平 ,张宏志 ,丁江南
(湖南农业大学植物科学技术学院 ,湖南 长沙　 410128)
摘　要: 为了获得萱草清晰的 AFLP指纹图谱并进一步进行萱草种质资源的鉴别与分类研究 ,以大花萱草为试材 ,
用改进后的 SDS法和 CTAB法 ,从萱草的幼叶、成熟叶、新根等部位提取 DN A.结果表明 ,用这两种方法均可从萱
草的幼叶、成熟叶、新根中获得高分子量基因组 DN A和 AFLP指纹图谱 ,其中以幼叶的 DN A产量和品质最好 ,
C TAB法提取的 DN A纯度较高且程序简单 .
关　键　词: 萱草 ;扩增片段长度多态性 ;脱氧核糖核酸
中图分类号: S682. 1+ 90. 1　　　文献标识码: A
Identification and Classification of Hemerocal lis
Resources w ith AFLP M olecular Markers
Ⅰ . M aking of DN A Template
YU Xiao -ying ,WU Tie -ming ,PENG Jing -hui ,Lǜ Chang -ping ,ZHANG Hong -zhi ,DING Jiang -nan
( Colleg e o f Plant Science and Tech no lo gy , HN AU , Chang sha　 410128, PRC)
Abstract: To obtain clear Ampli fied f ragment leng th po lymo rphism ( AFLP) fing erprints of
Hemerocal li s for the identification and classification o f i t s germsplasm resources, studies w ere
made on DN A o f Hemerocal li s obtained from the spire, climax leaf , new root , etc. by using the im-
proved methods of SDS and CT AB. The results show that high molecule w eigh t DN A and AFLP
fingerprints can be obtained from these org ans by using the two methods.
Key words: Hemerocalli s; amplified f ragment leng th po lymo rphism; deoxy ribonucleic acid
　　萱草 Hemerocall is L.隶属于百合科、萱草属 ,
也称为“忘忧草” ,它对环境有较强的适应性 ,其花形
秀美 ,叶色翠绿 ,是世界各国人民普遍喜欢的花卉 ,
其花朵在有些国家还作为筵席上的佳肴和医疗上的
良药 [1 ] .原产于中国的萱草种类有 11种 [2 ] ,但被充
分利用的却很少 ,对其遗传分化及多样性也知之不
多 ,运用 AFLP技术从分子水平上进行萱草种质资
源的鉴别及遗传多样性的分析 ,有助于推动萱草类
花卉育种工作的进程 ,也为萱草种质资源的保存、引
种、驯化及遗传改良 ,合理利用提供科学依据 .
扩增片段长度多态性 ( Amplified f ragment
Leng th polymo rphism , AFLP)的基本原理 [3 ]是选择
性扩增带有人工接头的 DNA酶切片段 ,不同基因
型 DNA的酶切位点不同 ,从而产生了扩增片段的
长度多态性 .它在许多观赏园艺植物如月季 [ 4 ] ,黑麦
草 [5 ] ,蔓陀罗 [6 ]等上都有成功的应用 ,但在萱草上少
见报道 .在进行 AFLP分析时 ,首先要制备高分子
量 ( HMW )基因组 DNA,且是 AFLP成功的关
键 [3 ] ,在制备过程中要特别注意避免核酸酶对 DNA
的降解 .就此进行了适于萱草种质资源 AFLP鉴别
的 DNA模板制备的研究 ,现将结果报道如下 .
第 27卷第 1期 湖南农业大学学报 (自然科学版 ) 　 Vol. 27 No. 1
2001年 2月 Journa l o f Hunan Agricultur al Univ er sity ( Natura l Sciences) Feb. 2001
DOI : 10. 13331 /j . cnki . jhau. 2001. 01. 012
1　材料和方法
　　试验于 2000年在广东省农业科学院进行 .
1. 1　材　料
　　植物材料来自湖南农业大学园艺系教学花圃中
的大花萱草 H.middendorf f i Trall tv . et M ey ,
以其幼叶、成熟叶 、新根为试材 ,取样后立即于
- 20℃保存备用 .
主要试剂: SDS(十二烷基硫酸钠 ,国产 )提取缓
冲液 [100 mmo l /L Tris-HCl ( pH 8. 0) , 50 mmol /L
EDTA( pH 8. 0) , 500 mmo l /L NaCl, 10 mmo l /Lβ -
巯基乙醇 , 3% SDS, 20 mmo l /L Na2 S2O5 , 1%
PV P] , CT AB(溴化十六烷基三甲基铵 , SIGMA公
司产品 )提取缓冲液 [2% CTAB, 100 mmol /L Tris-
HCl [ ( pH 8. 0) , 20 mmol /L EDTA ( pH 8. 0) , 1. 4
mol /L NaCl , 1% PV P, 20 mmol /L Na2 S2O5 , 2% β -
巯基乙醇 ] ,氯仿 - 异戊醇 (体积比为 24∶ 1)溶液 ,
Taq DN A聚合酶 (宝生物工程有限公司 ) , RNase
A, Bovine Pancreas(华美生物工程公司 ) .
1. 2　方　法
　　 SDS法:快速称取 0. 3 g左右上述萱草组织 ,置
于陶瓷研钵中加液氮磨成粉状后移入 1. 5 mL离心
管中 ,立即加入 800μL SDS提取缓冲液混匀 ,置于
65℃水浴中温育 45 min, 4℃以 12 000 r /min离心
2 min,小心地将上清液转入另一 1. 5 mL离心管
中 ,加入等体积的氯仿 -异戊醇溶液抽提 1次 (若上
清液比较混浊 ,则需用此溶液再抽提 1～ 2次 ) ,再将
上清液小心地转入新的 1. 5 mL离心管中 ,每管中
加入 1 /10量的 5 mol /L CH3 COONa和等体积预冷
的 ( - 20℃ )异丙醇 ,充分混匀后 ,静置 50 min左右
( 4℃ ) , 4℃以 12 000 r /min离心 5 min,弃上清液 ,
沉淀用 0. 5 m L( 37℃ ) 1 mol /L CsCl充分溶解后
再加入 1 mL冷乙醇 (- 20℃ )混匀 , 4℃静置 1 h左
右后 ,挑出丝状或絮状的 DNA置于新的 1. 5 mL离
心管中 ,用 70%乙醇冲洗 2次并用预冷的无水乙醇
( - 20℃ )冲洗 ,吹干 ,用 400μL无菌水 ( 37℃ )充分
溶解 ,加 1μL 10 mg /mL RNase, 37℃水浴 30 min,
加入 25μL 5 mol /L NaCl混匀后再加入 900μL冷
乙醇 ( - 20℃ )混匀 ,待白色絮状物 (或丝状物 )出现
后 , 4℃以 12 000 r /min离心 5 min,收取沉淀 ,用
70%乙醇将沉淀冲洗两遍 ,用无水乙醇 ( - 20℃ )过
1次 ,吹干后 ,用 2 0 0μL无菌水充分溶解 ,置于
- 20℃贮存备用 .
　　 CTAB法:所用的提取缓冲液为 CTAB,基本步
骤与 SDS法相似 .
紫外光分光光度法分析:取 10μL DNA样用无
菌水稀释 200倍 ,在 FMN8-01紫外光栅分光光度
计上测 A260 , A280和 A230 .
电泳分析:分别取 5μL DNA样液和 EcoR1 /
msel双酶切产物分别在 0. 7%和 10%的琼脂糖凝
胶 (含 EB)上电泳 ,在 FO TO /uv21紫外灯上观察 ,
照相检测 DNA质量和酶切效果 .取 3μL选择性扩
增产物在 7%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳 ,放射自显
影后观察 ,照相检测 DNA多态性 .
PCR扩增反应:模板 DNA的限制性酶切 ,接头
的连接 ,预扩增反应 ,选择性扩增都按照 GIBCO
BRL的 AFLP试剂盒 ( AFLP Analysis System l)产
品说明书在 BIORAD公司产的 PAC3000型 PCR
仪上进行 .
2　结果与分析
2. 1　不同植物体部位的 DNA品质与产量
　　核酸的嘌呤 ,嘧啶中有共轭双键 ,对紫外光有强
烈的吸收 ,天然双链 DNA A260 /A280应在 1. 8左右 ,
低于此值则说明制剂中蛋白质可能未除尽 ,高于此
值则说明制剂中还有 RNA. A260 /A230应大于 2,比
值小说明制剂中可能残存核苷酸、氨基酸、酚等小分
子杂质 [7 ] .从表 1可以看出 ,萱草幼叶 DNA提取率
和纯度最高 ,所含蛋白质 ,小分子杂质最少 ,新根的
DNA提取率虽高于成熟叶 ,但所含杂质也高于成熟
叶 . AFLP反应对模板 DNA浓度不是很敏感 ,在 25
ng甚至 25 pg时均可观察到多态性 [ 8] , 因此从这 3
个植物体部位提取的 DNA量足以进行 AFLP分
析 ,然而考虑到试验的精确性和取材的方便性 ,最好
是以 DNA含量较大且纯度较高的幼叶为材料 .
表 1　不同方法及不同部位提取萱草 DNA结果
Table 1　Quanti ty and quali ty of DNA extracted from di ffer -
ent plant organs of Hemerocallis with different
methods
方法 部位 A230 A260 A280 A260/A 280
A 260
/A 230
样液质量浓度
SDS 新根 0. 065 0. 115 0. 073 1. 575 1. 769 1. 150
幼叶 0. 071 0. 135 0. 083 1. 627 1. 901 1. 350
成熟叶 0. 050 0. 090 0. 056 1. 607 1. 800 0. 900
CT AB 新根 0. 038 0. 071 0. 043 1. 651 1. 651 0. 710
幼叶 0. 045 0. 091 0. 052 1. 784 2. 022 0. 910
成熟叶 0. 032 0. 064 0. 037 1. 730 2. 000 0. 640
　　 SDS法 , CT AB法分别抽提 2, 1次 ;样液单位为μg /μL.
42 湖南农业大学学报 (自然科学版 ) 2001年 2月　
2. 2　不同提取方法对 DNA品质与产量的影响
　　在 SDS法提取过程中 ,用氯仿 -异戊醇溶液抽
提 1次时 ,上清液比较混浊 ,必需再纯化 1～ 2次 ,否
则所提的 DNA会含有较多蛋白质和小分子杂质
(图 1) ,这种被污染的 DNA经 Eco R1 /Msel酶切后
通过琼脂糖凝胶电泳不会形成均匀模糊的条纹 (图
2) ,它们经选择性扩增后也不能形成 AFLP指纹图
谱 (图 3) .而 CTAB法提取过程中 ,用氯仿 -异戊醇
溶液抽提 1次时 ,上清液已非常清澈 ,继续后面步骤
所得的 DNA杂质含量少 ,经双酶切后可形成均匀
模糊的条纹 ,选择性扩增后也能形成清晰的 AFLP
指纹 (图 1～ 3) .从表 1也可以看出 , SDS法提取的
DNA纯度不如 CT AB法的高 ,但 SDS法提取的
DNA量将近 CT AB法提取 DNA量的 2倍 .两种方
法所提取的 DNA片段大小一致 ,在 20 kb左右 (图
1) .分别以两种方法提取的 DNA模板 ,进行限制性
酶切 ,预扩增 ,选择性扩增 ,电泳 ,所得的结果基本相
似 (图 1～ 3) ,说明两种方法提取的 DNA都可直接
用于 AFLP分析 .
1. C TAB法 (抽提 1次 ) ; 2. SDS法 (抽提 1次 ); 3. SDS法 (抽
提 3次 ) ; 4. SDS法 (抽提 2次 ) ; M. DNA Marker
图 1　萱草叶片 DNA电泳图
Fig . 1　Electrophoresis of leaf DNA of Hemerocallis
M. DN A Marker; 1. CTAB法 (抽提 1次 ,幼叶 ) ; 2. SDS法
(抽提 4次 ,根 ) ; 3. SDS法 (抽提 3次 ,幼叶 ) ; 4. SDS法 (抽
提 2次 ,成熟叶 ); 5. CTAB法 (抽提 2次 ,成熟叶 ) ; 6. C TAB
法 (抽提 1次 ,根 ) ; 7. SDS法 (抽提 1次 ,幼叶 )
图 2　萱草 DNA双酶 (EcoR 1 /Msel )切电泳电结
Fig . 2　Electrophoresis of double enzyme EcoR 1 /Mse 1 di -
gestion of DNA of Hemerocallis
2x: SDS法 (抽提 3次 ); 3x: SDS法 (抽提 1次 ) ; 4x: SDS法
(抽提 2次 ) ; 5x: CT AB法 (抽提 1次 ) ; T: 对照
图 3　萱草 AFLP指纹
Fig . 3　AFLP fingerprints of Hemerocallis
3　讨　论
　　以萱草的新根、幼叶、成熟叶为材料 ,用改进后
的 CT AB法、 SDS法均获得了高分子量基因组
DNA,其中 CT AB法提取的 DNA纯度较高且程序
简单 .虽 SDS法提取的 DNA所含杂质较 CT AB
多 ,但可以增加 1～ 2次氯仿 - 异戊醇抽提来纯化
DNA,且 SDS比 CTAB便宜 ,在没有 CT AB的情况
下 ,完全可以用 SDS代替 .本研究还获得了清晰的
AFLP指纹图谱 ,为 AFLP技术在萱草种质资源上
的进一步研究与应用打下了基础 .
(待　续 )　　
参考文献:
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43　第 27卷第 1期 于晓英等　萱草种质资源扩增片段长度多态性鉴别与分类的研究 (Ⅰ )