全 文 ：第 28 卷第 1 期
2002 年 2 月
湖南农业大学学报(自然科学版)
Journal of Hunan Ag ricultural Univ ersity(Natural Sciences)
Vol.28 No.1
Feb.2002
　　收稿日期:2001-11-21
　　基金项目:湖南省教育厅资助项目(97B028);本文第Ⅰ
报见《湖南农业大学学报(自然科学版)》 , 2001 , 27(1):41-43
　　作者简介:于晓英(1968-), 女 ,汉族 ,湖南绥宁人 ,硕士 ,
湖南农业大学讲师.
　　文章编号:1007-1032(2002)01-0076-02
萱草种质资源扩增片段长度
多态性鉴别与分类的研究
Ⅱ.5个萱草材料的 AFLP 分析
于晓英 ,吴铁明 ,彭尽晖 ,吕长平 ,张宏志 ,丁江南
(湖南农业大学植物科学技术学院 , 湖南 长沙　410128)
摘　要:为了快速准确地进行萱草种质鉴定 , 从 64 对 AFLP 引物中随机选出了 3 对引物组合(即 EcoRⅠ AAC-Mse
ⅠCAT , EcoRⅠ ACC-MseⅠ CAT , EcoRⅠACC-MseⅠCAG),构建了 5 个萱草种质的指纹图谱.3 对引物在 5 个萱草
材料中 205个位点上扩增出了条带 ,其中多态性条带 128 个 , 占扩增条带总数的 62.9%, 5 个萱草材料具有较高的
遗传多样性 ,并初步认为其中野生重瓣萱草可能来自于萱草 H.fulva 的自然突变.
关　键　词:萱草;扩增片段长度多态性;DNA指纹
中图分类号:S682.1+90.1　　　　　　　　　　　　文献标识码:A
Identification and Classification of Hemerdcallis Resources with
Using AFLP Molecule M arker
Ⅱ.AFLP Analy sis of F ive M aterials of Orange Day lily
YU Xiao-ying ,WU Tie-ming , PENG Jin-hui ,Lǜ Chang-ping ,ZHANGHong-zhi ,DING Jiang-nan
(College of Plant Science and Technology , HNAU , Chang sha　410128 , PRC)
Abstract:In order to identify orange daylily varieties accurately and quickly , AFLP f ingerprinting w ere
obtained by using three pairs of primers EcoRⅠAAC-Mse ⅠCAT , EcoRⅠACC-Mse ⅠCAT and EcoR
ⅠACC-Mse ⅠCAG.Among 205 bands , there w ere 128 polymorphism bands.The rat io of polymor-
phism bands reached 62.9%.The five materials of o range day lily had higher genetic diversity , and the
w ild orange day lily w as considered as a mutation of H.fulva .
Key words:orange daylily ;amplified f ragment length polymo rphism;DNA fingerprints
　　传统的萱草种质鉴定方法在非花期鉴定有一定
的难度 ,常造成一种(品种)数名 、数种(品种)同名现
象 ,不但阻碍了这些种质资源的合理利用 ,也给遗传
改良造成了很大的困难.笔者在前期研究的基础
上[ 1] ,于 2000年在广东省农科院 ,应用 AFLP 技术
绘制了湖南农业大学园艺系花圃 5个萱草的 DNA
指纹图谱 ,并对其进行了遗传多样性分析和鉴定 ,为
萱草资源的遗传改良 、合理利用以及 AFLP 技术在
萱草种质资源上的进一步应用提供参考.
1　材料和方法
供试材料为:大花萱草 (A),长筒萱草(B),玫
瑰红萱草(C),黄花菜(D),野生重瓣萱草(E).
萱草 DNA 的提取与纯化采用文献[ 1] 的改良
CTAB法.
模板 DNA的限制性酶切 ,接头的连接 ,预扩增
反应 ,选择性扩增都按照GIBCOBRL 的 AFLP 试剂
盒(AFLP Analysis System Ⅰ)产品说明书在 Perkin-
Elmer 480 thermal cycler仪上进行.
从 AFLP 试剂盒内 64 对引物中随机选出 3对
引物组合:EcoRⅠACC+MseⅠCAT(引物Ⅰ),EcoR
ⅠACC+Mse Ⅰ CAG(引物 Ⅱ), EcoRⅠAAC +Mse
ⅠCAT(引物 Ⅲ),进行 AFLP产物多态性比较.所选
引物选用同位素[ γ33P] ATP(SIGMA 公司生产)进
行标记.
DOI :10.13331/j.cnki.jhau.2002.01.025
取3 μL 选择性扩增产物在 7%的聚丙烯酰胺
凝胶上 ,用 BioRad3000电泳系统 55 W 恒功率电泳
2 h ,干胶后 ,用X光片放射自显影 7 ～ 15 d ,冲片 ,晾
干 ,用 Phenix DC901照相 ,检测 DNA多态性.
用 Lambda DNA/Hind Ⅲ +EcoR ⅠMarkers;
Pgem-7Zf(+)DNA/Hae Ⅲ Markers作为分子量标
记 ,对照反应产物在凝胶上的位置记录反应产物分
子量.强带记为 1 ,弱带或无反应带记为 0 ,得到原始
数据.并运用 SSPS 分析软件构建萱草分子系统.
2　结果与讨论
2.1　引物的筛选结果及遗传多样性分析
从AFLP 试剂盒内 64对引物中随机选出 3 对
引物组合 ,对 5个萱草材料的扩增结果见图 1.这 5
个萱草材料共在 205 个位点上扩增出条带 ,扩增条
带最多的引物Ⅱ为 84个 ,其中多态性带 46个 ,引物
Ⅰ扩增条带共 51个 , 其中多态性带 32个 ,引物 Ⅲ
扩增条带共 70 个 ,其中多态性带 50 个.通常情况
下 ,AFLP 每一条扩增带都对应着一个基因 DNA分
子位点 ,出现多态性扩增带 ,说明某个或某些品种在
该位点上存在变异[ 2 ,3] .3对引物在 5个萱草材料中
在 205个位点上扩增出条带 ,平均每对引物扩增 68
个条带 , 3对引物共扩增出多态性条带 128个 ,平均
每对引物扩增 42个 ,多态性条带占总扩增条带的比
例平均为 62.9%,说明在被测的位点中有 62.9%的
位点(DNA一级结构)不同材料间存在着相当大的
差异 ,可见这 5个萱草材料具有较高的遗传多样性.
从图 1中还可看出 ,引物 Ⅰ和引物 Ⅱ的扩增条带信
号强度一致性好 ,条带分布均匀 ,与之相比 ,引物 Ⅲ
扩增条带信强度差异相对较大.
图 1　3 个引物对 5 个萱草材料的扩增结果
Fig.1　Amplified results of Hemerocallis by using 3 primer pairs
2.2　差异带与种质鉴定
在应用引物 Ⅰ , Ⅱ , Ⅲ构建的萱草 AFLP 指纹图
谱中(图 1),供试的 5个萱草材料之间都有差异带 ,
以 EcoRⅠACC+M se ⅠCAG 为引物时 ,玫瑰红萱草
与长筒萱草的差异带为 18条 ,大花萱草与长筒萱草
的差异带为 22条 ,野生重瓣萱草与长筒萱草的差异
带为 24条 ,黄花菜与长筒萱草的差异带为 38条.一
般来说每个种质的特异带应该与其特异性状密切相
关 , 如玫瑰红萱草的 18条特异带应该与其玫瑰红
花色密切相关 ,野生重瓣萱草的特异带应该与其重
瓣性状密切相关.在进行种质鉴定时可根据各自的
特异带或差异带将供试材料区分开来 ,在选择其中
一对引物的指纹图谱为标准图谱后 ,将待测样品的
指纹图谱与该标准指纹图谱相比较 ,就可明确待测
样品的真实性.
2.3　亲缘关系鉴定
长筒萱草与玫瑰红萱草之间的相似系数最大为
0.873(表 1),两者之间的亲缘关系较近 ,实际上 ,这
两者都是萱草 H .fulva 的变种;而玫瑰红萱草与黄
花菜 H.citrina baroni 之间相似系数最小 ,为 0.
639 , 两者之间的亲缘关系较远;野生重瓣萱草与玫
瑰红萱草的相似系数较大 ,野生重瓣萱草可能也是
来自于萱草 H .fulva 的自然突变.
表 1　5个萱草材料的 Dice相似系数
Table 1　The dice similarity matrix of 5 Hemerocallis materials
based on AFLP f ingerprint ing
材　料 长筒萱草 大花萱草 玫瑰红萱草　黄花菜 野生重瓣萱草
长筒萱草 1 0.836 0.873 0 .711 0.794
大花萱草 0.836 1 0.848 0.693 0.803
玫瑰红萱草 0.873 0.848 1 0.639 0.822
黄花菜 0.711 0.693 0.639 1 0.710
野生重瓣萱草 0.794 0.803 0.822 0.710 1
(续　完)
参考文献:
[ 1] 　于晓英 ,吴铁明 , 彭尽晖 ,等.萱草种质资源扩增片段长
度多态性鉴别与分类的研究Ⅰ .萱草 DNA 模板的制备
[ J] .湖南农业大学学报(自然科学版), 2001 , 27(1):
41-43.
[ 2] 　王　斌 , 翁曼丽.AFLP 的原理及应用[ J] .杂交水稻 ,
1996 , (5):27-30.
[ 3] 　Debener T ,Mattiesch L.Construction of a genetic link-
age mapfor roses using RAPD and AFLP markers[ J] .
Theor Appl Genet , 1999 , 99:891-899.
77　第 28 卷第 1 期　　　　　　　　　　　　于晓英等　萱草种质资源扩增片段长度