全 文 ：·试验研究· 北方园艺 2009(5):48～ 50
第一作者简介:金雪花(1974-),女,硕士, 讲师 ,主要研究方向为植
物组织及细胞培养。 E-mail:xh kim@sina.com。
基金项目:昆明理工大学青年科研基金资助项目(2007-4-7)。
收稿日期:2008-12-20
洋桔梗无菌播种与植株再生体系的建立
金雪 花 , 杨 　薇 , 李有 林 , 孔 祥莹 , 彭春 秀
(昆明理工大学现代农业工程学院 ,云南昆明 650224)
　　摘　要:以无菌播种方式获得无菌苗 ,以叶片为外植体 ,建立了洋桔梗高效植株再生体系。
研究了不同激素及组合对愈伤组织诱导 、不定芽分化 、增殖与不定根形成的影响。结果表明:
MS+6-BA 0.1～ 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L为愈伤组织诱导 、不定芽分化的适宜培养基;MS+
6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.02 ～ 0.05 mg/L为继代增殖适宜培养基;1/2MS+IBA 0.5 ～ 1.0 mg/ L
为不定根形成的适宜培养基。
关键词:洋桔梗;无菌播种;植株再生;激素
中图分类号:Q 949.776.4;S 603.6　文献标识码:A 　文章编号:1001-0009(2009)05-0048-03
　　洋桔梗(Eustoma grandi forum)为龙胆科观赏植物 ,
原产北美洲 ,其花色丰富 ,花形类似玫瑰 ,无刺 ,在日本
有“无刺的玫瑰”之称 ,日本每年消费量高达 9 000万支
以上[ 1] ,是国际上流行的切花品种。在我国各地也已开
始广泛栽培。但洋桔梗种源主要是从国外进口 F1杂种 ,
价格昂贵 ,而且种子十分细小(19 000粒/g),播种技术难
度大 ,种子萌发缓慢 ,发芽率较低 ,而洋桔梗扦插繁殖系
数比较低 ,利用组织培养进行快速繁殖是满足国内洋桔
梗种苗需求的重要途径之一[ 2-3] 。该研究对引进于日本
的洋桔梗 F1杂种进行无菌播种 ,以获得的无菌苗的叶片
为外植体进行组培研究 ,探讨由叶片诱导不定芽到继代
增殖 、生根过程中外源激素的调控作用 ,从而建立洋桔
梗叶片再生体系 ,为洋桔梗的种苗产业化生产提供理论
依据。
1　材料与方法
1.1　材料
试验材料为洋桔梗的F1杂交种子 ,引自昆明立深新
园花卉有限公司。
1.2　方法
1.2.1　种子无菌播种　洋桔梗种子用细纱布包裹 ,用适
量洗衣粉液浸泡5 ～ 10 min ,自来水冲洗5 ～ 10 min ,在超
净台上用 70%酒精浸泡 20 ～ 30 s后 ,用0.1%HgCl2浸
泡8 ～ 10 min ,无菌水冲洗5次 ,每次2 ～ 3 min ,用无菌滤
纸吸干水分。然后接种于1/2MS培养基上进行发芽 ,并
培育成无菌苗。取无菌苗叶片 ,切取5 mm×5 mm叶盘
为外植体 ,接种于6-BA与 NAA不同浓度水平组合的培
养基中诱导愈伤组织与不定芽形成;切取长为0.5 cm的
不定芽为外植体 ,接种于 6-BA与NAA不同浓度水平组
合的培养基中继代增殖;取高2 cm的试管苗为外植体 ,
接种于 NAA 、IAA 、IBA 不同浓度水平的培养基中诱导
生根。
1.2.2　培养基与培养条件　以MS为基本培养基 ,附加
不同浓度梯度6-BA(0.1 、0.5、1.0 mg/L)和不同浓度梯
度 NAA(0.05 、0.1 、0.2 mg/ L)共 9个组合进行愈伤组织
和不定芽诱导;再以MS为基本培养基 ,附加不同浓度梯
度 6-BA(0.1 、0.5、1.0 mg/L)和不同浓度梯度 NAA
(0.02 、0.05 、0.1 mg/L)共 9个组合进行继代增殖培养。
最后以 1/2MS为基本培养基 ,附加 NAA (0.2、0.5 、1.0
mg/L)或 IBA(0.2、0.5、1.0 mg/ L)或 IAA(0.2、0.5 、1.0
mg/L),并以 1/2MS为对照 ,共 10个处理进行不定根的
诱导。以上培养基中均附加 3%蔗糖 ,0.9%琼脂 ,pH 为
5.8。培养条件:温度为(24±1)℃ ,光照强度为 1 800 ～
2 000 lx ,光照时间为14 h/d。
2　结果与分析
2.1　不同激素水平对愈伤组织诱导 、不定芽分化影响
将大小 5 mm×5 mm 叶盘放入诱导培养基 ,培养
5 d后 ,大部分叶盘切口处膨大 ,20 d后 ,大部分有明显
的不定芽。不定芽既可以从愈伤组织上产生 ,也可以从
叶片上直接产生。培养 30 d后的试验统计结果见表 1。
　　由表 1所示 ,各激素组合均可以有效诱导洋桔梗叶
片发生不定芽。叶盘不定芽分化率 、每叶盘平均不定芽
数 ,随NAA浓度的增加 ,有降低趋势 ,而随 6-BA浓度增
加 ,二者表现上升趋势(6-BA 0.1 +NAA 0.05外)。但
6-BA 浓度越高 ,玻璃化现象越明显 ,当 6-BA 浓度高于
0.5 mg/L 时 ,有70%以上出现玻璃化现象。
48
北方园艺 2009(5):48～ 50 ·试验研究 ·
　　表 1 不同激素水平对愈伤组织诱导 、不定芽分化的影响
　　Table 1 Effect s of diff erent levels of hormone t reatment on callus induction and adventitious shoot dif ferentiation
激素处理
Hormone treatment
处理叶盘数
Numbers o f treated plate/个
叶盘不定芽分化率
Adventitious shoot differentiation rate of plate/ %
每叶盘平均不定芽数
Average adventitious shoo t numbers o f each plate/个·片-1
6-BA 0.1+NAA 0.05 65 90.77 4.11
6-BA 0.1+NAA 0.1 64 46.88 1.38
6-BA 0.1+NAA 0.2 65 30.77 0.65
6-BA 0.5+NAA 0.05 64 75 3.98
6-BA 0.5+NAA 0.1 64 56.25 2.14
6-BA 0.5+NAA 0.2 65 46.15 1.06
6-BA 1.0+NAA 0.05 64 84.38 3.78
6-BA 1.0+NAA 0.1 61 73.77 3.38
6-BA 1.0+NAA 0.2 64 46.88 1.3
　　在试验中发现 ,不管 6-BA 浓度如何 ,当 NAA浓度
为0.05 mg/L 时 ,通常不定芽从叶片直接产生 ,NAA浓
度大于 0.05 mg/L时 ,从愈伤组织上产生。不经过愈伤
组织而直接从切口处长出的不定芽 ,只有 10%出现玻璃
化现象 ,而经浅绿色愈伤组织分化来的不定芽 ,有 30%
左右出现玻璃化现象 ,经绿色或水泡状愈伤组织分化来
的不定芽 ,只有 10%左右正常。综上所述 ,适宜不定芽
诱导培养基为:MS +6-BA 0.1 ～ 0.5 mg/L+NAA 0.05
mg/ L。
2.2　不同激素水平对试管苗继代增殖的影响
　　将长0.5 cm的不定芽转入继代培养基上 ,培养10 d
　　表 2 不同激素水平对试管苗继代增殖的影响
　　Table 2 Ef fect s of different levels of hormone t reatment
on sub-multiplication
激素处理
Hormone
treatment
样本数
Samples
numbe rs/株
增殖系数
Propagation
coefficient
平均苗高 Average
height of
plantlets/cm
6-BA 0.1+NAA 0.02 30 5.30 1.6
6-BA 0.1+NAA 0.05 32 4.84 1.8
6-BA 0.1+NAA 0.1 32 3.19 2.1
6-BA 0.5+NAA 0.02 31 4.84 1.3
6-BA 0.5+NAA 0.05 29 4.48 1.4
6-BA 0.5+NAA 0.1 31 3.29 1.5
6-BA 1.0+NAA 0.02 33 4.55 0.9
6-BA 1.0+NAA 0.05 30 4.53 1.1
6-BA 1.0+NAA 0.1 35 4.26 1.2
后 ,切口处诱导出愈伤组织 ,叶腋间有侧芽出现;20 d
后 ,所有处理叶腋间均长出侧芽;30 d后 ,叶腋间的侧芽
不断萌发 、生长形成芽丛 ,少部分不定芽从愈伤组织长
出。培养 30 d后的统计结果见表2。由表 2可见 ,6-BA
浓度越高 ,试管苗越矮 ,长势越弱 ,即 6-BA 有抑制试管
苗生长的作用 ,这与前人的研究一致[ 3-4] ,而且 6-BA浓
度越高玻璃化现象越明显 ,因此 ,6-BA 浓度不宜过高。
NAA浓度增加 ,试管苗株高越高 ,但NAA浓度增加 ,增
殖系数下降 ,而 6-BA在该试验浓度范围内 ,对增殖系数
的影响未看出明显规律。综上 ,适宜壮苗继代增殖培养
基为:MS +6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.02 ～ 0.05 mg/L。
2.3　不同激素水平对生根的影响
待试管苗长到 2 cm时 ,从基部切下转入生根培养
基 ,培养30 d后的试验统计结果见表3。表3表明 ,在未
添加激素的1/2MS培养基上也可以生出不定根 ,但生根
率低 、根细 、无根毛。NAA处理时 ,基部均先产生愈伤
组织 ,然后由愈伤组织长出不定根 ,根短 、细 ,根毛少 ,苗
长势弱。生根率除 0.2 mg/L 外 ,在 3种激素处理中最
低。IBA处理时 ,不定根直接产生于茎段切口处 ,很少
见明显愈伤组织 ,根长、粗壮 ,根毛多 ,苗长势好 ,且随着
IBA浓度的增加 ,生根率增高 ,根数增多。IAA处理时 ,
切口处能看到明显愈伤组织 ,生根率较高 ,但根毛较少。
综上所述 ,适宜壮苗生根培养基为:1/2MS +IBA
0.5～ 1.0 mg/ L。
　　表 3 不同激素水平对生根的影响
　　Table 3 Ef fect s of different levels of hormone t reatment on root format ion
激素处理
Hormone treatment
样本数
Sample numbers/株
生根率
Roo ting rate/ %
平均根数Average
root number/条
平均根长Average
root leng th/cm
不定根形态与苗的长势
Growth o f adventitious shoot shape and plantlet
NAA 0.2 40 57.5 7.1 2.3 根细 ,根毛较少 ,苗长势弱
NAA 0.5 40 15 5.2 0.9 根细 ,根毛少,苗长势弱
NAA 1.0 40 20 2.2 1.1 根细 ,根毛少,苗长势弱
IBA 0.2 40 47.5 6.1 4.0 根粗 ,根毛较少 ,苗长势强
IBA 0.5 40 82.5 7.2 3.8 根粗壮,根毛多 ,苗长势强
IBA 1.0 40 90.0 9.3 4.4 根粗壮,根毛多 ,苗长势强
IAA 0.2 40 62.5 8.8 2.8 根粗 ,根毛较少 ,苗长势强
IAA 0.5 40 77.5 3.8 3.9 根粗壮,根毛较少 ,苗长势强
IAA 1.0 40 87.5 6.4 3.6 根粗壮,根毛少 ,苗长势强
1/ 2MS(CK) 40 12.5 4.6 2.7 根细 ,无根毛,苗长势弱
49
·试验研究· 北方园艺 2009(5):48～ 50
3　小结
洋桔梗目前在欧洲 、日本及美国的销量急速上升 ,
我国各地现也竞相引种栽培 ,种苗市场需求量很大。但
种子价格昂贵 ,细小播种难 ,加上从发芽到正常生长有
3～ 4个月的停滞期 ,这段时间内 ,往往有大量的幼苗死
亡 ,发芽率低 ,育苗困难 ,扦插繁殖也很困难。利用组织
培养 ,可以在短期内繁殖大量优质种苗。
该试验结果表明:以无菌播种方式获得洋桔梗无菌
苗 ,再以其叶片为外植体 ,愈伤组织诱导 、不定芽分化的
适宜培养基为 MS+6-BA 0.1 ～ 0.5 mg/L+NAA 0.05
mg/ L;继代增殖适宜培养基为 MS +6-BA 0.1 mg/L+
NAA 0.02 ～ 0.05 mg/ L;不定根形成的适宜培养基为
1/2MS+IBA 0.5 ～ 1.0 mg/L。
该试验中发现洋桔梗组培过程中玻璃化现象明显 ,
6-BA浓度高于 0.5 mg/L 时 ,玻璃化现象明显增多 ,而
且发现 6-BA对试管苗高生长有抑制作用。因此浓度应
控制在 0.5 mg/ L以下。NAA 浓度高虽可以促进试管
苗的高生长 ,但不利于增殖系数的提高 ,还有低浓度
NAA可能使不定芽从叶片直接产生。
参考文献
[ 1] 　中国台湾省洋桔梗高价畅销日本[ J] .中国花卉园艺 ,2005(3):50.
[ 2] 　王爱玲.洋桔梗的栽培[ J] .园林, 1999(3):22-23.
[ 3] 　张子学,丁为群 ,乔华伟 ,等.洋桔梗的快速繁殖研究[ J] .中国林副特
产 ,2005(4):1-3.
[ 4] 　傅玉兰,杨海燕,姚萍.植物激素在洋桔梗组培快繁中的应用研究
[ J] .安徽农业科学, 2005, 33(10):1847-1848.
Aseptic Seeding and Establishment of Plant-let Regeneration System in Eustoma grandiforum
JIN Xue-hua, YANG Wei , LI You-lin , KONG Xiang-ying , PENG Xiu-chun
(Faculty of Modern Agricultural Engineering , Kunming University of Science and Technology , Kunming , Yunnan 650224 , China)
Abstract:High frequency plant-let regeneration system were established in leaf culture of lisianthus(Eustoma grandi f lo-
rum), obtaining aseptic plant by means of aseptic seeding and using parts of the leaf as explants.Effect of different hor-
mone and its combination on callus inducement , adventitious shoot differentiation , multiplication , adventitious root for-
mation were studied.The results showed that MS basal medium supplemented with BA 0.1 ～ 0.5 mg/L+NAA 0.05
mg/ L was suitable for callus inducement and adventitious shoot differentiation;MS+6-BA 0.1 mg/ L+NAA 0.02 ～ 0.
05 mg/ L was suitable for sub-multiplication;1/2MS +IBA 0.5 ～ 1.0 mg/ L w as suitable for adventitious root formation.
Keywords:Eustoma grandi forum;Aseptic seeding;Plant-let regeneration;Hormone
50