全 文 ：书第３５卷　第４期
２０１３年１２月 　 　　　　　
延　边　大　学　农　学　学　报
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｙａｎｂｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　　　　
Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．４
　Ｄｅｃ．２０１３
收稿日期：２０１３－１０－２０　基金项目：延边大学与中国林科院合作研究课题（４１３０９００２５）
作者简介：唐丽娜（１９８７—），女，吉林公主岭人，延边大学农学院，在读硕士。金东淳为通讯作者，
　　　　　 Ｔｅｌ：０４３３－２４３５５５９，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｄｃ１２００＠ｙｂｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
赤松根际土壤微生物ＰＣＲ－ＤＧＧＥ反应体系优化
唐丽娜１，　朴春根２，　杭秋瑜３，　金东淳１＊
（１．延边大学农学院，吉林 延吉１３３００２；２．中国林业科学院，北京１０００９１；
３．龙井市农业局，吉林 龙井１３３４００）
摘要：为建立赤松根际土壤微生物的ＰＣＲ－ＤＧＧＥ反应体系，以赤松根际土壤为材料，利用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术，
对反应体系中的几个重要因素不同梯度进行优化，包括模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ、引物及 Ｍｇ２＋的用量。在２５μＬ
ＰＣＲ反应体系中，模板 ＤＮＡ浓度为１０ｎｇ，ｄＮＴＰｓ浓度为０．１５ｍＭ，引物浓度为０．３２μＭ，Ｍｇ
２＋ 浓度为
１．０ｍＭ时，其ＰＣＲ效果最佳。用该反应体系扩增出来的ＰＣＲ产物，在ＤＧＧＥ凝胶上能够清晰地分辨出赤松
根际土壤细菌和真菌多样性。这为进一步研究赤松根际土壤微生物，特别是研究赤松外生菌根奠定了基础。
关键词：赤松（Ｐｉｎｕｓ　ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ　Ｓｉｅｂ．ｅｔ　Ｚｕｃｃ．）；根际土壤微生物；ＰＣＲ－ＤＧＧＥ；体系优化
中图分类号：Ｓ１５４．３６　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００４－７９９９（２０１３）０４－０３１７－０５
ＤＧＧＥ（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，变性梯度凝胶电泳）是Ｆｉｓｃｈｅｒ和Ｍｅｒｍａｎ于１９７９年最
先提出的，用于检验ＤＮＡ突变的一种电泳技术［１］，这种方法可以检测到一个核苷酸水平的差异。１９９３年，
Ｍｕｚｙｅｒｓ等第一次将ＤＧＧＥ技术［２］应用于微生物群落结构的研究［３］，并证实了这种技术在揭示菌群差异方
面与自然界微生物区系的遗传多样性具有独特的优越性。即使是长度相同，但碱基序列有差异的ＤＮＡ片
段在不同浓度梯度的变性剂 （脲素和甲酰胺）凝胶中电泳，根据部分解离的条件不同，其移动速度不同而得
到分离。通过染色后可以在凝胶上呈现出分散的条带。因此，这种技术可以分辨具有相同或相近分子量的
目的片断序列差异，可以用于检测单一碱基的突变和遗传多样性以及ＰＣＲ扩增ＤＮＡ片段的检测。
赤松（Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ）属于松科松属，赤松根际长有松茸，松茸也称松口蘑，是一种纯天然的珍稀名贵食
用菌类，被誉为“菌中之王”。松茸因其生长环境严格，长白山也只有延边生长松茸，且分布区域狭小，其理论
储量为１００ｔ左右。在我国的横断山脉、台湾地区也产松茸，但因其质量逊于延边松茸，在国际市场上价格
相差很大。国家已将松茸列入濒危珍稀物种，属国家二级保护植物［４］。松茸具有强身、益肠胃、止痛、理气化
痰等功效，可以增强免疫力、降低血糖、强化心脏、调节血压、抗血栓、抗病毒等。孩子们吃了新鲜的松茸，还
有保护牙齿的作用。据日本资料称，松茸抗癌效果可达９０％以上，还可治疗糖尿病等［５］。但遗憾的是到目
前为止松茸尚不能进行人工栽培［６］，松茸与赤松是互惠共生关系，松茸的生长与赤松根际土壤微生物必有密
切关系，所以本试验主要是建立适合于赤松根际土壤微生物多样性分析的ＰＣＲ－ＤＧＧＥ反应体系，为进一步
研究赤松根际土壤微生物多样性与松茸生长间关系奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料
土壤样品采自延边朝鲜族自治州龙井智信赤松林。在产松茸季节，以赤松林下长有松茸的点为中心，分
别取长松茸的、离中心２０、４０、８０、１００、５００ｃｍ点的土壤样品（分别记为１～６号样品）。取样深度为１５ｃｍ左
右。土壤样品装入灭菌袋后放入冰块盒中并迅速带回实验室置于零下８０℃保存。
１．２　主要试剂
土壤微生物ＤＮＡ提取试剂盒 （ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ，美国加利福尼亚亚洲Ｍｏｂｉｏ公司）；引物
延　边　大　学　农　学　学　报 第３５卷　
（生工生物工程上海有限公司）；ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ２＋等 （宝生物工程大连有限公司）。
１．３　主要仪器
凝胶成像系统 （美国 ＷＥＡＬＴＥＣ公司）；ＤＹＹ－１２电泳仪 （北京市六一仪器厂）；超低温冰箱 （购自美国
Ｎｕａｉｒ公司）；ＷＤ－９４０２Ａ基因扩增仪 （北京市六一仪器厂）；微量移液器等。
１．４　方法
１）土壤微生物ＤＮＡ的提取　土壤样品过筛去除根须等异物质后，用研钵研磨，再按土壤微生物ＤＮＡ
提取试剂盒的要求进行ＤＮＡ的提取。取１０μＬ　ＤＮＡ样品，在０．８％琼脂糖凝胶中电泳检测，与ＤＮＡ　Ｍａｋ－
ｅｒ作对照，将各样品ＤＮＡ浓度调到２０ｎｇ／μＬ左右，于－２０℃冰箱中保存备用。
２）ＰＣＲ－ＤＧＧＥ反应体系优化　 在２５μＬ　ＰＣＲ反应体系中，固定２．５μＬ　１０×Ｂｕｆｆｅｒ和０．４μＬ　Ｔａｑ
（５Ｕ／μＬ）的加入量，按照单因素试验方法检测其他因素对ＰＣＲ的影响。引物序列为 Ｍａｙ试验所采用的序
列［７］。其中模板ＤＮＡ采用５个梯度；ｄＮＴＰｓ采用５个梯度；引物采用５个梯度；Ｍｇ２＋采用５个梯度（表１）。
ＰＣＲ反应程序为：９５℃预变性５ｍｉｎ后，在９５℃３０ｓ、５０℃３０ｓ、７２℃２ｍｉｎ，共３５个循环，最后于７２℃延
伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物在琼脂糖电泳或ＤＧＧＥ检测。
在ＤＧＧＥ分析中，真菌ＩＴＳ区域的扩增采用ＩＴＳ１Ｆ－ＧＣ，ＩＴＳ４引物对［８］，细菌１６ＳｒＤＮＡ多变区的扩增
采用３４１Ｆ－ＧＣ，５１８Ｒ引物对［９］。采用８％的凝胶单体，变性剂范围４０％～６０％，细菌ＤＧＧＥ反应条件为：温
度６０℃，电压１００Ｖ，１５ｈ。真菌ＤＧＧＥ反应条件为：温度６０℃，电压分２个阶段：第１阶段，６０Ｖ，１ｈ；第２
阶段，１１０Ｖ，２２ｈ。
表１　ＰＣＲ反应体系的优化设计
Ｔａｂｌｅ　１　Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　ｏｐｔｉｍａｌ　ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
序号 模板／ｎｇ　 ｄＮＴＰｓ／ｍＭ 引物／μＭ　 Ｍｇ
２＋／ｍＭ
１　 ５　 ０．１　 ２．４　 ０．５
２　 １０　 ０．１５　 ３．２　 １．０
３　 ２０　 ０．２　 ４．０　 １．５
４　 ４０　 ０．２５　 ４．８　 ２．０
５　 ８０　 ０．３　 ５．６　 ２．５
２　结果与分析
２．１　土壤微生物基因组总ＤＮＡ提取效果检测
土壤样品中提取ＤＮＡ的方法有多种，而不同方法其提取效果有差异［１０］，特别是能否提取真菌ＤＮＡ是
人们选择ＤＮＡ提取方法时首先考虑的问题。本试验选用了ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ，用该试剂盒提
取的土壤微生物基因组ＤＮＡ的条带清晰、明亮 （图１），而且从ＤＧＧＥ效果看（图３－Ｂ），用该试剂盒能够提
取真菌ＤＮＡ，基本满足本试验要求。
图１　ＤＮＡ提取效果检测
Ｆｉｇ．１　Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ
８１３
　第４期 唐丽娜，等：赤松根际土壤微生物ＰＣＲ－ＤＧＧＥ反应体系优化
２．２　ＰＣＲ－ＤＧＧＥ反应体系优化
影响ＰＣＲ扩增效果的因素有多种，其中模板ＤＮＡ、ｄＮＴＰｓ、引物、Ｍｇ２＋在ＰＣＲ反应体系中的浓度是影响
ＰＣＲ扩增效果的主要因素。因此，本试验采用单因素试验对其适宜的浓度进行了优化。ＤＮＡ模板浓度太低会
减少分子碰撞的几率，扩增产物不稳定浓度太高会增加非专一扩增产物或出现弥散性条带［１１］。由图２－Ａ可
知，模板ＤＮＡ用量为５、１０、２０、４０ｎｇ时（１～４号孔）均能扩增出条带，但模板含量为１０ｎｇ时（２号孔），扩增产物
最多，条带最亮，所以，在本试验条件下最适宜的模板浓度为１０ｎｇ，其效果最佳。ｄＮＴＰｓ是ＰＣＲ反应的原料。
浓度太低会过早的消耗，无法继续合成ＤＮＡ，浓度太高会导致非特异性扩增［１２］。由图２－Ｂ可知，在０．１～
０．３ｍＭ　ｄＮＴＰｓ各浓度均能扩增出条带，但ｄＮＴＰｓ为０．１５ｍＭ时（２号孔），扩增条带最亮，所以，在本试验条件
下最适宜的ｄＮＴＰｓ浓度为０．１５ｍＭ。引物设计和引物浓度对ＰＣＲ扩增效果影响最大。为了ＰＣＲ扩增赤松根
际土壤细菌和真菌特异片段ＤＮＡ，本试验设计了多对特异性引物并对其ＰＣＲ扩增效果进行比较（其结果未显
示）后，最终选择了效果较好的引物对（真菌：ＩＴＳ１Ｆ－ＧＣ，ＩＴＳ４；细菌：３４１Ｆ－ＧＣ，５１８Ｒ）。ＰＣＲ反应体系中引物浓
度太低扩增产物太少，太高会导致非特异性扩增或引物之间形成二聚体［１３］。由图２－Ｃ可知，当引物浓度为２．
４、３．２、４．０μＭ时，均可扩增出ＰＣＲ产物，而２号孔的条带较好，所以引物浓度为３．２μＭ 时扩增效果最好。
Ｍｇ２＋的主要作用是提高Ｔａｑ酶的活性，适量的浓度会提高ＰＣＲ扩增的效率，浓度过低会降低Ｔａｑ酶的活性，扩
增产物少甚至扩不出来，浓度太高会形成金属螯合物，不利于ＰＣＲ的进行［１４］。由图２－Ｄ可知，只有２号孔才
能扩增出条带，所以在本实验条件下适宜 Ｍｇ２＋浓度为１．０ｍＭ。
图２－Ａ　模板ＤＮＡ浓度对ＰＣＲ扩增效果的影响　　　　　　　　图２－Ｂ　ｄＮＴＰｓ浓度对ＰＣＲ扩增效果的影响
Ｆｉｇ．２－Ａ　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　　　　　　　　Ｆｉｇ．２－Ｂ　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ
　　ＤＮＡ　ｏｎ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　　　　　　　　　　　　　　　ｄＮＴＰｓ　ｏｎ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　图２－Ｃ　引物浓度对ＰＣＲ扩增效果的影响　　　　　　　　图２－Ｄ　Ｍｇ２＋浓度对ＰＣＲ扩增效果的影响
　　Ｆｉｇ．２－Ｃ　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　　　　　　　　　　Ｆｉｇ．２－Ｄ　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ
　　ｐｒｉｍｅｒ　ｏｎ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　　　　　　　　　　　　　　Ｍｇ２＋ｏｎ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
９１３
延　边　大　学　农　学　学　报 第３５卷　
２．３　ＤＧＧＥ条件优化
在进行ＤＧＧＥ前，引物的筛选尤为重要，不同引物由于所扩增的多变区不同，进而在ＤＧＧＥ电泳后分
离条带数目、清晰度和分离效果差别较大［１５］。为选择最适合于赤松根际土壤微生物ＤＧＧＥ体系的引物，通
过比较试验（其结果未显示）选择了能够扩增真菌ＩＴＳ多变区的ＩＴＳ１Ｆ－ＧＣ，ＩＴＳ４引物对［８］及１组细菌１６Ｓ
ｒＤＮＡ多变区引物３４１Ｆ－ＧＣ，５１８Ｒ［９］。采用８％的凝胶单体，变性剂范围４０％～６０％，细菌ＤＧＧＥ反应条
件为：温度６０℃，电压１００Ｖ，１５ｈ。真菌ＤＧＧＥ反应条件为：温度６０℃，电压分２个阶段：第１阶段，６０Ｖ，
１ｈ；第２阶段，１１０Ｖ，２２ｈ。电泳完毕后，用溴酚蓝染色，用凝胶成像系统进行了照相、分析。图３－Ａ和
３－Ｂ分别为赤松根际土壤细菌和真菌ＰＣＲ－ＤＧＧＥ分析结果。图中不同土壤样品间均表现出细菌和真菌的
种类和丰度上的差异。这一结果说明，赤松根际土壤存在微生物多样性，也暗示长松茸的赤松根际土壤与周
边根际土壤间微生物群落差异。
图３　赤松根际土壤细菌（Ａ）、真菌（Ｂ）ＤＧＧＥ图谱
Ｆｉｇ．３　Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ａ）ａｎｄ　ｆｕｎｇｉ（Ｂ）ＤＧＧＥ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ
３　讨论与结论
优化赤松根际土壤微生物ＰＣＲ－ＤＧＧＥ反应体系的结果表明：在２５μＬ　ＰＣＲ反应体系中，模板ＤＮＡ浓
度为１０ｎｇ，ｄＮＴＰｓ浓度为０．１５ｍＭ，引物浓度为０．３２μＭ，Ｍｇ
２＋浓度为１．０ｍＭ时，其ＰＣＲ效果最佳。用
该反应体系扩增出来的ＰＣＲ产物，在ＤＧＧＥ凝胶上能够清晰地分辨出赤松根际土壤细菌和真菌多样性。
历来，微生物的鉴定、研究都是依靠人工纯化培养方法，这极大地限制了人们认识微生物、研究微生物的
进程。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ方法是不依靠人工纯培养的一种微生物研究方法。它广泛应用在极端环境微生物研究、
土壤微生物研究、污水－污染环境中微生物研究等领域。
微生物在生态系统中起到非常重要的作用。包括松口蘑在内的以蘑菇类为代表的各类植物的外生菌根
具有明显的经济效益和环境效益。不仅木材产量提高，而且还能提供大量美味可口的蘑菇。大量研究报道
证明，外生菌根菌有利于在贫瘠土壤生长出茂盛树林，在低营养土壤环境中，外生菌根菌能使大部分植物有
了共同的开拓者。在获得大量速生树的同时，也可获得高价值的菌类。研究赤松根际土壤微生物多样性，特
别是以松口蘑等外生菌根为主的真菌多样性研究在提高林木产量、提高生态效益、了解植物与微生物间的共
生关系等诸方面具有重要意义。
试验通过ＰＣＲ－ＤＧＧＥ条件优化，基本建立了研究赤松根际土壤微生物体系。这为进一步深入研究赤
松外生菌根、解开其共生关系打下了坚实的基础。
参考文献：
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０２３
　第４期 唐丽娜，等：赤松根际土壤微生物ＰＣＲ－ＤＧＧＥ反应体系优化
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Ｕｐｆｌｏｗ　Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　Ｓｌｕｄｇｅ　Ｂｅｄ　Ｒｅａｃｔｏｒ　Ｔｒｅａｔｉｎｇ　Ｂｒｅｗｅｒｙ　Ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，
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ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　１６ＳｒＲＮＡ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，５９
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ｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ　ｃｏｒｎ　ｓｉｌａｇｅ［Ｊ］．Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，４７：８２９－８４１．
［８］　Ｗｈｉｔｅ　Ｔ　Ｊ，Ｂｒｕｎｓ　Ｔ，Ｌｅｅ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｂｙ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｒｉｂｏｓｏ－
ｍａｌ　ＲＮＡ　ｇｅｎｅｓ［Ｍ］．／／Ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ，１９９０，３１５－３２２．
［９］　Ｍｕｙｚｅｒ　Ｇ，Ｗａａｌ　Ｅ　Ｃ，Ｕｉｔｔｅｒｌｉｎｄｅｎ　Ａ　Ｇ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ　ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｂｙ　ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ－
ｒｅｓｉｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　１６ＳｒＲＮＡ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉ－
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ｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｕｓ　Ｏｒｙｚａ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００，１００：１　３１１－１　３２０．
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ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ　ｂｙ　ＰＣＲ－ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００４，７０（８）：
４　８００－４　８０６．
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＣＲ－ＤＧＧＥ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｎ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ
ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ｆｏｒ　Ｐｉｎｕｓ　ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ　Ｓｉｅｂ．ｅｔ　Ｚｕｃｃ
ＴＡＮＧ　Ｌｉ－ｎａ１，　ＰＩＡＯ　Ｃｈｕｎ－ｇｅｎ２，　ＨＡＮＧ　Ｑｉｕ－ｙｕ３，　ＪＩＮ　Ｄｏｎｇ－ｃｈｕｎ１＊
（１．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｙａｎｂｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｊｉ　Ｊｉｌｉｎ　１３３００２，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９１　Ｃｈｉｎａ；
３．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｏｆ　Ｌｏｎｇｊｉｎｇ　Ｃｉｔｙ，Ｌｏｎｇｊｉｎｇ　Ｊｉｌｉｎ　１３３４００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ＰＣＲ－ＤＧＧＥ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ｆｏｒ　Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ．
Ｓｏｍｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ＰＣＲ－ＤＧＧＥ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｔｅｍ－
ｐｌａｔｅ，ｄＮＴＰｓ，ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　Ｍｇ２＋ ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ　ｓｏｉｌ　ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ａｎ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｓｙｓｔｅｍ
（２５μＬ）ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｓ　１０ｎｇ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ，０．１５ｍＭ　ｄＮＴＰｓ，０．３２μＭ　ｐｒｉｍｅｒ，ａｎｄ　Ｍｇ
２＋１．０ｍＭ．Ｔｈｅ
ｍｅｔｈｏｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｆａｓｔ．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＤＧＧＥ　ｇｅｌ　ｃａｎ　ｂｅ
ｃｌｅａｒｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ　Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｎｄ　ｆｕｎｇａｌ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ｐ．
ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｍｉｃｒｏｂｅｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｙ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ　ｅｃｔｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａ　ｌａｉｄ　ａ　ｆｏｕｎｄａ－
ｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｉｎｕｓ　ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ　Ｓｉｅｂ．ｅｔ　Ｚｕｃｃ．；ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ　ｓｏｉｌ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；ＰＣＲ－ＤＧＧＥ；ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ｏｐｔｉｍｉ－
ｚａｔｉｏｎ
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