全 文 ：中国农业科学 2014,47(2):334-343
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.013

收稿日期：2013-05-22；接受日期：2013-08-26
基金项目：国家“十二五”科技支撑项目（2013BAD02B02-3）、国家自然科学基金项目（30971992）、广东省科技计划项目（2012B091100169, 2012NL010）
联系方式：曾继吾，Tel：020-38765008；E-mail：jiwuzeng@163.com。通信作者钟广炎，Tel： 020-38765087；E-mail：gy_zhong@163.com。通信作
者易干军，Tel：020-38765869；E-mail：yiganjun@vip.163.com。


野生‘龙门香橙’的植物学特征观察及起源研究
曾继吾，姜 波，吴 波，钟 云，程春振，母红娜，甘廉生，彭成绩，钟广炎，易干军
（广东省农业科学院果树研究所/农业部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室，广州 510640）

摘要：【目的】广东省龙门县境内南昆山主峰天堂顶海拔 1 000 m 处有当地称之为‘龙门香橙’的野生柑橘，
论文拟从形态学和 DNA 分子证据上探讨其与已知柑橘资源的异同，为合理利用该资源奠定基础。【方法】实地调查
‘龙门香橙’的生长环境，观察记录叶、花、果实的形态特征。分析果实的可溶性固形物、糖、酸和抗坏血酸含
量。在电子显微镜下观察花粉的显微特征。对比分析包括‘龙门香橙’在内的 24 个柑橘资源的 AFLP 图谱以及 10
个资源的 8个 SNP 位点的基因型。克隆、测序分析‘龙门香橙’的β-胡萝卜素羟化酶（β-carotene hydroxylase，
CHX）基因的 2个等位基因，并与其他柑橘材料的 CHX 基因序列进行比对。【结果】生境调查结果表明‘龙门香橙’
非人工种植，是真正的野生柑橘。其果实、种子的形状和单胚等特征与柚类相似，但果实与柚相比明显偏小、出
汁率与可食率很低、味苦等性状提示其比较原始。叶片形状、线形翼叶、花丝联合等特征类似宽皮柑橘类，比较
进化；但花丝和新叶染有紫红色等性状则比较原始。基于 AFLP 图谱的聚类分析显示其不与其他研究材料聚类，但
介乎橘柚之间。8 个 SNP 分子标记分析结果显示，‘龙门香橙’的 3 个 SNP 位点为宽皮柑橘纯合基因型，1 个位点
为橘柚杂合基因型，其余 4个位点为柚子纯合基因型，这种基因型组合不同于其他任何所分析的材料。‘龙门香橙’
的 CHX 基因的核苷酸序列显示其 2 个等位基因间相互差异较小，且含有其他已知柑橘 CHX 基因上未发现的 SNP。
CHX 基因序列进化分析结果表明其与其他柑橘的遗传距离较远、差异似达种间水平。【结论】‘龙门香橙’是一个真
正的野生柑橘资源。其形态性状兼具原始与进化特征。在DNA分子水平上，‘龙门香橙’与已知柑橘不同，甚为独特。
关键词：野生资源；‘龙门香橙’；扩增片段长度多态性（AFLP）；单核苷酸多态性（SNP）；聚类分析

Morphological and Molecular Studies on a
Wild Citrus ‘Longmen Xiangcheng’
ZENG Ji-wu, JIANG Bo, WU Bo, ZHONG Yun, CHENG Chun-zhen, MU Hong-na,
GAN Lian-sheng, PENG Cheng-ji, ZHONG Guang-yan, YI Gan-jun
(Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of South Subtropical
Fruit Biology and Genetic Resource Utilization，Ministry of Agriculture of China, Guangzhou 510640)

Abstract: 【Objective】 Wild citrus plants are growing in the Nankun mountain, Longmen county, Guangdong Province, which
is named ‘Longmeng Xiangcheng’ by the locals. This study aimed to reveal the genetic differences between ‘Longmeng Xiangcheng’
and other citrus species by using morphological and molecular analysis. 【Method】The habitat environment of ‘Longmen
xiangcheng’ was investigated, and the morphology of leaf, flower and fruit was described. Fruit were analyzed for content of total
soluble solid, sugar, titratable acid and ascorbic acid. Pollens were observed under scanning electronic microscope. The
phylogenetic relationship between ‘Longmen xiangcheng’ and other citrus species was investigated using AFLP and SNP markers.
The two alleles of β-carotene hydroxylase gene (CHX) were cloned, sequenced and compared with those of other citrus. 【Result】
The natural habitant environment of ‘Longmeng Xiangcheng’ indicates that it is truly a wild citrus. ‘Longmeng Xiangcheng’
2期 曾继吾等：野生‘龙门香橙’的植物学特征观察及起源研究 335
resembles to pummelo in fruit and seed morphology and is also mono-embryonic. But it is smaller than pummelo in size,
extremely low content of juice and edible portion, and bitter taste of the fruit indicates that it is more primitive. Its lanceolate
leaves, linear leaf wings and united filaments show clearly similarities to those of mandarins. However, its young leaves, young
flowers, and filaments are tinged with purple, indicating its primitiveness. The phylogenetic tree based on AFLP profiles show
that it is not clustered with any of the other 23 analyzed citrus, though it is placed in between pummelos and mandarins. The
genotyping results showed that its genotypes at 3, 1, 4 of the 8 SNP loci are mandarin homozygotes, mandarin-pummelo
heterozygote, and pummelo homozygotes, respectively, and no other analyzed citrus accessions contained such a unique
combination of genotypes. The CHX gene sequence data revealed that ‘Longmen Xiangcheng’ possesses two very similar alleles
carring some very unique SNPs not found in any known citrus CHX gene sequences. Phylogenetic analyses based on CHX gene
sequences showed that ‘Longmeng Xiangcheng’ is distant from other citrus, and ‘Longmen Xiangcheng’ can be placed as an
independent clade in trees.【Conclusion】‘Longmen Xiangcheng’ is truly a wild citrus. Its morphology is characterized by possessing
with both primitive and advanced traits. It is quite unique and different from any known citrus as reveled by molecular DNA data.
Key words: wild citrus; Longmen Xiangcheng; amplified fragment length polymorphism (AFLP); single nucleotide
polymorphisms (SNP); phylogenetic analysis

0 引言
【研究意义】柑橘在长期的自然演化过程中，产
生大量的自然杂种和遗传变异材料。这些材料是柑橘
育种的重要资源[1]。【前人研究进展】叶荫民等[2]于
20 世纪 70 年代在云南红河县发现了野生柑橘红河大
翼橙（Citrus hongheensis Y. M. Ye, X. D. Liu, S. Ding,
et M. Q. Liang）。研究表明红河大翼橙翼叶宽而长，
是原始柑橘种质资源。Yang 等[3]利用 ISSR 分子技术
研究红河大翼橙的 6个居群，发现大翼橙居群间表现
出较高水平的遗传分化。贺善文[4]对湖南道县野橘
（Citrus daoxianensis S. W. He & G. F. Liu）进行了
研究，认为其是真正柑橘亚属宽皮橘类的近缘野生
种。更多的学者对湖南野生柑橘资源进行了同工酶[5]、
血清学[6]、孢粉学[7]和核型[8]分析。廖振坤等[9]利用
AFLP标记技术对莽山野橘（Citrus mangshanensis S.
W. He et G. F. Liu）、道县野橘、江永野橘及印度野
橘等材料进行了鉴定，证明它们在分子水平上存在
一定差异。李俊峰等[1]应用倍性检测、形态学标记
和 AFLP、cpSSR、nSSR 等方法对秭归橘橙进行鉴
定，认为秭归橘橙的母本为甜橙（Citrus sinensis [L.]
Osbeck），父本为橘类（C. reticulata Blanco）。Fang
等[10]利用 22 个 ISSR 标记分析 68 个柑橘栽培品种
（系），可鉴别出部分亲缘关系相近的品种（系）。
【本研究切入点】位于广东省龙门县境内的南昆山，
气候温暖，植物品种资源丰富，其主峰天堂顶海拔
1 000 m附近有 3株野生柑橘（当地称‘龙门香橙’）。
经过连续多年对该资源实地观察，同时取枝条嫁接
繁殖到广东省农业科学院果树研究所试验果园异地
观察，发现它极其独特。【拟解决的关键问题】本
研究拟从形态学、花粉特征以及 DNA 水平上研究
‘龙门香橙’的特征特性，探讨其起源，以为进一
步开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
‘龙门香橙’生长在龙门县南昆山主峰天堂顶海
拔约 1 000 m处，共发现 3株。2007年冬取枝条嫁接
到广东省农业科学院果树研究所试验果园内。
1.2 形态观察和果实常规品质分析
已连续 3 次到‘龙门香橙’生长点进行考察。
详细观察其生长环境，测量树体。于花期观察花器
官特征。于果实成熟时取果实，带回实验室测量大
小和重量，并按柑橘果实品质常规分析方法分析果
实可溶性固形物（TSS）含量、维生素 C 含量及可
食率等[11]。
1.3 花粉扫描电子显微镜观察
于花期取尚未开放的成熟花蕾带回实验室用戊二
醛进行固定。观察时取出花粉，用 70%酒精清洗，依
次用冰醋酸处理 12 h、醋酸酐与浓硫酸混合溶液（醋
酸酐﹕浓硫酸＝9﹕1）处理 1—2 h、100℃水浴处理 5
min、蒸馏水洗涤 3—4次，最后用 70%酒精洗净。将
花粉贴在样品台上晾干，用 JFC-110进行离子溅射镀
金膜 10 nm，在 JSM-T300 扫描电子显微镜下进行观
察并拍照，测定极轴与赤道轴，根据极轴与赤道轴
评价花粉粒的形状，同时观察外壁厚度和萌发孔数
量[12]，花粉描述参考文献[13]。
1.4 AFLP 分子标记
336 中 国 农 业 科 学 47卷
1.4.1 DNA 提取及 AFLP 扩增 从广东省农业科学
院果树研究所品种资源圃中选取 23 份栽培柑橘品
种作为参照（表 1）。用改良 CTAB 法提取‘龙门
香橙’和参照材料新鲜嫩叶的基因组 DNA[14-16]。使
用北京鼎国生物技术有限公司 FISH-AFLP 试剂盒
进行 AFLP扩增。经过试验，从该试剂盒提供的 64
对引物中筛选出 8 对引物组合（E-ACT/M-CTG、
E-ACT/M-CTC、E-ACT/M-CAA、E-ACA/M-CTT、
E-AAG/M-CTG、E-AAG/M-CTA、E-AAG/M-CAG、
E-AAG/M-CAA）进行 AFLP扩增，获得 AFLP指纹
图谱[17]。

表 1 供试材料
Table 1 Citrus genetic materials used in the study
编号
No.
品种（品系）
Cultivar (line)
学名
Scientific names
1 和平椪柑 Heping ponkan Citrus ponki Hort. ex Tanaka
2 试 18椪柑 Shi 18 ponkan Citrus ponki Hort. ex Tanaka
3 东 13椪柑 Dong 13 ponkan Citrus ponki Hort. ex Tanaka
4 春甜橘 Chuntianju C.reticulata Blanco
5 明柳甜橘 Mingliutianju C.reticulata Blanco
6 沙糖橘 Shatangju C.reticulata Blanco
7 年橘 Nianju C.reticulata Blanco
8 阳山橘 Yangshanju C.reticulata Blanco
9 无刺榕林甜橘 Wucironglintianju C.reticulata Blanco
10 有刺榕林甜橘 Youcironglintianju C.reticulata Blanco
11 因州橘 Yinzhouju C.reticulata Blanco
12 ‘龙门香橙’ ‘Longmen xiangcheng’ -
13 香橼 Xiangyuan C.medica L.
14 石坝蕉柑 Shiba Jiaogan C.tankan Hayata
15 浮优选蕉柑 Fuyouxuan Jiaogan C.tankan Hayata
16 台湾蕉柑 Taiwan Jiaogan C.tankan Hayata
17 塔下蕉柑 Taxia Jiaogan C.tankan Hayata
18 雪柑 Xuegan C.sinensis(L.) Osbeck
19 无核雪柑 Seedless Xuegan C.sinensis(L.) Osbeck
20 HB柚 HB you C. maxima (Burm.) Merr.
21 广西沙田柚 Guangxishatianyou C. maxima (Burm.) Merr.
22 梅花早 Meihuazao C. maxima (Burm.) Merr.
23 梅县沙田柚 Meixianshatianyou C. maxima (Burm.) Merr.
24 奥兰柚 Oroblanco C. maxima x C. paradisii

1.4.2 数据收集与统计分析
① 谱带记录：观察 AFLP荧光谱带，将易于辨认
的条带记为“1”，空缺的记为“0”，得到“0—1”
表。
② 聚类分析：利用 NTSYS-pc2.10e软件对“0—
1”表数据进行分析，采用 Dice 相似系数计算供试柑
橘材料的 AFLP谱带相似性，计算公式如下：
Sij=2Nij/（Ni+Nj）
其中，Nij是 i 品种和 j 品种间共有的条带数，Ni
和 Nj分别是品种 i和品种 j的扩增条带数目。
对计算得到 Dice 相似系数矩阵，采用 UPGMA
（Unweighted pair-group method, arithmetic average，非
加权平均法）进行聚类分析，得到供试材料亲缘关系
树状图。
③ 供试柑橘材料多样性分析：多态性比例（%）
=（总谱带数-共有带数）/总谱带数×100%
1.5 SNP 分型
1.5.1 酸橙EST-SNP筛选 从NCBI EST数据库下载
酸橙（Citrus aurantium L.）所有 EST序列，用 CAP3
拼接序列 [18]，利用QualitySNP预测 SNP分子标记[19]。
下载甜橙基因组序列建立本地 BLAST 数据库。将酸
橙 EST的拼接序列，通过 BLASTN定位到甜橙染色
体上。筛选在不同染色体上或同一条染色体上间隔
5 Mbp以上的 SNP作为检测位点。
1.5.2 高分辨率溶解曲线 SNP 分型 从重庆国家柑
橘圃采集甜橙、代代、瓯柑、春甜橘、汕头酸橘、年
柑、文旦、冰糖柚、蓬溪柚共计 10个柑橘品种以及‘龙
门香橙’的叶片，提取基因组 DNA，在 8 个 SNP 位
点设计高分辨率熔解曲线分型引物，方法参照文献
[20-21]。
1.6 β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase，CHX)
基因测序及进化分析
在前期研究中已获得了橘、柚、香橼、大翼橙、
枳、澳圆檬、澳沙檬、金柑等多个品种的长度为约为
2 000 bp 的 CHX基因 DNA序列（待发表）。同时也
获得了‘龙门香橙’CHX基因的多个克隆，并从中挑
选了 12个克隆送华大基因公司进行单次测序，通过多
重序列比分析，鉴别出‘龙门香橙’中 CHX基因的
2 个不同等位基因及其对应的克隆，然后挑选每个
等位基因的 2 个克隆进行全序列测定。所有序列利
用 ClustalX（version2.0） [22]进行多重比对（Gap
penalty 等采用默认参数），将比对结果提交到
jModelTest （version2.1.4）[23]筛选最适合 CHX 基因
序列的进化模型，然后使用 PAUP version4.0搜索最大
似然树[24]，bootstrap检验次数设为 1 000。
2期 曾继吾等：野生‘龙门香橙’的植物学特征观察及起源研究 337
2 结果
2.1 植物学特性
2.1.1 植株生长特征及周边环境和植被 自然生
长的 3 株‘龙门香橙’位于龙门县南昆山主峰天堂
顶海拔 1 000 m附近。其中，最大一株生长于岩缝中
（图 1-A）。经测定，该树高 9.36 m，冠幅 13.0 m，
主干周长 2.60 m，主干高 0.88 m。其一级主枝有 11
条，疑为原主干折断后从树蔸处萌蘖丛生而成。另两
株较小，与大树相隔 10 m左右，疑似大树的实生后代。
周围植被中有中华润楠、沉水樟、秀毛含笑、红果穗
花衫、狗牙椎、桫椤、红杜鹃、紫杜鹃、山龙眼、淡
竹叶等植物，其中中华润楠较多。
2.1.2 叶片特征 叶片披针形，平均长 12.98 cm、宽
4.38 cm。翼叶长 0.77 cm，宽 0.3 cm。叶柄长 1.35 cm，
翼叶线形。叶面较平展、深绿色，叶背浅绿，叶脉明
显。叶基圆或阔楔形，叶尖渐尖、常偏向一侧、凹口
模糊。老树叶片被稀疏茸毛，幼树嫩枝、叶片、主侧
脉及叶缘密被茸毛（图 1-B）。新梢嫩叶完全老熟之
前呈浅紫色（图 1-C）。枝条具硬刺。
2.1.3 花特征 野生‘龙门香橙’树 4月中旬开花。
广州嫁接树 3月中下旬开花。
花白色，直径 1.5 cm，花柄长 1.2 cm。萼片 5，长
0.5—0.9 cm，黄绿色。花瓣长 1.2 cm，中部宽 0.8—0.9 cm。



A：植株形态；B：叶片正反面（秋梢）；C：春梢新梢与嫩叶；D—E：花的形态特征；F：成熟果实；G：种子
A: A wild longmen xiangcheng plant growing out of rocks; B: Upper and lower blades of leaves from Autumn flushes; C: Spring flushes and leaves that were
tinged with purple color; D-E: Flowers, petals and stamens, note the filaments of the stamens united into bundles; F: Mature fruit and their cross sections; G:
Seeds

图 1 ‘龙门香橙’的形态学特征
Fig. 1 The morphological characters of Longmen Xiangcheng
338 中 国 农 业 科 学 47卷
雄蕊 18枚，花丝基部联合成 4束、中下部染紫红色。
花药黄色，长卵形。柱头圆形，高 0.2 cm，宽 0.4 cm，
浅黄褐色。子房绿色，横径 0.5 cm，高 0.4 cm。蜜盘发
达，浅黄色（图 1-D和图 1-E）。
2.1.4 果实特征 野生‘龙门香橙’果实 12 月中旬
成熟。成熟果实芳香浓郁。果实扁圆形，黄色，果面较
粗，有茸毛，平均单果重 141.6 g，纵径 6.2 cm，横径
7.4 cm，果形指数 0.84。囊瓣半月形，中心柱 1.3 cm×1.4
cm。种子多，每果平均 57 粒（图 1-F）。果实出汁
率 15.4%，可食率 15.38%。果汁可溶性固形物 10.0%，
维生素 C 5.6 mg·mL-1，味极酸、苦。
2.1.5 种子特征 种子大，平均重 0.56克/粒，楔形
（图 1-G）。种皮有棱状网纹，淡黄色。单胚，子叶
白色。
2.2 花粉超微结构特征
采用扫描电子显微镜分别观察了‘龙门香橙’、
四季橘、沙田柚花粉形态。由表 2可知，‘龙门香橙’
花粉的极轴和赤道轴大小介于四季橘和沙田柚之间，
花粉萌发孔形状与沙田柚类似，但两者大小相差较大，
花粉外壁纹饰网眼比四季橘和沙田柚都大，差异明显。

表 2 柑橘花粉扫描电镜比较结果
Table 2 Pollen morphology of Longmeng Xiangcheng and two pummelos under scanning electron microscope
名称
Cultivar (line)
极轴
Polar axis (µm)
赤道轴
Equatorial axis (µm)
极轴/赤道轴
P / E
外壁纹饰
Exine ornamentation
萌发孔
Aperture
‘龙门香橙’
‘Longmen xiangcheng’
21.28±0.85
（20.1-22.8）
21.56±1.25
（18.8-23.2）
0.99 网眼大、脊宽
Large meshes, wide ridges
萌发孔两端扩大、萌发沟浅
Enlarged towards its two ends, low germinal furrow
四季橘
Sijiju
20.94±1.02
（19.1-22.8）
20.6±1.10
（18.2-21.6）
1.02 网眼小、呈陷点状
Small meshes, pitted
萌发孔两端尖、萌发沟深
Two tapering ends, deep germinal furrow
沙田柚
Shatianyou
23.54±1.01
（22.2-25.7）
23.02±1.2
（21.9-25.5）
1.02 网眼小、呈陷点状
Small meshes, pitted
萌发孔两端扩大、萌发沟浅
Enlarged towards its two ends, low germinal furrow

2.3 AFLP 分析
8对 AFLP引物扩增的指纹图谱见图 2，可见所有
供试材料的谱带有较好的多态性。采用 UPGMA法进
行聚类分析，获得了供试材料的 AFLP谱带相似性聚
类图（图 3）。在 Dice相似系数为 0.70时，可将供试
材料划分为 5大类：
I 类：和平椪柑、试 18 椪柑、东 13 椪柑、春甜
橘、明柳甜橘、沙糖橘；年橘，有刺榕林甜橘、无刺
榕林甜橘、因州橘（英德）、阳山橘；
II类：‘龙门香橙’；
III类：包括浮优选蕉柑、台湾蕉柑、石坝蕉柑、
塔下蕉柑、雪柑、无核雪柑；
IV类：包括沙田柚（广西）、沙田柚（梅县）、
梅花早、奥兰柚；
V类：香椽。
可见，‘龙门香橙’不与橘类、柑类、橙类、柚
类聚类，而是独成一类，介于橘柚之间。
2.4 SNP 分型结果
利用从酸橙中获得的 8个 EST-SNP（表 3）对‘龙
门香橙’及甜橙、酸橙、橘、柚等共 10个柑橘材料进
行小片段扩增法高分辨率熔解曲线分型（图 4）。结
果显示，‘龙门香橙’在 7个 SNP位点上是纯合子，
仅在 JY12548-179位点上杂合。而甜橙和代代酸橙分
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23


图2 24份柑橘品种的AFLP指纹图谱（引物E-AAG+M-CAA）
Fig. 2 AFLP fingerprinting of 24 citrus genotypes using
primer E-AAG+M-CAA

别有 7个和 8个杂合位点，橘、柚在几乎所有位点上
分别为不同的纯合基因型（表 3）。
进一步比较发现，‘龙门香橙’在 JY15260-335 A/A、
JY12158-461 C/C、JY10670-55 T/T这 3个 SNP位点
2期 曾继吾等：野生‘龙门香橙’的植物学特征观察及起源研究 339

图 3 柑橘品种 AFLP 聚类分析树状图
Fig. 3 Phylogenetic tree of 24 citrus accessions and Longmeng Xiangcheng based on AFLP data
68 70 72 74 76 78 80 82 84
温度 Tenperature (℃)
68 70 72 74 76 78 80 82
74 76 78 80 81797775737271
74 76 78 80 81797775737271
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
-0.05
荧
光
强
度
(已
标
准
化
)
Fl
ou
re
sc
en
t s
ig
na
l
(n
or
m
al
iz
ed
)
d
(荧
光
强
度
)/d
(温
度
)
d
(F
lo
ur
es
ce
nt
si
gn
al
)/d

(te
m
pe
ra
tu
re
)
d
(荧
光
强
度
)/d
(温
度
)
d
(F
lo
ur
es
ce
nt
si
gn
al
)/d

(te
m
pe
ra
tu
re
)
荧
光
强
度
(已
标
准
化
)
Fl
ou
re
sc
en
t s
ig
na
l
(n
or
m
al
iz
ed
)
a
b
c
d

a和 c分别是 JY23611-450 和 JY10670-55两个 SNP位点上的标准化熔解曲线，b和 d是这两个 SNP位点上荧光信号对温度的一阶导数图
Panel a and panel c are the normalized melting curves on JY23611-450 and JY10670-55, respectively, and panel b and panel d are the corresponding derivative
melting curves

图 4 高分辨率熔解曲线 SNP 分型
Fig. 4 SNP genotyping using high resolution melting curves
340 中 国 农 业 科 学 47卷
表 3 包括‘龙门香橙’在内的 10 个柑橘样本在 8个 SNP 上的基因型
Table 3 Genotypes of 10 citrus accessions including Longmeng Xiangcheng at 8 SNP loci
SNP 甜橙
Sweet
orange
代代
Daidai sour
orange
‘龙门香橙’
‘Longmen
xiangcheng’
瓯柑
Ougan
春甜橘
Chuntianju
汕头酸橘
Shantousuangju
年柑
Niangan
文旦
Wendan
冰糖柚
Bingtangju
蓬溪柚
Pengxiyou
JY15260-335 A/G A/G A/A A/A A/A A/A A/A G/G G/G G/G
JY12548-178 T/C T/C T/C C/C C/C C/C C/C T/T T/T T/T
JY12158-461 T/C T/C C/C T/C T/C T/C C/C T/T T/C T/T
JY10912r1-699 A/G A/G G/G A/A A/A A/A A/A G/G A/G G/G
JY10705-395 T/C T/C T/T C/C C/C C/C C/C T/T T/T T/T
JY10670-55 T/G T/G T/T T/T T/T T/T T/T G/G G/G G/G
JY13538-618 A/G A/G G/G A/A A/A A/A A/A G/G G/G G/G
JY23611-450 T/T T/C C/C T/T T/T T/T T/T C/C C/C C/C

上为宽皮柑橘纯合基因型，在 JY12548-178 T/C位点
为橘柚杂合基因型，在其余 4 个位点上（JY10912r1-
699A/G、JY10705-395T/C、JY13538-618A/G、JY23611-
450T/C）为柚子纯合基因型。可见，‘龙门香橙’似
有可能是橘柚杂种，但多位点为纯合基因型排除了其
为橘柚一代杂种的可能性。
2.5 CHX 基因测序分析结果
CHX基因序列的最大似然树显示柑橘属种间分
支节点的 bootstrap值均达到 90，表明结果可靠（图
5）。可见，宽皮柑橘、柚类、枸橼、澳圆檬、枳、
宜昌橙、红河大翼橙、金弹的 CHX 基因分别聚到不
同的进化分支，这与前人基于分子标记研究的结果高
度一致[25]。如果‘龙门香橙’是杂种起源，理论上它
的 2个等位基因（单体型）序列应该分别与橘、柚聚
类，但实际上‘龙门香橙’的 2个单体型单独聚为一
簇，且在进化树上与其它已知柑橘种具有同等的地位，
显示它并非是柑橘属种间杂种。此外，检视‘龙门香
橙’的 CHX 基因的核苷酸，发现其拥有多个极其独
特的未在其他已知柑橘上发现的 SNP。这表明‘龙门
香橙’应该是一个新的柑橘种质。

澳圆檬 1 Australian round lime 1
澳圆檬 2 Australian round lime 2
悬崖野橘 Xuanyayeju
道县野橘 Daoxianyeju
南橘 Daoxianyeju
大坑野橘 Dakengyeju
沙糖橘 Shatangju
龙门香橙 1 Longmenxiangcheng 1
龙门香橙 2 Longmenxiangcheng 2
宜昌橙 1 Ichang bitter orange 1
宜昌橙 2 Ichang bitter orange 2
越南小柚 Yuenanxiaoyou
安江香柚 Anjiangxiangyou
梁平柚 Liangpingyou
早熟红心沙田柚 Zaoshuhongxinshatianyou
红河大翼橙 1 Honghe pepeda 1
红河大翼橙 2 Honghe pepeda 2
金弹 1 Jindan 1
金弹 2 Jindan 2
佛手 1 Finger citron 1
佛手 2 Finger citron 2
大叶大花枳 1 Dayedahuazhi 1
大叶大花枳 2 Dayedahuazhi 2

用最大似然法获得的 CHX基因进化树，节点上的数值是 bootstrap检测重现率，bootstrap支持度低于 50%的分支未显示
Phylogenetic tree was constructed by using Maximum likelihood method. Percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the
bootstrap test (1000 replicates) is shown next to the branches. And branches with bootstrap support lower than 50% were hidden

图 5 柑橘 CHX 基因序列进化树
Fig. 5 Phylogenetic tree based on citrus CHX gene sequences
2期 曾继吾等：野生‘龙门香橙’的植物学特征观察及起源研究 341
3 讨论
位于广东省龙门县境内的南昆山主峰天堂顶海拔
高度为 1 228 m，山上植物资源丰富，森林覆盖率
98.2%。龙门县属于南亚热带季风气候，年平均气温20.8
℃，≥10℃年积温平均为 5 636.9℃，多年平均极端低
温为-1.32℃，霜期短，年日照 1 860 h，年降雨量 2 266.7
mm。可见该地的生态环境条件极其适合柑橘生长，发
现野生野生‘龙门香橙’并不奇怪。
‘龙门香橙’果实外观、香气、种子及种胚、汁
胞颜色等特征与柚类相似。其幼枝、叶片被茸毛，新
梢顶端及幼叶呈浅紫色，这也与部分柚子相似。其花
大，花丝染浅紫色，也类似某些柚子。然而，其叶片
为披针形、翼叶很小，似橘子。花丝联合性状也类似
进化程度较高的橘子。这些形态特征显示其可能为柚
与橘杂种。
AFLP分子标记和 SNP分型分析表明‘龙门香橙’
不同于橘或柚类，而是兼有橘子和柚子的遗传物质。
SNP分型结果显示部分位点为橘纯合基因型，部分位
点为柚纯合基因型，这排除了‘龙门香橙’是橘柚一
代杂种的可能性。
据此，似乎可以认为‘龙门香橙’是橘柚杂种的
自交后代或高代自交后代。
但是‘龙门香橙’CHX基因的 2个等位基因之间
的序列差异较小，与橘、柚种内该基因等位基因间的
差异水平相当。详细的序列分析结果显示这 2个 CHX
的等位基因不是来自橘或柚，甚为独特，在聚类图上
单独聚为一类。该基因的多个 SNP也未在其他已分析
的柑橘上发现。这表明‘龙门香橙’与其他柑橘的 CHX
基因之间的差异应该达到了种间水平。难道‘龙门香
橙’是柑橘属的一个新种？如果是，其种群在哪里？
因为除 3株树外，笔者在野生‘龙门香橙’附近并没
有发现其他个体。柑橘属植物高度杂合[26]，这是因为
柑橘属植物种间无生殖隔离，且多经过珠心胚行无性
繁殖，因此，杂种可以高保真地遗传下来而不会发生
分离。也许‘龙门香橙’是某个原始柑橘种类的孓遗，
但是其种子为单胚，自然条件下应无可能有稳定的遗
传。不过，其 5株实生繁殖后代的营养器官的植物学
特征基本稳定，与母株一致，这似乎又和同是单胚的
柚子、枸橼的繁殖特性相似。
有关‘龙门香橙’的存在和来源问题，龙门县志
无相关记载。龙门县林业局、南昆山学校及南昆山保
护区等单位也无相关信息。据当地居民反映的情况推
测，最大一棵树的树龄超过 150年。大树着生在石缝
中说明它非由人工种植。
近年来，Garcia-Lor 等[25]和 Bernardi 等[27]分别利
用分子进化和分子标记分析进行柑橘分类研究，认为
分子进化分析在柑橘属物种鉴定和区分上具有极高的
效率和可信度。本研究结果也证明 AFLP和 SNP可以
用来区分柑橘种质资源材料，AFLP 谱带把本研究所
用柑橘材料分为 5类，和传统分类结果相似，显示了
其在柑橘分类研究中的应用价值[28]。相比之下，SNP
标记分析结果更为确切，在本研究中把所有材料都清
楚地区分开来了，其应用价值似乎更大，这与笔者前
期的研究结果一致[20,29]。
4 结论
通过形态特征和分子分析手段比较了‘龙门香橙’
和其他柑橘材料之间的异同，认为其为橘柚杂种的高
代自交后代的可能性比较大。但是其 CHX 基因的独
特性难以用橘柚自交后代的可能组合来解释，且与其
他柑橘材料相比，其 CHX 基因的差异达到划分种的
水平。这表明‘龙门香橙’及其独特，其确切起源尚
待进一步研究。

致谢：龙门县科技教育局刘干昆副局长，杨村柑橘研究
所蔡明段研究员，龙门县农业局魏燕雄副局长，龙门县林业
局罗显文高级农艺师，南昆山学校刘志强校长，南昆山保护
区钟金球等同志在样品采集和资料收集上提供了极大的帮
助，在此一并表示感谢。

References
[1] 李俊峰, 向长海, 邓秀新. 柑橘天然杂种秭归橘橙来源探究. 果树
学报, 2009, 26(4): 425-430.
Li J F, Xiang C H, Deng X X. Exploring the origin of natural citrus
hybrid Zigui Tangor. Journal of Fruit Science, 2009, 26(4): 425-430.
(in Chinese)
[2] 叶荫民, 刘晓东, 丁素琴, 梁明清. 云南红河橙-柑橘属大翼橙亚
属的一个新种. 植物分类学报, 1976, 14(1): 57-59.
Ye Y M, Liu X D, Ding S Q, Liang M Q. Citrus hongheensis a new
species found from Subgen. Papeda Swingle in Citrus L.. Acta
Phytotaxonomica Sinica, 1976, 14(1): 57-59. (in Chinese)
[3] Yang Y, Pan Y Z, Gong X, Fan M T. Genetic variation in the
endangered Rutaceae species Citrus hongheensis based on ISSR
fingerprinting. Genetic Resources and Crop Evolution, 2010, 57:
1239-1248.
342 中 国 农 业 科 学 47卷
[4] 贺善文. 柑橘类种质资源中心问题的初步探讨. 园艺学报, 1979,
6(1): 19-24.
He S W. A preminary study of the native citrus in central China. Acta
Horticulturae Sinica, 1979, 6(1): 19-24. (in Chinese)
[5] 李润唐. 湖南野生柑橘同工酶分析. 湖南农学院学报, 1992, 18(4):
923-928.
Li R T. Isozyme analysis of wild loose-skin oranges in Hunan.
Journal of Hunan Agricultural University, 1992, 18(4): 923-928. (in
Chinese)
[6] 陈喜文, 陈梦龙. 湖南柑橘资源的血清学研究. 湖南农学院学报,
1991, 17(4): 714-719.
Chen X W, Chen M L. Study of serology on citrus resources in Hunan.
Journal of Hunan Agricultural University, 1991, 17(4): 714-719. (in
Chinese)
[7] 李润唐. 湖南野生宽皮柑橘花粉形态研究. 湖南农业大学学报,
1998, 24(5): 365-369.
Li R T. A study on the pollen morphology of wild loose mandarins in
Hunan. Journal of Hunan Agricultural University, 1998, 24(5):
365-369. (in Chinese)
[8] 李润唐. 湖南野生宽皮柑橘核型研究. 湖南农业大学学报, 2000,
26(1): 54-57.
Li R T. Karyotype of loose wild mandrins in Hunan. Journal of
Hunan Agricultural University, 2000, 26(1): 54-57. (in Chinese)
[9] 廖振坤, 张秋明, 刘卫国, 丁伟平, 张玲. 南岭山脉宽皮柑橘近缘
野生种亲缘关系鉴定. 湖南农业大学学报: 自然科学版, 2006,
32(6): 385-388.
Liao Z K, Zhang Q M, Liu W G, Ding W P, Zhang L. Identification of
relative relationships of wild relatives of eucitrus originated from
nanling mountains by AFLP analysis. Journal of Hunan Agricultural
University: Natural Sciences, 2006, 32(6): 385-388. (in Chinese)
[10] Fang D Q, Roose M L. Identification of closely related citrus cultivars
with inter-simple sequence repeat markers. Theoretical and Applied
Genetics, 1997, 95: 408-417.
[11] 曾继吾, 曹水良, 姜波, 邓贵明, 钟云, 周碧容, 彭成绩, 易干军.
春甜橘及其芽变品种明柳甜橘特性的比较研究. 热带作物学报,
2012, 33(9): 1568-1573.
Zeng J W, Cao S L, Jiang B, Deng G M, Zhong Y, Zhou B R, Peng C
J, Yi G J. Differences of biological characters between mingliutianju
(Citrus reticuiata Blanco cv.Mingliutianju)and chuntianju (Citrus
reticuiata Blanco cv.Chuntianju). Chinese Journal of Tropical Crops,
2012, 33(9): 1568-1573. (in Chinese)
[12] 叶荫明 , 孔焱 , 郑向明 . 柑橘花粉形态的研究 . 中国农业科学 ,
1982, 5: 62-65.
Ye Y M, Kong Y, Zheng X M. Studies on the pollen morphology of
citrus plants. Scientia Agricultura Sinica, 1982, 5: 62-65. (in Chinese)
[13] 王伟, 赵南先, 胡晓颖. 天南星属植物的花粉形态. 云南植物研究,
2002, 24(4): 497-507.
Wang W, Zhao N X, Hu X Y. Pollen morphology of the genus
arisaema (Araceae). Acta Botanica Yunnanica, 2002, 24(4): 497-507.
(in Chinese)
[14] Pich U. Schabert I. Miniprep method for isolation of DNA from plants
with a high content of polypheolics. Nucleic Acids Research, 1993,
21(14): 332.
[15] Stewart C N, Via L E. A Rapid CTAB DNA isolation technique
useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications. Biology
Techniques, 1993, 14(5): 748-749
[16] Porebski S, Bailey L G, Baum B R. Modification of a CTAB DNA
extraction protocol for plants containing high polysaccharide and
polyphenol components. Plant Molecular Biology Reporter, 1997,
15(1): 8-15.
[17] 陈华, 易干军, 徐小彪. 应用 AFLP 标记对江西省猕猴桃种质资源
的鉴别及其分类意义. 中国生物化学与分子生物学报, 2007, 23(2):
122-129.
Chen H, Yi G J, Xu X B. Identification of the kiwifruit germplasms in
jiangxi province by AFLP and its classification significance. Chinese
Journal Biochemistry and Molecular Biology, 2007, 23(2): 122-129.
(in Chinese)
[18] Huang X, Madan A. CAP3: A DNA sequence assembly program.
Genome Research, 1999, 9: 868-877.
[19] Tang J, Vosman B, Voorrips R E, van der Linden C G, Leunissen J A
M. QualitySNP: A pipeline for detecting single nucleotide
polymorphisms and insertions/deletions in EST data from diploid and
polyploid species. BMC Bioinformatics, 2006, 7: 438.
[20] 吴波, 杨润婷, 朱世平, 钟云, 姜波, 曾继吾, 钟广炎. 宽皮柑橘单
核苷酸多态性的高分辨率熔解曲线分型, 园艺学报, 2012, 39(4):
777-782.
Wu B, Yang R T, Zhu S P, Zhong Y, Jiang B, Zeng J W, Zhong G Y.
Genotyping single nucleotide polymorphisms in mandarin cultivars
using high resolution melting analysis. Acta Horticulturae Sinica,
2012, 39(4): 777-782. (in Chinese)
[21] Gundry C N, Dobrowolski S F, Martin Y R, Robbins T C, Nay L M,
Boyd N, Coyne T. Base-pair neutral homozygotes can be
discriminated by calibrated high-resolution melting of small
amplicons. Nucleic Acids Research, 2008, 36(10): 3401-3408.
[22] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, Chenna R, McGettigan P A,
McWilliam H, Valentin F, Wallace I M, Wilm A, Lopez R, Thompson
2期 曾继吾等：野生‘龙门香橙’的植物学特征观察及起源研究 343
J D, Gibson T J, Higgins D G. Clustal W and Clustal X version 2.0.
Bioinformatics, 2007, 23: 2947-2948.
[23] Darriba D, Taboada G L, Doallo R, Posada D. jModelTest 2: More
models, new heuristics and parallel computing. Nature Methods, 2006,
9(8): 772.
[24] Swofford D S. PAUP 4.0: Phylogenetic analysis using parsimony
(*and other methods). Version 4b2 Sinauer Associates, Sunderland,
Mass, 1999.
[25] Garcia-Lor A, Curk F, Snoussi-Trifa H, Morillon R, Ancillo G, Luro
F, Navarro L, Ollitrault P. A nuclear phylogenetic analysis: SNPs,
indels and SSRs deliver new insights into the relationships in the ‘true
citrus fruit trees’ group (Citrinae, Rutaceae) and the origin of
cultivated species. Annals of Botany, 2013, 111: 1-19.
[26] Barkley N A, Roose M L, Krueger R R, Federici C T. Assessing
genetic diversity and population structure in a citrus germplasm
collection utilizing simple sequence repeat markers (SSRs).
Theoretical and Applied Genetics, 2006, 112(8): 1519-1531.
[27] Bernardi J, Mazza R, Caruso P, Recupero G R, Marocco A,
Licciardello C. Use of an expressed sequence tag-based method for
single nucleotide polymorphism identification and discrimination of
Citrus species and cultivars. Molecular Breeding, 2013, 31(3):
705-718.
[28] Swingle W T, Reece P C. The Botany of Citrus and Its Wild
Relatives//The Citrus Industry. Webber H J, Batchelor L D. University
of California Press, 1967, 1:190-430.
[29] 杨润婷, 吴波, 李翀, 曾培, 曾继吾, 钟云, 姜波, 周碧容, 钟广炎.
两种 SNP 分型方法的比较及其在柚品种鉴定中的应用. 园艺学报,
2013, 40(6): 1061-1070.
Yang R T, Wu B, Li C, Zeng P, Zeng J W, Zhong Y, Zhou B R,
Zhong G Y. Comparison of allele-specific PCR and high resolution
melting analysis in SNP genotyping and their application in pummelo
cultivar identification. Acta Horticulturae Sinica, 40(6): 1061-1070.
(in Chinese)

（责任编辑 李莉）